Summary
이 모든 마운트
Abstract
현장 하이브리드 화의 전체 마운트는 배아의 유전자 발현 패턴을 형성하기위한 매우 유익한 방법이다. 현장 하이브리드 절차에는 긴 있으며, 기술적으로 통칭 최종 결과의 질에 기여하는 여러 중요한 단계를 요구.이 프로토콜은 프로브 레이블과 성능을 최적화하기위한 세부 몇 가지 주요 품질 관리 단계에 대해 설명합니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다 필요한 중요한 단계 중 reproducibly 고품질의 결과를 얻을 수 있습니다. 첫째, 우리는 PCR에 의해 생성 된 DNA 템플릿의 체외 스크립트의를 통해 digoxygenin (파)이라는 RNA 프로브의 생성을 설명합니다. 우리는 양, 무결성 및 파 - 라벨 프로브의 특정 활동을 결정하는 세 가지 중요한 품질 관리 assays을 설명합니다. 이 단계는 전체 마우스 배아에서 내생 mRNAs를 감지하기에 충분한 감도의 프로브를 생성하기 위해 중요합니다.또한, 우리는 현장 하이브리드 화에 대한 E8.5 - E11.5 일 이전 마우스 배아의 고정 및 저장하는 방법을 설명합니다. 그런 다음, 우리는 하이브리드 조건, 사후 하이브리드 세차 및 비 특정 프로브 하이브 리다이 제이션을 제거하는 RNase 처리의 세부 정보가 rehydrated 배아의 제한 proteinase K는 소화에 대한 자세한 방법을 설명합니다. AP-복합 항체가 표시 프로브를 시각화하고 내생 성적표의 표현 패턴을 표시하는 데 사용됩니다. 대표 결과는 성공적인 실험과 일반 차선 실험에서 표시됩니다.
Protocol
1. 체외 스크립트에 통해 Riboprobe 생성
- 체외 스크립트 템플릿에 대한 PCR 제품을 준비합니다.
- 자신의 5 '끝에서 파지의 전사 프로모터 시퀀스와 디자인 PCR의 프리 머.
참고 : 발기인 순서는 의미 - 스트랜드 PCR 프라이머의 5'end하는 의미 프로브를 인식에 사용됩니다 추가하고 발기인 순서는 안티센스 PCR 프라이머의 5'end에 추가는 안티 - 감지 프로브를 합성에 사용됩니다 1-3. 우리는 핵심 프로모터 시퀀스 대 핵심 프로모터 플러스 추가 5 '시퀀스가 포함 된 템플릿을 포함하는 템플릿 사이의 전사 효율에 차이를 발견하지 않았습니다. 이 메소드는 T3, T7과 SP6 파지의 추구와 함께 사용되었습니다.
그들은 비 특정 하이브리드와 thereb 될 수 있기 때문에 매우 유전자 가족이나 높은 반복적 인 시퀀스를 사이에 보존 아르 시퀀스은 피해야합니다y는 배경 착색을 향상시킬 수 있습니다. 높은 GC의 콘텐츠와 프로브는 T 잔류의 실행이 digoxigenin 분자 사이의 steric 간섭에 의한 발굴 - UTP의 설립을 제한과 제한 digoxigenin-rUTP 설립 및 DNA 템플릿 시퀀스를해야합니다. 프로브 길이는 300bp에서 1킬로바이트로 다양 할 수 있습니다. 되지만 위의 조건이 충족 될 때, 보통 이상 프로브는 높은 특정 활동을 수 있습니다. - PCR을위한 템플릿은 플라스미드 복제, 게놈 복제 또는 게놈 DNA 할 수 있습니다. 일반적으로 우리는 PCR 템플릿으로 사용할 전체 길이 동부 표준시 클론을 (ATCC 또는 열기 Biosystems에서 등) 구입할 수 있습니다. 발기인 시퀀스를 포함하는 PCR 제품을 생산하기 위해 표준 PCR 절차를 사용하여 템플릿 DNA를 증폭. 충분한 프로브 템플릿은 우리가 일반적으로 8 X 50μl PCRs을 설정 몇 가지 프로브 합성 반응을 지원 할 수 있도록합니다. 반응은 다음 단계 풀링 된 수 있습니다. 일반적으로 몇 큰 볼륨 PCRs 이상 작은 반응 (예 : 우리가 사용하는 50μl 반응 등)여러 프로브 합성 반응에 충분한 템플릿을 생성하기에 충분한 재.
- 오염 단백질을 제거하려면 플라스미드 준비에 RNase 특히 흔적은 최소 30 분 동안 55 ° C에서 20mg/ml Proteinase K의 1μl와 PCR 반응의 각 100μl를 소화. 이 Proteinase K를 소화 한 후에 사용 된 모든 시약 및 기타 항목은 RNase 무료 특히 RNA 작업에 전념해야합니다.
- Proteinase K를 소화하는 동안 PCR 제품의 무결성을 확인하는 젤의 PCR 반응의 샘플을 실행합니다. 우리는 품질 관리 분석을위한 큰 PCR 제품을 (> 600-700 BP) 해결하기 위해 작은 PCR 제품 (이하 600-700 BP)와 아가로 오스 젤를 해결하기 위해 아크릴 아미드의 미니 젤을 사용합니다. 당신이 젤에 여러 밴드를 볼 경우, 우리는 당신이 올바른 크기의 단일 PCR 제품을 얻을 수 있도록 PCR 반응을 최적화하는 것이 좋습니다.
- 철저하게 (1:1) / 페놀 클로로포름 mixt 중 하나를 동일한 볼륨으로 PCR 반응을 소화 Proteinase K의 압축을 풉니 다우레는 클로로포름 중 하나를 동일한 볼륨 압축이 나타납니다. 최소 30 초 동안 튜브를 vortexing하여 각 단계에서 섞는다. 이 단계는 화학 퓸 배출 후드에서 수행되어야합니다.
- 3M의 아세트산 나트륨 및 100 % 에탄올 2 권의 0.1 볼륨을 추가하여 정화 PCR 제품을 침전. 최소 30 분 -20 ° C에 둡니다.
- microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 5 분 회전, 표면에 뜨는 제거하고 70 % 에탄올로 씻는다. DNA 펠렛가 완전히 건조하도록 허용합니다.
- 1xTE의 적절한 볼륨에서 Resuspend DNA (예 : 50μl). fluorometer를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
- 파지업자 시퀀스 또는 프로브 내의 내부 순서에 해당 프리 머를 사용하여 각 PCR 템플릿 사립의 염기 순서를 결정합니다. 이 프로브 템플릿이 올바른 순서입니다 보장합니다 중요한 품질 관리 단계입니다.
- DNA는 체외 증명서에 대한 템플릿으로 제공 할 준비가되어이온. 4 ° C.에 DNA 템플릿을 저장
- 자신의 5 '끝에서 파지의 전사 프로모터 시퀀스와 디자인 PCR의 프리 머.
- 템플릿으로 PCR 제품을 사용 체외 스크립트 인치
- 50μl의 최종 볼륨의 RNA의 전사 반응을 설정합니다. 전사 반응은 500 포함 - 10X 스크립트 버퍼의 5μl 템플릿 DNA 1000 NG (100mM DTT 포함), RNA의 효소의 10μl 2.5mM 발굴 - NTP 믹스, 3μl (50 ~ 90 단위)를 1μl 알파-32 P CTP (최대 6 개월) 및로 볼륨의 나머지 부분은 diethylpyrocarbonate 처리 된 물을 추가하여 구성되어 있습니다. 2.5mM 발굴 - NTP 믹스는 일반적으로 10μl 10mM CTP, 10μl 10mM GTP, 10μl 10mM ATP, 6.5μl 10mM UTP, 3.5μl 10mM digoxigenin-11 UTP를 포함하는 40μl 작업을 주식으로 구성되어 있습니다. 전사 반응을 조립에서 반응 구성 요소의 모든 (효소 제외) 실내 온도에 예열되어 있는지 확인하십시오. 먼저 DNA와 물을 혼합 한 후, 반응 버퍼, 믹스를 추가 한 다음 다른 구성 요소를 추가그렇지 않으면 전사 버퍼에 spermidine의 DNA를 침전 것입니다. 사용 된 RNA 중합 효소의 권장 온도에서 2 시간에 품다.
참고 : α-32 P는이 RNA 프로브에 통합되어 시작 염기 풀의 비율을 결정 할 수 있도록 반응에 추가됩니다. 이 반응의 효율성의 중요한 측정 한 것입니다. 다음 단계의 모든 32 P.를 처리하기위한 절차를 따르십시오
합성 RNA 프로브의 양을 측정하기위한 다른 방법은 작은 볼륨 분광 광도계를 사용하는 것입니다. 이 (단계 1.3.1에서 노트를 참조하십시오) 32 P 라벨의 사용을 방지 - 부화의 마지막 몇 분 동안, 제조업체의 지시에 따라 빠른 스핀 열 (로슈)를 준비합니다.
- 부화 후 10 분 동안 37 ° C에서 RNase 무료 DNase I 및 배양의 1μl를 추가합니다.
- 반응 희석 버퍼의 50μl를 100μl로 희석 (20mM 트리스pH7.5, 1 % SDS, 20mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 100mM NaCl (RNase 무료로 실온에서 50ml 주식 및 매장을)). 전체 시작 혐의 계산 섬광와 젤 분석을위한 1μl (보통 1X TE의 4μl에)보세요.
- 표 상단 임상 원심 분리기에서 4 분에 1100 X g에서 열 침대 스핀의 중심에 반응의 나머지 부분을 적용합니다. 스핀 후 RNA 프로브은 컬렉션 튜브에 있습니다.
- 용출 반응에 100 % 에탄올 2 볼륨을 추가합니다. 잘 섞은 후 5 분 (또는 -20 ° C 또는 30 분에)에 얼음 계속.
- 펠렛 RNA 프로브 5 분 최대 RPM에서 microcentrifuge에 관을 봐.
- 완전히 피펫으로 표면에 뜨는을 제거하고 펠릿 공기 건조 보자. 결국 그 분해하는 것은 매우 어려울 수 있기 때문에 펠렛 이상 건조하게하지 마십시오.
- 100 μl 1xTE 또는 DEPC-H 2 O. - RNA 50 μl와 프로브를 분해 denat에 %의 설립을 결정 및 분석을위한 1 μl 샘플을 채취아크릴 아미드 젤을 uring. 예상 수확량에 따라 100 NG / μl에 프로브 농도를 조정합니다.
- 세 품질 컨트롤을 통과 한 프로브는 이후 6 to12 개월 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 12 개월 이내에 프로브 주식을 고갈. 이 프로브는-20C에서 매우 오랜 기간 동안 저장 될 수 있다는 가능성이 높습니다.
- 50μl의 최종 볼륨의 RNA의 전사 반응을 설정합니다. 전사 반응은 500 포함 - 10X 스크립트 버퍼의 5μl 템플릿 DNA 1000 NG (100mM DTT 포함), RNA의 효소의 10μl 2.5mM 발굴 - NTP 믹스, 3μl (50 ~ 90 단위)를 1μl 알파-32 P CTP (최대 6 개월) 및로 볼륨의 나머지 부분은 diethylpyrocarbonate 처리 된 물을 추가하여 구성되어 있습니다. 2.5mM 발굴 - NTP 믹스는 일반적으로 10μl 10mM CTP, 10μl 10mM GTP, 10μl 10mM ATP, 6.5μl 10mM UTP, 3.5μl 10mM digoxigenin-11 UTP를 포함하는 40μl 작업을 주식으로 구성되어 있습니다. 전사 반응을 조립에서 반응 구성 요소의 모든 (효소 제외) 실내 온도에 예열되어 있는지 확인하십시오. 먼저 DNA와 물을 혼합 한 후, 반응 버퍼, 믹스를 추가 한 다음 다른 구성 요소를 추가그렇지 않으면 전사 버퍼에 spermidine의 DNA를 침전 것입니다. 사용 된 RNA 중합 효소의 권장 온도에서 2 시간에 품다.
- riboprobe의 품질 평가 - 측정 프로브 수율.
- 프로브 생산량을 추정하기 위해, 스핀 컬럼 (프로브 합성 프로토콜에서 촬영 샘플로 측정) 전에 반응의 개수에 의해 스핀 열 후 복구 카운트를 나눕니다. 이 반응에 대한 100 %의 설립 = 33 μg. 성공적인 반응은 일반적으로 15~50% 수율을 제공합니다. 미만 15 % 설립 (<5 μg 수율)과 프로브를 사용할 수 없습니다.
참고 : 프로브 수율을 측정하기위한 다른 방법은 작은 볼륨 분광 광도계 또는 fluorometer를 사용하는 것입니다직접 RNA의 양을 측정하는 것은 스핀 칼럼 크로마토 그래피 후 제시한다. 이 대체 방법은 32 P 추적 라벨의 사용을 방지합니다. 우리는 BioTek 획기적인 Microplate 분광 광도계를 사용하여 riboprobe 농도를 측정했습니다. 32 P의 설립에서 riboprobe 질량의 견적에 분광 광도계에서 얻은 값의 비교는 두 가지 방법이 최종 프로브 준비에서 유사한 작은 볼륨 (2 μl) 샘플을 사용하여 비교 결과를 보여 주었다.
거의 항상 매우 낮은 또는 전혀 수율은 PCR을위한 템플릿으로 사용되는 플라스미드 준비에서 발생하는 RNase 오염 때문입니다. 단계 1.1.3에 설명 된대로 proteinase K와 플라스미드 DNA와 PCR 제품을 취급해야합니다.
- 프로브 생산량을 추정하기 위해, 스핀 컬럼 (프로브 합성 프로토콜에서 촬영 샘플로 측정) 전에 반응의 개수에 의해 스핀 열 후 복구 카운트를 나눕니다. 이 반응에 대한 100 %의 설립 = 33 μg. 성공적인 반응은 일반적으로 15~50% 수율을 제공합니다. 미만 15 % 설립 (<5 μg 수율)과 프로브를 사용할 수 없습니다.
- riboprobe의 품질 평가 - 특정 활동을 측정.
- digoxigenin의 범위를 측정하려면 - UTP의 설립은 현장 테스트를 수행합니다. 이 CRU입니다cial 품질 관리 시험.
100 NG / μl에 프로브 농도를 조정합니다. Hybond-N + (GE 헬스 케어) 또는 기타 이에 상응하는 나일론 필터의 82mm 직경 진입 프로브의 시리얼 dilutions의 명소 1 μl (10 -2 10 -5). 대조군으로 레이블이 지정되지 않은 DNA 샘플을 포함합니다. Crosslink는 습기 125mJoules에서 UV crosslinker에 바로 필터 또는 사용하고있는 나일론 필터에 대한 제조업체의 지시에 따라.
다음 단계 (1.4.2 - 1.4.6)의 모든 실온에서 흔들 플랫폼에 페트리 접시에 수행됩니다. 당신은 필터에 프로브 dilutions을 찾는 한 후 RNase에 대해 걱정할 필요가 없습니다 - 1 % 차단의 10ml에 실온에서 30 분 동안 필터를 차단 1X TN (10X TN 버퍼가 = 1M 트리스 pH7.5, 1.5M NaCl)의 시약 (로슈)
- 1 X 10ml 1X TN 버퍼에 15 분을 씻는다.
- 30 분 1X TN 버퍼에 5,000분의 1 희석에 방지 digoxigenin의 팹 조각을 품다. </ 리>
- 2 X 10ml 1X TN 버퍼에 15 분을 씻는다.
- 색 반응은 BM 보라색 기판 (접시에 5ml에 대해 필요)로 수행됩니다. 색상은 30 분 10 -4 희석의 장소에 표시해야합니다. 그 시점에서 5 분 5 배 TE와 각각에 대해 2 번 세척하여 색상 반응을 중지합니다. 신호가 10 -4 희석에 해당하는 장소에 표시되지 않으면 다음 프로브 폐기해야합니다.
참고 : 우리의 경험에서 불충분 한 특정 활동이 짧은 프로브로 발견됩니다. 이 프로토콜에 지정된 다른 디자인 기준을 준수하면서 프로브 템플릿 (최대 1킬로바이트까지)의 크기를 늘리면 프로브의 특정 활동을 증가해야합니다. 낮은 특정 활동은 신호의 낮은 또는 탐지 수준으로 연결됩니다.
- digoxigenin의 범위를 측정하려면 - UTP의 설립은 현장 테스트를 수행합니다. 이 CRU입니다cial 품질 관리 시험.
- 5 % denaturing 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 통해 의한 프로브의 무결성을 테스트합니다.
이것은 또 다른 중요한 품질 관리 분석이다.이 프로토콜은 프로브가 (단계 1.2.1 참조) 합성 반응 중 32 P로 분류되었습니다 있다고 가정합니다. 우리는 쉽게 저하 또는 불완전한 프로브를 감지 할 수 있도록 매우 높은 해상도를 제공하는 아크릴 아미드 젤을 denaturing 사용합니다. 일반적으로 5 % denaturing 아크릴 아미드 minigel (7.5g의 요소, 1.9ml 40 % 아크릴 아미드, 1.9ml 2퍼센트 비스 - 아크릴 아미드 (또는 20시 1분 아크릴 아미드를 사용하십시오 비스 - 아크릴 아미드 솔루션을), 1.5ml 10X 걸레 젤 버퍼 (0.2 M morpholinopropanesulfonic 산, pH7.0, 50mM 나트륨 아세테이트 5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 15 ML의 최종 볼륨에 H 2 O)이 프로토콜에 사용 된 범위의 크기에 프로브를 해결하기위한 잘 작동합니다.
참고 : 대안으로, TBE-우레아 프리 캐스트 젤은 다양한 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다. 프리 캐스트 젤을 실행하기위한 제조업체의 지침을 따르십시오.- 젤 로딩 버퍼 (Ambion)의 동일한 볼륨으로 샘플을 섞어서 잘 섞는다.
- 95 열 ° C 모든 차 구조를 변성하는 5 분.
- Immediately 다시 풀림을 방지 할 수있는 젤에로드하기 전에 얼음에 좋아.
- 청색 색소가 젤의 끝에 실행까지 200V에 함께 열 샘플 전후를 실행합니다. 젤은 1X 걸레 젤 버퍼에서 실행됩니다.
- 플라스틱 랩에 젤을 정리하고 방사성 동위 원소 표지 된 RNA를 감지 할 X-선 필름이나 형광체 영상 화면에 노출. 32 P 라벨을 사용하지 않은 경우 RNA를 감지 할 수 종래의 형광 염료로 젤을 얼룩 수 있습니다
- 성공적으로 프로브 합성 젤의 상단에 매우 가까운 날카로운 밴드로 마이그레이션 RNA 프로브가 발생합니다.
2. 마우스 배아의 수집 및 저장
- 마우스 배아은 얼음 추위 PBST (PBS + 0.1 % 십대 초반 20 (취급 diethylpyrocarbonate (DEPC)))에서 수집하고 해부하는 동안 얼음에 보관해야합니다.
- 배아은 4 ML 나사 덮힌 유리 병에 처리됩니다. 여러 개의 배아를 한 병에 고정 할 수 있습니다. 많은 15-10로 E9.55 E10.5의 배아는 하나의 병에 고정 할 수 있습니다. 배의 증가 크기로 인해, E11.5의 배아는 하이브리드 동안 프로브 연결에 도움 고정하기 전에 면도날로 hemisected해야합니다. 최대 3 hemisected E11.5의 배아는 하나의 유리 병에 배치 할 수 있습니다.
- 만 작은 기포가하지 않는 한, 그렇지 않으면 남아 있도록이 프로토콜의 단계의 효과를 극대화하고 배아, 배아 고정 및 모든 세차는 유리 병의 목의 낮은 수준으로 가득 솔루션을 샘플 병에 수행하는 피해를 줄이기 위해 지정되었습니다. 세척 단계의 모든 병은 록커 플랫폼에 자신의 옆에 누웠 있습니다.
- PBST에 4 % paraformaldehyde (PFA)가 4 ° C 흔들 테이블에서의 하룻밤 6 시간 동안 수정합니다. 병은 4 ° C.에서 로커 플랫폼에 수평으로 놓이고 뻔합니다
- 고정 후, 배아은 얼음 5 분 PBST의 각에 대해 두 번 세척하고 metha을 통해 한 다음 건조 stepwise유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 병에 솔루션을 대체하여 nol / PBST 시리즈 (PBST의 25 % 메탄올, PBST의 50 % 메탄올 및 PBST의 75 % 메탄올) 100 % 메탄올로. 태아은 8 개월 동안 100 %의 메탄올과 어쩌면 오래 20C에 저장할 수 있습니다.
3. digoxigenin의 하이브리드는 전체 마우스 배아에 프로브를 표시
- 찔린 마음 E10.5 및 microdissection 나이프로 이전 배아의 머리가 배아 (이은 절개 중에 완료되지 않은 경우) 메탄올 아직있는 동안. 이 간단한 단계는 세척 솔루션은 뇌 소포함으로써 크게 배경 착색을 줄여 심장 챔버를 입력 할 수 있습니다.
- 각 메탄올 농도에서 5-10분에 대한 메탄올 / PBST 일련의 연속 세차 (PBST의 75 % 메탄올, PBST의 50 % 메탄올 후 PBST의 25 % 메탄올)에 의해 배아를 Rehydrate. 100 % PBST에 5 분마다 세척을 두 번 씻으십시오.
- 4시 1분 PBST에 품다 : 30 % H 2 O 2얼음에 1 시간. 그런 다음 각 1X의 PBST에서 3 변경 사항이 5 분을 씻는다.
- 마지막 PBST 세척을 제거하고 1ml 10 μg / PBST에 ML proteinase K로 교체하십시오. 25 ° C 물 목욕의 랙에 튜브 수직 proteinase의 K의 소화 곳 중.
참고 : proteinase K의 솔루션 자기 소화로 인해 시간이 지남에 따라 활동을 잃게됩니다. 최대적이고 일관성있는 활동을 보장하기 위해 proteinase K의 솔루션은 바로 각 사용하기 전에 신선한하셔야합니다. 각 사용 1mg/ml 주식의 작은 금액을 그 다음을 희석. 부화 시간은 proteinase K 분말의 각 많이와 각 배아 시대에 결정해야합니다. 예를 들어, E9.5의 배아에 대한 좋은 시간은 보통 25 분입니다 10-15 ° C 동안 E10.5을 위해 보통 25 20-30 분 ° C.이다 proteinase K의 배양 시간은 병 사이의 실험을 사이에 유효한 비교을 할 수 있도록 실험을하는 동안 정확하게 측정해야합니다. 온도는 신중하게 증가 할 수있는 소화하는 동안 유지되어야합니다재현성. 1의 소형 차이점 ° C 실험 사이 소화의 양을 변경할 수 있습니다. 그것은 강력하게 proteinase K의 digestions는 보육 또는 정확한 온도 제어를위한 waterbath에서 수행하는 것이 좋습니다. 이 단계는 탐사선이 이에 강력한 신호를 생성 조직을 침투 할 수 있도록 중요합니다. 그러나, 오버 소화은 배아를 손상시킬 수 있으며이 점차 나머지 단계 과정을 통해 분해됩니다. - PBST에서 갓 만든 2 밀리그램 / ML 글리신과 함께 실온에서 5 분 두 번 각각의 빨래를 세탁기로 Proteinase의 K의 소화를 중지합니다. 그런 다음 오분 PBST에서 각각 두 번 씻는다.
- PFA / PBST, 0.2 % 글루 테르 알데히드 (Polysciences) 4 %에 실온에서 20 분 동안 소화 배아를 해결했습니다. 이상 또는 underfix하지 마십시오. 오분 PBST의 각에 대해 3 번 씻으십시오.
- 이 시점에서, 태아는 하이브리드에 대한 그룹으로 나눌 수 있어야합니다. PBST를 제거합니다. 한 ML의 하이브 리다이 제이션 버퍼 (50 % ult를 추가합니다rapure 포름 아미드 (Invitrogen), 5 배 SSC, 산도 5, 1 % SDS, 50 μg / ML의 헤파린 (Acros), 65 ° C (프로브없이)로 예열 된 50 μg / ML Torula RNA (시그마)). 배아는 정착 할 수 있도록 다음 hybrization 버퍼를 모두 제거하고 프로브가없는 한 ML 신선한 따뜻하게 하이브 리다이 제이션 버퍼로 교체하십시오.
- 흔들림 물 목욕이나 흔들 플랫폼 (예를 들어 Boekle 쉐이크 앤 베이킹 오븐에, 표 1 참조) 오븐에 65 ° C에서 1 시간 동안 Prehybridize. 당신이 길러 경우 물 목욕에있는 튜브는 물이 아니라 병의 정상, 이상, 최대 제공해야합니다. 하이브리드 온도는 70로 증가 할 수 있습니다 ° 65 위 C.의 하이브리드 온도는 ° C 우리가 테스트 한 대부분의 프로브와 신호 강도 나 배경에 영향을 미치지 않습니다. 배아들을 다룰 때주의해야 (예 : 하이브 리다이 제이션 버퍼) 포름 아미드 버퍼의 반투명, 끈적하고 연약한됩니다.
- 0.4ml 하이브 리다이 제이션 버퍼에 프로브를 포함하는으로 prehybridization 버퍼를 교체0.25-1 μg / ML의 농도. 에 대한 E8.5까지 배아의 0.5 μg / 프로브의 ML을 사용합니다. 이전 배아를 들어, 프로브는 1-0.1 μg / 낮은 배경 (대개 0.25-0.5 μg / ML 이상)과 좋은 신호에 대한 최적 농도를 결정하는 ML에서 titrated해야합니다. 더 큰 하이브리드 볼륨이 큰 태아에 필요한있을 수 있습니다. 65 박 잡종을 만들다 ° C.
- 태아는 이상 proteinase K.로 치료 된 경우 사람들은 매우 투명 나타납니다. 또한 유리 병의 측면에 집중하거나 다투지 않을 수 있습니다. 이런 식으로 나타납니다 태아는 프로토콜에이 시점에서 폐기해야합니다. 을 처리하는 것은 더 interpretable 데이터가 발생하지 않습니다.
- 가온 솔루션으로 하이브리드 버퍼를 교체 70에서 I (50 % 포름 아미드, 5 배 SSC pH를 5, 1 % SDS) ° C. E8.5 배아, E9.5 세 이상 세탁 30 분에 3 번 30 분마다 세척을 두 번 씻으십시오.
- 50% 솔루션 II (0.5 : 미리 예열 50 % 솔루션 I을 한 번 씻어M NaCl, 70에서 10mM 트리스 HCL 산도 7.5, 0.1 % 십대 초반 20) ° 10 분 C.
- 실온에서 솔루션 II와 세탁 당 5 분을 세 번 씻으십시오.
- 솔루션 II는 100 μg / ML, RNase T1 100 단위 / ML RNase를 포함하는로 버퍼를 교체하십시오. 세탁 당 30 분 두 번 37C의 따뜻한 방에서 로커에 품다. RNase 세척 배경을 줄이기위한 필수적입니다 nonspecifically hybridized 프로브에서되었습니다.
- 65 솔루션 III (50 % 포름 아미드, 배 SSC pH5)에 씻어 ° C 두 번 E9.5 세 이상 세탁 30 분 E8.5, 3 시간 30 분마다 세척하십시오.
- 1X TBST (10X TBS의 100 ML은 1X TBST 물의 적절한 볼륨에서 10X TBS를 희석하고 만들려면 8g NaCl, 0.2g KCl, 물에 12.5ml 2M 트리스 HCL 산도 7.6입니다.가 포함되어있는 세탁 당 5 분 3 번 씻으십시오 ) 십대 초반 20-0.1 % 최종 농도를 추가
- 명시하지 않는 한, 모든 세차는 하단 수준으로 가득 솔루션 샘플 병에서 수행됩니다유리 병의 목. 모든 세척 단계의 경우, 병은 록커 플랫폼에 자신의 옆에 누웠 있습니다.
4. digoxygenin의 항체 감지 프로브를 표시
- 태아도 0.5 ML 1X TBST + 10 %의 열 처리 양 혈청에 미리 차단됩니다. 그럼 적어도 2.5 시간 동안 실온 (~ 20 ° C)에서 수직으로 병을 흔들.
- 알칼리성 인산 가수 분해 효소 - 복합 양 항 digoxigenin 팹 조각 (배아 아세톤 분말과 잠복기에 의해 공제, 아래 참조) 1:5000 희석 - 신선한 1X TBST로 차단 솔루션 + 1:2000을 포함하는 10 %의 혈청를 교체합니다. 배경을 최소화하기 위해 최대 1:5000까지, E9.5 세 이상 태아에 대한 높은 dilutions을 사용합니다. 4 ° C 하룻밤에 로커에 수직으로 품다.
참고 : 우리는 배아 아세톤 분말과 반 digoxigenin 팹 조각의 부화는이 프로토콜의 배경 착색의 수준을 감소 것으로 나타났습니다. 배아 아세톤 분말은 풀링 된 E12.5-14.5 마우스 embr를 균질화 준비하려면PBS의 최소 볼륨에서 yos. 얼음 차가운 아세톤, 혼합 4 볼륨을 추가하고 30 분 동안 얼음에 품다. 10 분 10,000 XG에서 회전하여 표면에 뜨는을 제거합니다. 얼음 차가운 아세톤으로 펠릿을 씻고 다시 스핀. 펠렛을 확산 및 필터 종이에 분말로 분쇄하고 건조를 방송 할 수 있습니다. 분말 그 다음 년 동안 4 ° C에서 빵빵한 튜브에 저장 할 수 있습니다.
항체 빼기를 들어, 항체는 미리 차단하는 동안 또는 그 이전에 특이 현상 구속력을 줄이기 위해 배아 아세톤 가루에 미리 흡수해야합니다. 4에 적어도 1 시간에 대한 혈청 1xTBST/10 %의 배아 분말의 작은 금액 (금액은 중요하지 않습니다)로 100분의 1에서 항체를 길러 락과 ° C. 4 ° C.에 10 분 정도 microcentrifuge에서 회전하여 분말을 제거 공제 항체는 적어도 6 개월 이상에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. - 상온에서 각 1 시간에 5-6 시간 초과 항체를 제거하는 다음, 1X의 TBST는 3 곱하기 5 분마다 씻으십시오. 만약 P라고, 배경을 줄이기 위해 4 ° C에서 확장 하루 아침에 빨래 해. 하루 아침에 세탁이 크게함으로써 잡음 비율로 신호를 증가 배경 수준을 줄일 수 있습니다.
- 갓 만든 알칼리성 인산 가수 분해 효소 버퍼 (100mM E9.5에 대한 트리스, 산도 9.5, 50mM MgCl 2, 100mM NaCl, 0.1 % 십대 초반 20. 0.5mg/ml levamisole을 추가 내생 AP 억제제, 그리고 나이가 세탁 당 20 분 두 번 씻으십시오 배아).
- BM 퍼플 AP 기판 (로슈)가 실내 온도에 prewarmed과 마지막 빨래를 교체합니다.
- 색상 반응 해부 현미경을 통해 실온에서 배양하고, 주기적으로 신호를 볼 수 있도록 허용합니다. 확장 색 반응 (야간에 몇 시간)의 병은 빛으로부터 격리해야합니다. 풍부한 mRNAs에 대한 신호는 15 분 이내 표시됩니다. 반응은이 신호에 만족하는 경우 중지, 또는 배경이 문제가하기 시작하면됩니다. 솔루션 자체가 어두운 설정하는 시작하면 당신은 C를 확장 할 수 있습니다기판 솔루션을 대체하여 olor 반응.
- 1X PBST/5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 세척을 당 5 분 두 번 세척하여 반응을 중지합니다.
- 하룻밤에 몇 시간에서 paraformaldehyde / PBST 다시 수정은 4 %로 전송할 수 있습니다. 또는 배아는 년 4% paraformaldehyde/1X의 PBST에 저장하거나 즉시 sectioning에 처리 할 수 있습니다. 이 최종 고정 단계는 얼룩 패턴의 장기 보존을위한 중요합니다.
5. 파라핀은 스테인드 배아의 삽입 및 sectioning
- 착색 레벨이 원하는 강도에있을 때 색 반응 (단계 4.8) 전체 마운트 스테인드 태아의 사진이 촬영 된 후 배아가 해결되기 전에. 전체 배아는 진한 파란색 될 때까지 전체 배아의 표현 패턴을 문서화 한 후 그들은 상온에서 24 시간 밤새 BM 보라색 기판에 incubated 수 있습니다. 이 단계는 착색이 일에 게재 충분히 어두워 질 수 있도록 보장하는 것입니다전자 조직 섹션을 제공합니다. 태아의 푸른 색은 모든 배아 표면 위로 색소의 매우 얇은 층의 증착에 의한 되오니, 이용에 참고하여주십시오. 이 배경 착색은 sectioning 후 관심의 조직 내에서 감지되지 않습니다.
- 초과 기판 침전물 제거하고 4에 4% PFA에 밤새 해결하기 위해 PBS 세 번으로 스테인드 배아를 씻으 ° C.
- PBS 세 번에 씻어 후 100 % 메탄올합니다 (2.4에서 설명)에 배아를 탈수.
- 크실렌과 함께 마지막으로 메탄올을 대체합니다. 배아는 명백해질 때까지 2 분마다 세척을 위해 크실렌 2-3 번 씻으십시오. 이 매우 어려운 손상 부분을 복구 할 수있게 내장 된 후에는 조직이 매우 부서지기 쉬운하게되므로 크실렌에 씻어 이상하지 않습니다. 시각 있는지 배아는 분명히 존재의 장소에 만들어 크실렌 부화가이 지점을 넘을 확장 할 수 없습니다 매우주의 각 크실렌 부화를 모니터링 할 수 있습니다.
- 전송 배아 (E10.5 세 이상) 생검 그래 - 테크 카세트 (Fisherbrand)로하고, 15 왁스의 전체 카세트 (Fisherbrand) ~ 65 30 분 ° C.를 품다 또 다른 15 ~ 30 분에 대한 새로운 왁스로 변경 후 다시 변경합니다. 작은 태아 / 조직 줄기가 짧은 왁스 부화 시간을 필요로합니다. E9.5의 배아는 모든 왁스 변경에 대한 조직 퍼가기 금형에 배치 할 수 있습니다. 이러한 경우에는 대신 배아를 전송 금형에서 왁스를 제거 할 수 있습니다.
- 조직 퍼가기 금형 (Polysciences) 셋이 왁스 변경, 전송 배아 후와 신선한 왁스를 삽입 할 수 있습니다. 조심스럽게 sectioning의 원하는 비행기를 배아를 배치. 확정 될 때까지 왁스가 냉각 보자.
- 제 표준 마이크로톰 (예 : Leica RM2155)를 사용하여 8 ~ 14μm 슬라이스로 왁스 블록 떨어져 있습니다. 현미경 슬라이드 (Fisherbrand)하여 진입 부분을 수집합니다.
- 슬라이드가 slidewarmer에 평면 건조하다 봅시다. 슬라이드 몇 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 말린 섹션은 두 개의 5 분 xylen에 의해 dewaxed 아르전자 세차 및 시리얼 메탄올 / 물 세차 (100 % 메탄올 2 분, 100 % 메탄올 2 분, 90 % 메탄올 / 물 2min, 70 % 메탄올 / 물 2min, 탈 이온수 5 분)에 의해 물에 rehydrated.
- 1 분 동안 핵 빠른 빨간색 (시그마) 착색 솔루션 섹션 청바지. 핵 빠른 붉은 얼룩 솔루션을 생성하려면 핵 빠른 붉은 색의 집중 주식 희석 5 수용액에 1시 5분을 (0.1 % 물에 5 % 황산 알루미늄의 핵 빠른 붉은 색을 워트 먼지 필터 종이를 통해 열 및 필터를 분해) %의 황산 알루미늄. 얼룩 후 물이 맑은 될 때까지 흐르는 물과 함께 슬라이드를 씻어. 핵 빠른 붉은 counterstain으로 행위와 섹션에 전체 조직 구조를 보여줍니다. 의 색상은 RNA 프로브의 지역화을 표시 자주색 블루 착색과 잘 대조를 이룹니다. 핵 빠른 빨간색은 포화 얼룩이며, 착색 강도는 착색 솔루션의 농도에 의해 제어됩니다. 만약 핵 빠른 붉은 착색의 강도당신은 더 농축 핵 빠른 붉은 색 솔루션이 단계를 반복 할 수이 착색 솔루션을 사용할 때 부족하다.
- 다음과 같은 일련의 솔루션을 각 세차하여 coverslips를 장착하기 위해 슬라이드를 준비 : 90 % 메탄올 / 100 % 메탄올 2 세차 다음 물 xylenes 2 세차에 이어. 세차의 각 2 분 동안 슬라이드를 품다.
- Cytoseal 60 장착 매체 (리차드 - 앨런 과학)으로 슬라이드를 탑재합니다. 그 수성 마운트 미디어 핵 빠른 빨간 얼룩 분해 되니 참고하시기 바랍니다.
참고 : 우리는 또한 우수한 결과를 4 스테인드 배아의 섹션을 생성 할 수있는 플라스틱 퍼가기 수지 (Immuno-침대, Polysciences 주식회사)를 사용하고 있습니다.
6. 대표 결과 :
그림 1은이 프로토콜을 사용하여 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 그림 1A는 E10.5 마우스 배아의 Gata3의 표현 패턴을 보여줍니다. 이 패널은 좋은 R을 보여줍니다배경 비율이 높은 신호 esult. 그림 1C는 대조적으로,이 부분적으로 저하 RNA 프로브를 사용 Gata3 mRNA에 대한 원위치 하이브리드 화에 실패 보여줍니다. 낮은 특정 활동 탐사선이 배경 대비 낮은 신호 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 패널의 비교 A와 C가 중요성을 보여줍니다 고품질의 결과를 제공하기 위해 프로브 품질의주의 품질 관리 평가를 수행. Foxg1 프로브 (그림 1B)를 얻은 결과는 뇌의 다른 부분에서 낮은 배경 telencephalon에서 특정 얼룩과 좋은 결과를 보여줍니다. 뇌와 심장이 프로브 트래핑에 의해 발생 배경 착색의 일반적인 사이트입니다. 포셉과 뇌와 마음을 펑 쳐링은 (단계 3.1 참조) 배아 및 최소화 배경 착색에 솔루션을 씻어 수 있습니다. 그림 1D은 뇌가 구멍되지 않을 때 발견 된 전형적인 밝은 파란색 배경을 보여줍니다. 이 차선 결과가 Pax1 프로브를 사용하여 얻은 보여줍니다. Pax1은 뇌의 어떤 부분에서 표현이 태아의 뇌에서 볼 수 착색 모든 비 특정 배경 때문입니다하지 않습니다.
결과 (A, B) 성공과 차선 (C, D)의 예를 보여주는 그림 1. 대표 결과가. A. E10.5의 배아는 Gata3 프로브와 hybridized. B. E11.5의 배아는 Foxg1 프로브와 hybridized. C. E10. 5 배 전체 배아 아웃을 통해 매우 약한 신호를하지만, 높은 배경을 보여 부분적으로 타락 Gata3 프로브와 hybridized. D. E10.5의 배아는 심실 (화살표 머리)에 배경 착색을 보여 머리를 펑 쳐링없이 Pax1 프로브와 hybridized.
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Discussion
이 프로토콜에 설명 된 방법은 다른 소스들로부터 적응 및 전체 마운트 E8.5 - E11.5 일 이전 마우스 배아에 최적화되어 있습니다. 척추 동물의 배아의 현장 하이브리드 화에 전체 마운트하기위한 방법은 먼저 1990 년대 초 2,5-12에 나타났다. 이 프로토콜은 주로 Xenopus의 배아 7,8뿐만 아니라 마우스 2,11 용으로 개발 된 방법에서 적응되었습니다. 우리 프로토콜에서 강조의 큰 거래는 프로브의주의 품질 평가에 배치됩니다. 높은 품질과 높은 특정 활동 RNA를 생성에 세심한주의가이 프로토콜에서 가장 오래된 단계에 의해 결정 프로브는 크게 데이터의 품질을 향상시키고 장기적으로 시간과 노력의 상당한 금액을 저장합니다. 우리 프로토콜은 파지 RNA 중합 효소의 전사에 대한 PCR 생성 된 DNA 템플릿의 사용을 포함한다. 이 방법은 신속하고 매우 확장 성이 있습니다. 이 RNA 프로브 강한 다수의의 생성을 활성화 할 수 있습니다현장 하이브리드 화의 연구 규모는 13-15를 상영.
배경이 높은 있지만 신호가 부족할 때이 프로토콜의 여러 단계가 고려되어야한다. 한 고려 프로브입니다. 우리는이 프로토콜에 지정된 디자인 기준을 충족하고이 세 가지 품질 관리 테스트를 (수율 특정 활동과 프로브 길이) 통과 한 RNA 프로브와 함께 높은 배경 없었습니다. 배경 수준에 영향을 미칠 수있는 다른 요인은 배아 조직에 침투 할 수있는 프로브의 능력입니다. 케어는 완전히 배아를 커버 extraembryonic 세포막을 제거하는 절개 중에 찍은해야합니다. 또한, proteinase의 K의 소화 단계는 E9.5보다 나이가 배아의 절대적으로 필수적입니다. 긴 proteinase K의 소화 시간이 낮은 배경과 더 강한 신호를하지만, 과도한 소화 시간이 증가 조직 손상시킬 수 있으며 절차 중에 배의 붕괴를 초래할 수 있습니다. Optimizatproteinase K의 각 많은의 소화 시간의 이온은 최상의 결과를 얻기 위해 필요합니다. 배경 비율에 높은 신호를 얻기 위해 최적화 할 수 있습니다 또 다른 단계는 RNase의 부화 (단계 3.14)입니다. 우리 프로토콜은 RNase A와 RNase T1의 혼합물을 사용합니다. 두 효소는 단일 좌초 RNA를 소화하지만, 각각의 효소는 다른 기본 특성이 있습니다. 작은 oligoribonucleotides에 단일 좌초 RNA의 다양한 소화의 두 효소 결과의 조합. 이 후 하이브 리다이 제이션에 의해 제거 될 수있는 비 구체적으로 hybridized 프로브의 대부분은 배경 착색에 큰 감소의 결과로 씻는다 수 있습니다. 증가 배경에 RNase A 또는 T1 혼자 결과를 사용하여 피해야한다. 우리는 또한 최종 색상 반응의 질은 신선한 AP 버퍼를 사용하여 향상이있는 것으로 나타났습니다 사용하기 전에 바로했다.
우리 프로토콜은 추가 처리로 이전 배아 또는 성인 조직에 적응 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 또한이성인 마우스의 뇌 (데이터 미도시)의 두께 (100 μm) vibratome 섹션에 원위치 hybridizations에서 수행하려면이 프로토콜을 사용했습니다. 우리는 또한 이전 배아의 유전자 발현을 연구하기 위해이 프로토콜을 사용했습니다. 어떤 경우에는 이러한 vibrissae (4)의 모낭에 Gad1 표정으로 E13.5 및 E14.5 배아의 표면에 유전자 발현을 시각화하기 위해이 프로토콜을 사용했습니다. 다른 경우에 우리는 면도날이나 메스의 배아에서 특정 조직에 프로브 액세스를 제공하기 위해 E12.5 - E14.5 배아를 잘라하는 데 사용합니다. 이러한 방식으로 준비 배아 조각은 일부 수정이 프로토콜을 사용하여 처리 할 수 있습니다. 이 경우 모든 트리트먼트와 세척 단계의 길이는 조직의 크기에 따라 조정하고 경험적으로 최적화해야합니다.
우리 프로토콜은 또한 표현 패턴 후 하이브리드 sectioning 및 분석을위한 방법이 포함되어 있습니다. 유전자 발현의 전체 마운트 시각화이 addi와 결합tional 단계는 유전자의 표현 패턴에 관한 추가 정보의 큰 거래를 추가 할 수 있습니다. 우리는 파라핀에 원위치 하이브리드 화에 진행뿐만 아니라 플라스틱 수지 4,16 년 후 배아를 내장하고 있습니다. 스테인드 배아의 섹션이 원위치 하이브리드 절차의 전체 마운트에 의해 밝혀 표현 패턴의 3 차원 재건을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는이 목적을 위해 SURFdriver 소프트웨어에서 재구성 소프트웨어를 사용했습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R21MH082360 (BGC)와 R01HD056315 (NRM)뿐만 아니라 조지아 대학에서 지원했다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Reagent | Roche Group | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche Group | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche Group | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | PerkinElmer, Inc. | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche Group | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher Scientific | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene, Agilent Technologies | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros Organics | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences, Inc. | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche Group | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche Group | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche Group | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma-Aldrich | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche Group | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National Scientific Company | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisher Scientific | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences, Inc. | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisher Scientific | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma-Aldrich | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
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