Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Всего горы Published: October 10, 2011 doi: 10.3791/2797
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics, University of Georgia

Summary

Вся эта гора

Abstract

Всего крепления в гибридизация является очень информативным подходом для определения моделей экспрессии генов в эмбрионах. На месте процедуры гибридизации длительным и технически сложных с несколькими важными шагами, которые в совокупности способствуют повышению качества конечного результата. Этот протокол подробно описывает несколько ключевых контроля качества шаги для оптимизации маркировки зонда и производительности. Целом, наш протокол содержит подробное описание критических шагов, необходимых для воспроизводимо получать высококачественные результаты. Во-первых, мы описываем поколения digoxygenin (DIG) меченых зондов РНК в пробирке с помощью транскрипции ДНК шаблонов генерируется с помощью ПЦР. Мы описываем три критические анализы контроля качества, чтобы определить количество, целостность и удельной активности DIG-меченых зондов. Эти шаги являются важными для создания зонда достаточной чувствительностью для обнаружения эндогенных мРНК в целом эмбриона мыши.Кроме того, мы опишем методы фиксации и хранения E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши в гибридизация. Затем мы описываем подробные описания методов для ограниченного протеиназы К переваривания регидратации эмбрионов следуют подробности условий гибридизации, пост-гибридизации моет и РНКазы обработку для удаления неспецифических зонда гибридизации. AP-конъюгированных антител используется для визуализации меченых зондов и выявить паттерн экспрессии эндогенного стенограммы. Представитель результаты показаны от успешных экспериментов и типичные оптимальным экспериментов.

Protocol

1. Riboprobe поколения в пробирке с помощью транскрипции

  1. Подготовка продуктов ПЦР для шаблонов в пробирке транскрипции.
    1. Проектирование ПЦР-праймеров с фагом транскрипции промотора последовательности в их концах 5 '.
      Примечание: последовательность промотора добавляют к 5'-смысл-нить праймер PCR будет использоваться для расшифровки смысла зонда, а последовательность промотора добавляют к 5'-праймера ПЦР антисмысловых будет использоваться для синтеза антисмысловой зонд 1-3. Мы не обнаружили никакой разницы в эффективности между транскрипцией шаблонов, которые содержат только основные последовательности промотора против шаблонов, которые содержат промотор, основной плюс дополнительные 5 'последовательности. Этот метод был использован с Т3, Т7 и SP6 промоторов фага.
      Последовательностей, которые являются высоко консервативными среди гена членов семьи или высоко повторяющихся последовательностей следует избегать, поскольку они могут привести к неспецифической гибридизации и therebУ фоне увеличения окрашивания. Зонды с высоким содержанием GC будет иметь ограниченный дигоксигенином rUTP регистрации и последовательности ДНК шаблон серий T остатков будет ограничивать включение DIG-UTP из-за стерических помех между дигоксигенин молекул. Длина зонда может варьироваться от 300bp в 1kb. Но пока выше критериям, как правило, больше зонды имеют более высокую конкретных мероприятий.
    2. Шаблон для ПЦР могут быть плазмиды клона, геномный клон или геномной ДНК. Обычно мы покупаем полнометражный EST клонов (например, АТСС или открытого Biosystems) для использования в качестве шаблонов ПЦР. Усиление матричной ДНК с использованием стандартных процедур ПЦР для получения ПЦР-продукта, содержащего промотор последовательности. Чтобы сделать достаточно шаблоны зонд для поддержки нескольких зондов реакции синтеза обычно мы создали 8 х 50 мкл ПЦР. Реакции объединены для следующего шага. Вообще нескольких крупных ПЦР объема или несколько небольших реакций (например, 50 мкл реакции мы используем)повторно достаточно, чтобы генерировать достаточно шаблон для нескольких реакций синтеза зонда.
    3. Для удаления загрязняющих белков, особенно следы РНКазы в плазмиду препаратов, переварить каждый 100 мкл ПЦР-реакции с 1 мкл из 20mg/ml протеиназы К при 55 ° С в течение не менее 30 минут. Все реагенты и другие предметы, используемые после этого пищеварение протеиназы К должна быть РНКазы свободной и специально предназначены для работы РНК.
    4. Во время переваривания протеиназы К, запустить образец ПЦР на гель, чтобы проверить целостность продукта ПЦР. Мы используем гель акриламида мини разрешить меньше продуктов ПЦР (менее 600-700 б.п.) и агарозном гелях для решения больших продуктов ПЦР (> 600-700 б.п.) для анализа качества управления. Если вы видите несколько полос на геле, мы рекомендуем оптимизации ПЦР-реакции, так что вы получаете один продукт ПЦР правильный размер.
    5. Тщательно извлечь протеиназы К переваривается ПЦР с одной равный объем фенола / хлороформа (1:1) микстЮр, а затем добычу с одним равным объемом хлороформа. Смешайте на каждом шагу встряхиванием трубки, по крайней мере, 30 секунд. Эти шаги должны быть выполнены в химическом вытяжном шкафу.
    6. Осадок очищенного продукта ПЦР с добавлением 0,1 объема 3М ацетата натрия и 2 объемов на 100% этанола. Оставьте в -20 ° C в течение не менее 30 минут.
    7. Побочные в течение 5 минут при 13000 оборотов в минуту в микроцентрифуге, удалите супернатант и промывают 70% этанолом. Разрешить осадок ДНК полностью высохнуть.
    8. Ресуспендируют ДНК в подходящем объеме (например, 50 мкл) 1xTE. Измерение концентрации ДНК использовании флуорометре.
    9. Определите последовательность нуклеотидов каждый подготовки ПЦР-шаблон с использованием праймеров, которые соответствуют последовательностям промотора фага или внутренней последовательности в течение зонда. Это очень важный шаг контроль качества, что гарантирует, что зонд шаблон правильной последовательности.
    10. ДНК готов служить в качестве шаблона для стенограмму в пробиркеион. Хранить ДНК-матрицы при 4 ° C.
  2. в пробирке транскрипции с использованием ПЦР-продукта в качестве шаблона.
    1. Настройка реакции транскрипции РНК в конечном объеме 50 мкл. Транскрипции реакции включает в себя 500 - 1000 нг ДНК-матрицы, 5 мкл 10X буфера транскрипции (с 100 мм DTT), 10 мкл 2,5 DIG-NTP смеси, 3μl (50 ~ 90 единиц) РНК-полимеразы, 1 мкл Альфа-32 P CTP (до до 6 месяцев), а остальная часть объема составляют, добавив диэтилпирокарбонатом очищенной воды. 2,5 DIG-NTP смеси, как правило, составлен по состоянию на 40 мкл рабочего семенного материала, содержащего 10 мкл 10 мМ CTP, 10 мкл 10 мМ GTP, 10 мкл 10 мМ АТФ, 10 мМ 6.5μl UTP, 3.5μl 10 мМ дигоксигенин-11 UTP. При сборке транскрипции реакции, убедитесь, что все компоненты реакции (за исключением фермента) нагреваются до комнатной температуры. Смешайте ДНК и воду, а затем добавить реакционного буфера, перемешать, а затем добавить остальные компонентыВ противном случае спермидин в транскрипции буфер осаждения ДНК. Выдержите в течение 2 часов при температуре, рекомендованной для РНК-полимераза используется.
      Примечание: α-32 P добавляют к реакции, которая позволяет определить долю исходной нуклеотидной бассейна, которые включены в зонд РНК. Это является важным показателем эффективности реакции. Все следующие шаги следуют процедуры обработки 32 P.
      Альтернативный метод для измерения количества РНК, синтезированных зондов является использование небольшой спектрофотометр объеме. Это позволяет избежать использования 32 маркировка P (см. примечания в пункте 1.3.1)
    2. За последние несколько минут инкубации подготовить быстрого Колонка Spin (Roche) в соответствии с инструкциями производителя.
    3. После инкубации добавляют 1 мкл РНКазы бесплатно ДНКазы I и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин.
    4. Развести до 100 мкл с 50 мкл реакционного буфера разбавления (20 мМ TrisрН 7,5, 1% SDS, 20 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl (РНКазы свободной, чтобы 50мл акции и хранить при комнатной температуре)). Возьмите 1 мкл (как правило, в 4μl из 1x TE) для сцинтилляционного подсчета общего, начиная рассчитывает и для геля анализа.
    5. Применить остальные реакции на центр кровати колонки и спина при 1100 X г в течение 4 мин в настольной центрифуге клинические. После того, как ваша спина РНК-зонд находится в коллекции трубки.
    6. Добавить 2-х томах 100% этанола в Элюированную реакции. Все хорошо перемешать и держать на льду в течение 5 минут (или в -20 ° C или 30 мин).
    7. Спиновые трубки в микроцентрифуге на максимальных оборотах в течение 5 минут для осаждения РНК-зонда.
    8. Полностью удалить супернатант с помощью пипетки и пусть гранул сухого воздуха. Не позволяйте гранулы чрезмерно сухой, потому что это будет очень трудно распустить.
    9. Растворите РНК-зонд с 50 мкл - 100 мкл 1xTE или DEPC-H 2 O. Возьмите 1 мкл пробы для определения процента регистрации и для анализа на DENATтором акриламида гель. Настройте зонд концентрации до 100 нг / мкл в соответствии с предполагаемой доходности.
    10. Пробы, которые прошли все три элемента управления качеством может быть затем сохраняется в -20 ° C в течение 6 до 12 месяцев. Мы обычно исчерпывают зонд складе в течение 12 месяцев. Вполне вероятно, что зонды могут храниться в течение очень длительного периода при-20С.
  3. Оценка качества riboprobe - измерительный выход зонда.
    1. Для оценки зонд выход, разделить счета восстановился после спина колонке графы в реакцию, прежде чем спина колонки (измеряется с помощью проб, взятых в протоколе синтеза зонд). Для этой реакции, 100% включение = 33 мкг. Успешное реакции обычно дает 15-50% урожая. Зонды с менее чем 15% включения (<5 мкг выход) не должны использоваться.
      Примечание: альтернативный метод измерения зонд выход заключается в использовании небольшого объема или спектрофотометр флуорометренепосредственно измерить количество РНК представляют спина после колоночной хроматографии. Этот альтернативный подход позволяет избежать использования 32 маркировка следа P. Мы измерили концентрацию riboprobe использованием BioTek Epoch Микропланшетный спектрофотометр. Сравнение значений, полученных из спектрофотометр для оценки riboprobe массой от 32 Включение P показало, что оба метода дают сопоставимые результаты с помощью аналогичного небольшого объема (2 мкл) образца от окончательной подготовки зонда.
      Почти всегда очень низким или нулевым выходом связано с РНКазы загрязнения, происходящих из плазмидной использоваться в качестве шаблона для ПЦР. Будьте уверены, чтобы лечить плазмидной ДНК и ПЦР-продукта с протеиназы К, как описано в пункте 1.1.3.
  4. Оценка качества riboprobe - измерения удельной активности.
    1. Для измерения степени дигоксигенин - UTP включения выполнять выборочная проверка. Это крюсоциальной тестового контроля качества.
      Отрегулируйте датчик концентрации до 100 нг / мкл. Spot 1 мкл серийных разведений (10 -2 до 10 -5) зонда на 82мм диаметр Hybond-N + (GE Healthcare) или другим эквивалентным фильтром нейлона. Включите немеченого образца ДНК в качестве отрицательного контроля. Crosslink влажный фильтр сразу в УФ сшивателя на 125mJoules или в соответствии с инструкцией завода-изготовителя для нейлоновый фильтр вы используете.
      Все следующие шаги (1.4.2 - 1.4.6) выполняется в чашке Петри на качающейся платформе при комнатной температуре. Вам не придется беспокоиться о РНКазы после кровянистые выделения зонд разведения на фильтр
    2. Блок фильтра в течение 30 минут при комнатной температуре в 10 мл 1% блокирующий реагент (Roche) в 1X TN (TN 10X буфера = 1M Трис рН 7,5, 1,5 М NaCl)
    3. Вымойте 1 X 15 мин в 10 мл буфера 1X TN.
    4. Инкубируйте с анти фрагмента Fab дигоксигенин на 1/5000 разведения в 1X TN буфера в течение 30 минут. </ Li>
    5. Промойте 2 X 15 мин в 10 мл буфера 1X TN.
    6. Цвет реакция проводится с Б. фиолетовый подложки (нужно около 5 мл в чашке). Цвет должен быть виден на месте от 10 -4 разведения в 30 минут. В тот момент, остановить цветную реакцию промывкой 2 раза по 5 минут каждый с 5-кратным TE. Если сигнал не отображается в месте, которое соответствует 10 -4 разведения, то зонд должен быть отброшен.
      Примечание: По нашему опыту, недостаточная удельная активность можно найти только с коротких зондов. Увеличение размера зонда шаблон (до 1 Кб) при соблюдении других критериев дизайна, указанные в настоящем протоколе должно увеличить удельную активность зонда. С низкой удельной активностью приводит к низкой или неопределяемых уровней сигнала.
  5. Проверьте целостность датчика с помощью электрофореза 5% денатурирующих акриламида гель.
    Это еще один важный пробирного контроля качества.Этот протокол предполагает, что зонд был помечен 32 P ходе реакции синтеза (см. п. 1.2.1). Мы используем денатурирующих акриламида гель обеспечивает очень высокое разрешение, что позволяет легко обнаружить деградировали или неполной зондов. Обычно 5% денатурирующих акриламида MiniGel (7,5 г мочевины, 1.9ml 40% акриламида, 1.9ml 2% бис-акриламид (или использовать 20:1, акриламид: бис-акриламида решений), 1,5 10X гель MOPS буфера (0,2 М morpholinopropanesulfonic кислота, рН 7,0, 50 мМ ацетата натрия 5 мМ EDTA) и H 2 O до конечного объема 15 мл) очень хорошо работает для решения зондов в размере диапазонов, используемых в этом протоколе.
    Примечание: В качестве альтернативы, КЭ-мочевины сборных гелях можно приобрести у различных поставщиков. Следуйте инструкциям производителя для работы сборных гелях.
    1. Смешать образца с равным объемом буфера Загрузка Гель (Ambion) и хорошо перемешать.
    2. Нагреть до 95 ° C в течение 5 минут для денатурации любой вторичной структуры.
    3. Immediately прохладно на льду перед загрузкой на гель для предотвращения повторного отжига.
    4. Выполнить до и после колонки образцов вместе 200В до синего красителя бежит к концу геля. Гель работать в 1X буфере геля MOPS.
    5. Оберните гель в полиэтиленовой пленкой и держите его на рентгеновской пленке или фосфором экране тепловизора для обнаружения меченых РНК. Если 32 P маркировка не используется, вы можете окрашивать гель с обычного флуоресцентного красителя для выявления РНК
    6. Успешный синтез зонда может привести к РНК-зондов, который мигрирует в виде резкого группа очень близка к верхней части геля.

2. Сбор и хранение эмбрионов мыши

  1. Мышь эмбрионы должны быть собраны в ледяной PBST (PBS + 0,1% Tween 20, (диэтилпирокарбонатом (DEPC) обрабатывают)) и держали на льду во время вскрытия.
  2. Эмбрионы обрабатываются в 4 мл винт крышками стеклянных флаконах. Несколько эмбрионов может быть установлен в одном флаконе. Целых 10 до 15 E9.5или 5 E10.5 эмбрионов может быть зафиксирована в одном флаконе. В связи с увеличением размера эмбриона, E11.5 эмбрионов должно быть hemisected с лезвием до фиксации, чтобы помочь в Зонд доступа во время гибридизации. До 3 hemisected E11.5 эмбрионов могут быть размещены в одном флаконе.
  3. Для достижения максимальной эффективности шагов в этом протоколе и, чтобы уменьшить повреждения эмбрионов, эмбрионов фиксации и все моет осуществляется в образце флаконы с растворами заполнен до нижнего уровня флаконе шею так, что лишь небольшой пузырек воздуха остается, если иное не указано. Для всех промывания флаконы легла на их стороне на качалке платформы.
  4. Исправить в течение 6 часов в течение ночи при 4 ° С на качалке стол с 4% параформальдегида (PFA) в PBST. Пробирки должны быть расположены горизонтально и качался на качалке платформы при 4 ° C.
  5. После фиксации эмбрионы промывают два раза по 5 минут каждый в PBST на льду, а затем обезвоженный постепенно через метанол / PBST ряд (25% метанола в PBST, 50% метанола в PBST и 75% метанола в PBST) в 100% метаноле заменив решений во флаконе с использованием стекла Пипетки Пастера. Эмбрионы могут храниться при температуре-20С в 100% метаноле в течение 8 месяцев и, возможно, дольше.

3. Гибридизация дигоксигенин меченого зонда в целом эмбрионов мышей

  1. Прокол сердца и главы E10.5 и старше эмбрионов с микродиссекции ножом в то время как эмбрионы все еще находятся в метаноле (если это не было сделано во время вскрытия). Этот простой шаг позволяет мыть решения проникать в мозг пузырьки и камер сердца тем самым значительно уменьшая фоне окрашивания.
  2. Увлажняет эмбрионов последовательными промывками в метанол / PBST серии (75% метанола в PBST, 50% метанола в PBST, а затем 25% метанола в PBST) в течение 5-10 минут на каждую концентрации метанола. Мыть два раза в течение 5 минут каждого мытья в 100% PBST.
  3. Инкубируйте в 4:01 PBST: 30% H 2 O 2в течение 1 часа на льду. Затем промыть водой с 3 изменения 5 минут в каждом PBST 1X.
  4. Удалить последней промывки PBST и заменить 1 мл 10 мкг / мл протеиназы К в PBST. Во время переваривания протеиназы К месту трубы вертикально в стойку в 25 ° С водяной бане.
    Примечание: Решения протеиназы К теряют активность с течением времени из-за самостоятельного пищеварения. Для обеспечения максимальной и последовательной деятельности протеиназы К решению должны быть свежими непосредственно перед каждым использованием. Для каждого использования делают небольшое количество 1mg/ml складе развести его. Инкубационный период должны быть определены для каждой партии порошка протеиназы К и для каждого эмбриона возрастом. Например, для эмбрионов E9.5 хорошее время, обычно 10-15 мин при 25 ° C, а для E10.5 это обычно 20-30 мин при 25 ° C. Инкубационный протеиназы К время также должно быть точно измерено в ходе экспериментов, чтобы за действительное сравнение между флаконы и между экспериментами. Температура должна быть тщательно поддерживается во время пищеварения увеличить    воспроизводимость. Различия как малые, как 1 ° C может изменять количество пищеварение между экспериментами. Настоятельно рекомендуется, чтобы протеиназы К пищеварения быть сделано в инкубаторе или водяную баню для точного контроля температуры. Этот шаг имеет решающее значение для зонда позволяет проникать в ткани тем самым создавая сильный сигнал. Тем не менее, по-пищеварение может привести к повреждению эмбрионов, и они будут постепенно распадаются в течение оставшихся шагов.
  5. Остановить пищеварения протеиназы К промывкой дважды по 5 минут каждая стирка при комнатной температуре с недавно сделанным 2 мг / мл глицина в PBST. Затем промыть дважды по 5 минут каждый в PBST.
  6. Исправить переваривается эмбрионов в течение 20 минут при комнатной температуре в 4% PFA / PBST, 0,2% gluteraldehyde (Polysciences). Не более или underfix. Промыть 3 раза по 5 минут каждый в PBST.
  7. На данный момент, эмбрионы должны быть разделены на группы для гибридизации. Снимите PBST. Добавить 1 мл буфера гибридизации (50% ииrapure формамид (Invitrogen), 5x SSC, рН 5, 1% SDS, 50 мкг / мл гепарина (Acros), 50 мкг / мл Torula РНК (Sigma)), которая была нагревали до 65 ° C (без зонда). Разрешить эмбрионов для урегулирования, а затем удалить все hybrization буфера и заменить 1 мл свежего буфера нагретых гибридизации без зонда.
  8. Prehybridize течение 1 часа при 65 ° C в дрожащей водяной бане или в духовке на качающейся платформе (например Выпекать печь Шейк Boekle 'N', см. таблицу 1). Если вы инкубировать пробирки в водяную баню быть уверены, вода поднимается, но не более, вершины флаконах. Гибридизации температуры может быть увеличен до 70 ° C. Гибридизация температуре выше 65 ° C не влияет на интенсивность сигнала и фона с самым зондов мы проверили. Эмбрионы становятся полупрозрачными, липкая, и хрупкая в формамиде буферы (например гибридизации буфер) быть осторожными при обращении с ними.
  9. Замените буфер предварительной гибридизации с 0,4 мл буфера гибридизации содержащий зонд наКонцентрация 0.25-1 мкг / мл. Используйте 0,5 мкг / мл пробы для эмбрионов вплоть до E8.5. Для более старых эмбрионов, зонды следует титровать от 1-0,1 мкг / мл для определения оптимальной концентрации для хорошего сигнала с низким уровнем фона (обычно 0.25-0.5 мкг / мл или около того). Обратите внимание, что большие объемы гибридизации могут быть необходимы для большей эмбрионов. Гибридизации в течение ночи при 65 ° C.
  10. Если эмбрионы были более обрабатывали протеиназой K. они появятся очень прозрачная. Они также могут прилипать к сторонам флаконе, или развалится. Эмбрионы, которые появляются таким образом, должны быть отброшены в этот момент в протокол. Обработка их в дальнейшем не приведет к интерпретации данных.
  11. Заменить гибридизации буфер с подогретой Решение I (50% формамид, 5x SSC рН 5, 1% SDS) при 70 ° C. Мыть два раза в течение 30 минут каждого мытья для E8.5 эмбрионов, три раза в течение 30 минут на мытье для E9.5 и старше.
  12. Мыть один раз подогретого 50% раствора I: 50% раствор II (0,5М NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1% Tween 20) при 70 ° С в течение 10 минут.
  13. Вымойте три раза в течение 5 минут на мытье с Solution II при комнатной температуре.
  14. Замените буфер Solution II содержащей РНКазы 100 мкг / мл, РНКазы T1 100 ед / мл. Выдержите на качалке в теплой комнате при 37 ° в два раза по 30 минут в стирке. Мыть РНКазы чрезвычайно важно для снижения фона в результате неспецифически гибридизовали зондов.
  15. Стирать в Solution III (50% формамид, 2x SSC рН 5) при 65 ° C в два раза в течение 30 минут каждого мытья для E8.5, 3 раза по 30 минут на мытье для E9.5 и старше.
  16. Промыть 3 раза по 5 минут на мытье с 1X TBST (100 мл 10X TBS содержится 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 12,5 мл 2М трис-HCl рН 7,6 в воду. Чтобы 1X TBST разбавить в 10 раз TBS в соответствующем объеме воды и добавить твин-20 до 0,1% конечной концентрации)
  17. Если не указано иное, все моет выполняются в образце флаконы с растворами заполнен до нижнего уровняФлакон шею. Для всех промывания, флаконы легла на их стороне на качалке платформы.

4. Антитела обнаружения digoxygenin меченым зондом

  1. Эмбрионы предварительно их в 0,5 мл 1X TBST + 10% тепловой обработке овец сыворотки. Тогда рок флаконы вертикально при комнатной температуре (~ 20 ° C) в течение не менее 2,5 часов.
  2. Заменить блокирующего раствора со свежим 1X TBST + 10% сыворотки, содержащей 1:2000 - 1:5000 разведение щелочной фосфатазы конъюгированных овец анти-дигоксигенин Fab фрагментов (вычитается путем инкубации эмбриона с порошком ацетон, см. ниже). Используйте более высокие разведения для E9.5 эмбрионов и старше, вплоть до 1:5000, чтобы минимизировать фон. Инкубируйте вертикально на рокер при 4 ° С в течение ночи.
    Примечание: Мы обнаружили, что инкубационный анти-дигоксигенин Fab фрагментов с порошком ацетона эмбрионов снижает уровень фонового окрашивания в этом протоколе. Для приготовления порошка эмбриона ацетона гомогенизации объединенных E12.5-14.5 мыши EMBRйо в минимальном объеме PBS. Добавить 4 объема ледяной ацетон, перемешать и инкубировать на льду в течение 30 минут. Удалить супернатант центрифугированием при 10000 х г в течение 10 минут. Вымойте гранул с ледяной ацетон и спина снова. Распространение осадок, и растереть в порошок на лист фильтровальной бумаги и дайте ему высохнуть на воздухе. Порошок можно хранить в герметичной трубке при 4 ° C в течение многих лет.
    Для антитела, вычитание, антитела должны быть предварительно поглощается в порошок ацетона эмбрионов для уменьшения неспецифического связывания во время или перед предварительного блокирования. Инкубируйте антитело при 1/100 с небольшим количеством эмбрионов порошка (сумма не является критичной) в 1xTBST/10% сыворотки, по крайней мере 1 час при 4 ° С с качалки. Удалите порошок, крутя в микроцентрифуге в течение 10 минут при 4 ° C. Неучитываемые антитела можно хранить при температуре 4 ° C в течение по крайней мере 6 месяцев.
  3. Вымойте три раза по 5 минут каждая с TBST 1X, затем 5-6 раза в течение 1 часа каждый при комнатной температуре, чтобы удалить избыток антител. Если рговорится, сделать расширенную ночь стирка при температуре 4 ° С для уменьшения фона. Ночь стирки может значительно уменьшить фоновые уровни таким образом, увеличивая соотношение сигнал-шум.
  4. Мыть два раза в течение 20 минут на мытье с недавно сделанным щелочной фосфатазы буфера (100 мМ Трис, рН 9,5, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween 20. Добавить 0.5mg/ml левамизол, эндогенного ингибитора AP, для E9.5 и старше эмбрионы).
  5. Заменить последний промыть BM Фиолетовый AP подложки (Roche), предварительно нагретой до комнатной температуры.
  6. Разрешить цветной реакции для инкубации при комнатной температуре, и следить за сигналом периодически через рассекает микроскопом. Для длительного реакции цвет (от нескольких часов до ночи) флаконы должны быть защищены от света. Сигнал для обильного мРНК должна быть видна в течение 15 минут. Реакция должна быть прекращена, когда вы удовлетворены сигнала, или когда фон начинает быть проблемой. Если решение сам начинает становится темно можно расширить сOlor реакции, заменив раствор субстрата.
  7. Остановите реакцию стиральная дважды по 5 минут на мытье в 1X PBST/5mM EDTA.
  8. Переезд в 4% параформальдегид / PBST повторно установить, от нескольких часов до ночи. Или эмбрионы могут храниться в 4% paraformaldehyde/1X PBST в течение многих лет или может быть сразу обработаны для резки. Это последний шаг фиксации имеет решающее значение для долгосрочного сохранения окрашивания узор.

5. Парафин вложения и секционирования из цветного эмбрионов

  1. Перед эмбрионов зафиксированы после цветных реакций (шаг 4,8) фотографии все крепления окрашенных эмбрионов осторожность при окрашивании уровень находится на желаемой интенсивности. После документирования паттерны экспрессии в целом эмбрионов они инкубируют в BM фиолетовой подложке ночи до 24 часов при комнатной температуре, пока весь эмбрион становится темно-синим. Этот шаг для того, чтобы окрашивание будет достаточно темным, чтобы показать в горазделах электронной ткани. Обратите внимание, что синий цвет зародыша связано с отложением очень тонкий слой пигмента по всей поверхности эмбриона. На этом фоне окрашивание не обнаруживается в тканях после перерезки интерес.
  2. Вымойте окрашенных эмбрионов с PBS три раза, чтобы удалить избыток субстрата осадков и закрепить на ночь в 4% PFA при 4 ° C.
  3. Промыть PBS три раза, а затем обезвоживают эмбрионов в 100% метаноле (как описано в 2,4).
  4. Заменить последний метанола с ксилолом. Стирать в ксилоле 2 до 3 раз в течение 2 мин каждой стирки, пока эмбрионы станет ясно. Не более мыться в ксилоле, так как это сделает ткани очень хрупкие после того, как он встроен что делает его очень трудно восстановить нетронутыми разделов. Визуально контролировать каждый ксилол инкубации чтобы убедиться, что эмбрионы просто смысл быть четкими и быть очень осторожными, чтобы не допустить ксилол инкубации выходить за рамки этой точке.
  5. Трансфер эмбрионов (E10.5 и старше) В биопсии Sure-Tek кассет (Fisherbrand), и инкубировать все кассеты в воск (Fisherbrand) в течение 15 ~ 30 минут при 65 ° C. Изменения в свежий воск еще на 15 ~ 30 минут, а затем снова измениться. Меньшие эмбрионов / тканей стволов требует меньше времени воск инкубации. E9.5 эмбрионов могут быть помещены в формах ткани вложение для всех воском изменения. В тех случаях, вы можете удалить воск из формы вместо передачи эмбрионов.
  6. После трех воск изменения, передача эмбрионов в ткани вложение форм (Polysciences) и вставлять со свежим воском. Аккуратно поместите эмбрионы для нужной плоскости срезов. Пусть воском, чтобы охладиться, пока затвердеет.
  7. Раздел воск блоков в 8 ~ 14 мкм ломтики с использованием стандартных микротома (например, Leica RM2155). Сбор разделов на предметных стеклах (Fisherbrand).
  8. Пусть слайды лежали ровной и сухой на slidewarmer. Слайды можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев.
  9. Сушеные разделы депарафинированных двумя 5 мин Ксиленэлектронной моет и регидратации в воду по серийному метанол / вода моет (100% метанола 2 мин, 100% метанола, 2 мин, 90% метанола / воды 2 минуты, 70% метанола / воды 2 минуты, деионизированной воде 5 мин).
  10. Пятно на участках с быстрым ядерным красного (Sigma) красящим раствором в течение 1 минуты. Для создания ядерной быстрой красной красящий раствор, развести концентрированный запаса ядерного быстрый красные (0,1% ядерными быстрым красным в 5% сульфата алюминия в воде, растворяются с тепло-и фильтруют через бумажный фильтр Ватман) 1:5 в водный раствор 5 Сульфат% алюминия. После окрашивания мыть стекла с проточной водой, пока вода не станет ясно. Ядерные быстрой красной действует как контрастирующая и показывает общую структуру ткани в секциях. Его цвет контрастирует с фиолетово-синей окраски, которая отмечает локализации зонда РНК. Ядерная быстрый красный насыщения пятна и интенсивность окрашивания контролируется концентрация окрашивание раствора. Если интенсивность ядерных быстрым красным окрашиваниемявляется недостаточным при использовании этого окрашивания решение, которое вы можете повторить этот шаг с более концентрированным ядерной быстрый красный раствор.
  11. Подготовьте слайды для монтажа на покровные моет в каждом из решений в следующих серий: 90% метанола / воды, затем 2 промывками в 100% метанола, затем 2 промывками в ксилолы. Инкубировать слайд в течение 2 минут в каждой из стирок.
  12. Установите слайды с Cytoseal 60 монтаж среды (Richard-Allan Scientific). Обратите внимание, что водный монтаж средств массовой информации будет растворяться ядерной быстрый красное пятно.
    Примечание: мы также использовали пластик вложения (иммуно-кровать, Polysciences Inc) для создания разделов окрашенных эмбрионов с отличными результатами 4.

6. Представитель Результаты:

На рисунке 1 показано представитель результаты, полученные с помощью этого протокола. Рисунок 1А показывает паттерн экспрессии Gata3 у эмбрионов E10.5 мыши. Эта панель показывает хорошую гesult с высокой сигнала к фону. Рисунок 1С, напротив, показывает, удалось в гибридизация для Gata3 мРНК, которые использовались частично деградированных РНК-зонда. Низкой удельной активностью зонд приведет к аналогичным результатам с низким уровнем сигнала на фоне контраста. Сравнение панелей и C иллюстрирует важность выполнять тщательный контроль качества оценки зонд качества для обеспечения высокого качества результатов. Результаты, полученные с зонда Foxg1 (рис. 1б) также показывает хороший результат с конкретной окрашивание в конечном мозге с низким уровнем фона в других частях мозга. Мозг и сердце являются общими сайтов фоне окраски, вызванное захватом зонда. Puncturing мозга и сердца с помощью пинцета позволяет мыть решения в зародыше и минимизирует окрашивание фона (см. п. 3.1). Рисунок 1D иллюстрирует типичную светло-голубой фон найден, когда мозг не проколоты. Это показывает, оптимальным результатом, полученным с помощью зонда Pax1. Pax1 не выражено в любой части мозга, и все окрашивание видели в мозг этом эмбрион в связи с неспецифическими фоне.

Рисунок 1
Рисунок 1. Представитель результаты, показывающие примеры успешных (A, B) и оптимальным (C, D) результаты. A. E10.5 эмбрионов гибридизовали с Gata3 зонда. B. E11.5 эмбрионов гибридизовали с Foxg1 зонда. C. E10. 5 эмбрионов гибридизовали с Gata3 зонд, который частично деградировали, показывая очень слабый сигнал, но высокий фон путем из целого эмбриона. D. E10.5 эмбрионов гибридизовали с Pax1 зонд без проколов головой, показывая, фоновое окрашивание в желудочки (наконечники стрел).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, описанные в этом протоколе были адаптированы из ряда различных источников и оптимизированы для целого крепления E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши. Методы целом крепления на месте гибридизации эмбрионов позвоночных впервые появился в начале 1990-х 2,5-12. Этот протокол был адаптирован в основном из методов, разработанных для эмбрионов Xenopus 7,8, а также мышь 2,11. В нашем протоколе большое внимание уделяется тщательной оценки качества зонда. Пристальное внимание к генерации высокого качества и высокой удельной активности РНК-зонда определяется по более ранней шаги в этом протоколе позволит значительно повысить качество данных и сэкономить значительное количество времени и усилий в долгосрочной перспективе. Наш протокол также включает в себя использование ПЦР ДНК-матриц для фага транскрипции РНК-полимеразой. Этот подход является очень быстрым и масштабируемым. Это может позволить поколение большого количества РНК-зонды лГ больших масштабах в гибридизация экранирует 13-15.

Некоторые шаги в этом протоколе должны быть рассмотрены, когда фон высокий, но сигнал слишком слабый. Одним из аспектов является зонда. Мы никогда не имели высокого фона с РНК-зондов, которые отвечают критериям проектирования, указанные в настоящем протоколе и которые прошли все три качества контрольных испытаний (выход удельной активности и длины зонда). Другим фактором, который может повлиять на фоне уровня является способность зонда проникнуть в эмбриональных тканях. Необходимо соблюдать осторожность во время вскрытия, чтобы полностью удалить внеэмбриональной мембран, которые покрывают эмбриона. Кроме того, пищеварения протеиназы К шаг является абсолютно необходимым для эмбрионы старше E9.5. Более протеиназы К раз пищеварения дают более низкие фона и сильного сигнала, однако, чрезмерная раз пищеварения может привести к увеличению повреждения тканей и может привести к распаду эмбриона во время процедуры. Optimizatионных пищеварением время для каждой партии протеиназы К, необходимого для получения наилучших результатов. Еще один шаг, который может быть оптимизирован для получения высокого сигнала к фону отношений является инкубации РНКазы (шаг 3,14). Наш протокол использует смесь РНКазы А и РНКазы T1. Оба фермента переварить одноцепочечной РНК, но каждый фермент имеет различную специфику базы. Сочетание этих двух ферментов приводит к обширным переваривания одноцепочечной РНК малого олигорибонуклеотидов. Это позволяет большую часть неспецифически гибридизовали зонда должны быть удалены после гибридизации моется в результате значительного уменьшения фона окрашивания. Использование РНКазы T1 или только приводит к увеличению фона и его следует избегать. Мы также обнаружили, что качество конечной реакции цвет улучшена с помощью свежего буфера AP, сделанные непосредственно перед использованием.

Наш протокол может быть адаптирован для старшего эмбрионов или взрослых тканей с дополнительной обработкой. Например, у нас есть такжеиспользовать этот протокол для выполнения на месте гибридизации на толстой (100 мкм) vibratome участков мозга взрослого мыши (данные не представлены). Мы также использовали этот протокол для изучения экспрессии генов в более ранних эмбрионов. В некоторых случаях используют этот протокол для визуализации экспрессии гена на поверхности E13.5 E14.5 и эмбрионов, таких как GAD1 выражение в фолликулах вибриссы 4. В других случаях мы использовали лезвия бритвы или скальпелем вырезать E12.5-E14.5 эмбрионов обеспечить зонд доступ к определенным тканям внутри эмбриона. Эмбрион фрагменты подготовлены таким образом, могут быть обработаны с использованием этого протокола с некоторыми изменениями. В этих случаях длина всех процедур и этапов промывки должна быть скорректирована в соответствии с тканью размер и оптимизирован эмпирически.

Наш протокол также включает в себя методы для пост-гибридизации срезов и анализа экспрессии. В сочетании с визуализацией целом гору экспрессия гена этого дополнительногоных шаг может добавить большое количество дополнительной информации о паттерн экспрессии генов. Мы встроенные эмбрионов после прохождения в гибридизация в парафин, а также в пластиковых смол 4,16. Разделы окрашенных эмбрионы могут быть использованы для создания трехмерной реконструкции экспрессии показал, вся гора на месте процедуры гибридизации. Мы использовали реконструкции программное обеспечение от SURFdriver программного обеспечения для этой цели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NIH R21MH082360 (BGC) и R01HD056315 (NRM), а также в Университете Джорджии.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Reagent Roche Group 11209256910
Ribonucleoside Triphosphate Set Reagent Roche Group 11277057001
Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification Supply Roche Group 11274015001
T7 RNA polymerase Reagent Roche Group 10881767001
SP6 RNA polymerase Reagent Roche Group 10810274001
T3 RNA polymerase Reagent Roche Group 11031163001
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi Reagent PerkinElmer, Inc. BLU008X250UC
DNase I recombinant, RNase-free Reagent Roche Group 4716728001
Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder Reagent Fisher Scientific BP169-500
Gel loading buffer Reagent Ambion AM8547
Hybond-N+, Amersham Supply GE Healthcare RPN82B
UV Stratalinker 2400 Equipment Stratagene, Agilent Technologies
Diethyl pyrocarbonate Reagent Sigma-Aldrich D5758-100ML
Heparin sodium Reagent Acros Organics 41121-0010
hydrogen peroxide 30% in water Reagent Fisher Scientific BP2633-500
Gluteraldehyde, 8% EM grade Reagent Polysciences, Inc. 0/710 Use with caution according to manufacture’s instructions
Blocking reagent Reagent Roche Group 11096176001 Make into 5% stock and store at -20° C
Proteinase K Reagent Roche Group 3115852001
Rnase A Reagent Roche Group 10109142001 Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C.
Rnase T1 Reagent Roche Group 10109193001
Ultrapure Formamide Reagent Invitrogen 15515-026
Levamisole hydrochloride Reagent ICN Biomedicals 155228
Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI Reagent Sigma-Aldrich R6625 phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C
Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. Reagent Roche Group 11 442 074 001
4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit Supply National Scientific Company B7800-2
Shake N Bake hybridization oven Equipment Boekel Scientific 136400
Biopsy Sure-Tek Supply Fisher Scientific 15-200-402C
Paraplast Plus tissue embedding medium Reagent Fisher Scientific 23-021-400
Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds Supply Polysciences, Inc. 18646A
Colorfrost Plus Microscope slides Supply Fisher Scientific 12-550-17
Nuclear Fast Red Reagent Sigma-Aldrich N8002
Cytoseal 60 Reagent Richard-Allan Scientific 8310-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
  2. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  3. Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
  4. Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
  5. Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
  6. Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
  7. Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
  8. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  9. Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
  10. Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
  11. Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
  12. Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
  13. Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  14. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
  15. Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
  16. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).

Tags

Биология развития выпуск 56 транскриптом, экспрессия генов транскрипты мРНК, riboprobe
Всего горы<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B.… More

Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (56), e2797, doi:10.3791/2797 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter