Summary
努力找出端粒酶的催化亚基，叔，足够数量结构研究，已会见了十余有限的成功。在这里，我们目前的重组赤拟谷盗叔隔离的方法（
Abstract
努力找出端粒酶的催化亚基，叔，足够数量结构研究，已会见了十余有限的成功。在这里，我们目前的重组赤拟谷盗叔（TC叔）的分离和重组的积极 T.方法谷盗端粒酶的核糖核蛋白（RNP）复合物在体外 。
端粒酶是一个专门的反转录酶1，增加了短的DNA重复序列，称为端粒，线性染色体 2，有利于保护他们从终端到终端的融合和退化的3'端。短段DNA复制，失去了在3号染色体的结束，如果没有端粒酶，细胞继续分裂，直至最终达到他们海弗利克极限4。此外，端粒酶在大多数体细胞在成人的 5中处于休眠状态，但活跃于癌细胞，促进细胞不死7。
最小的端粒酶由两个核心部分组成：蛋白亚基（叔），其中包括酶的催化亚基和一个完整的RNA组分（TER），其中包含的模板叔使用合成端粒8,9。在2008年之前，只有个别端粒酶域的结构已经解决了10,11。在这一领域的一个重大突破来自活跃的 12晶体结构测定，T的催化亚基谷盗端粒酶，TC叔1。
在这里，我们目前生产大量的活性，可溶性TC叔结构和生化研究，并重组端粒酶活性检测端粒酶在体外的RNP复杂的方法。使用的实验方法概述如图1所示。
Protocol
1。表达的重组TC叔
- 从六个新鲜板用的TEV裂解N -端含有合成TC叔质粒转化罗塞塔（DE3）pLysS中细胞接种6升（6 × 2升困扰锥形瓶包含在每1 L 2YT肉汤）2YT媒体hexahistidine标签。
- 细胞增长在37 ° C，而在220转的0.5-0.6一个外径600的摇晃。
- 加入1 mM的IPTG诱导蛋白表达。
- 降低温度至30 ° C，缓慢摇动至150转，让细胞表达蛋白质为4-5小时
- 离心收集细胞在4 ° C和30分钟3500转。
- 每1升的细胞沉淀重悬在20毫升含25毫米的Tris，pH值7.5，10％的甘油，0.5 M的氯化钾，15毫米咪唑，5毫米β-巯基乙醇，0.1毫米苯磺酰氟（PMSF）和苯甲脒缓冲区。
- 闪存冻结悬浮细胞缓缓滴入50毫升的塑料圆锥管充满液态氮，使每下降可能造成的影响，在液态氮冻结的细胞混合物。商店冷冻细胞在-80 ° C，直到准备蛋白质纯化。
2。 TC叔的纯化
- 细胞在室温下解冻，直到液体的一致性达到，然后将冰为超声金属烧杯。
- 在30秒的时间间隔30秒的停顿，在约51 W的功率超声细胞在冰上2分钟。
- 在20分钟18000转离心裂解细胞分开的可溶性和不可溶性蛋白组分，并小心取出上清液镍亲和层析。
- 平衡NI - NTA（氮川三乙酸镍）含有的25毫米的Tris，pH值7.5，10％的甘油，0.5 M的氯化钾，15毫米咪唑，5毫米β-巯基乙醇，0.1毫米PMSF和苯甲脒缓冲列。
- 在树脂负载上清，收集流过。
- 列包含的25毫米Tris，pH值7.5，10％的甘油，氯化钾500毫米，15毫米咪唑，5毫米β-巯基乙醇，0.1毫米PMSF删除所有剩余的和非特异性结合蛋白的缓冲区清洗。
- 镍NTA树脂使用15咪唑梯度洗脱TC叔- 300毫米，并收集3毫升组分进行SDS - PAGE分析。
- 使用页面分析，以确定哪些分数包含TC叔蛋白，并集中在一个30 kDa的（微孔）过滤器Amicon这些分数。
- 一个体积小于10毫升为进一步净化浓缩TC叔分数。
- TC叔是进一步纯化过的阳离子交换柱（HS波罗斯，美国应用生物系统公司）与含有25毫米的Tris，pH值7.5，10％的甘油，氯化钾500毫米，1毫米的DTT缓冲区预平衡。
- 负载HS波罗斯列的蛋白质的结构和清洗，以消除所有蛋白质和核酸的污染物。
- 洗净用含有500毫米700毫米，氯化钾，以消除任何剩余的污染物氯化钾缓冲列。
- 洗脱用1 M KCl缓冲关闭HS波罗斯列TC叔蛋白质。此时应超过99％的纯蛋白质。
- 删除任何蛋白质总量，通过一个Superdex - 200浆纱列（体积排阻色谱 - 通用电气医疗集团）的蛋白质，含有25毫米的Tris，pH值7.5，10％的甘油，氯化钾500毫米和1毫米TCEP缓冲区预平衡。
3。赤拟谷盗虫文化
- 的T.谷盗甲虫最初作为礼物送给布恩，博士，美国堪萨斯州立大学生物学部提供。
- 启动T。谷盗文化28.5克面粉和1.5克的干面包师的酵母加入到容器中的一百年的成虫。
- 商店甲虫在室温和文化在阴暗，潮湿的环境，为三到四个星期，以便繁殖和生长。放置一个烧杯中含有水甲虫的存储区域，以确保在潮湿的环境。
- 收获为RNA提取所需的甲虫幼虫。让其余的幼虫成熟的成年人，让他们在相同的文化。
- 每个月，转移到一个新的含有新鲜的面粉和酵母的容量瓶中，以补充他们的食物供应的最活跃的甲虫（不超过一百年）。
4 T。谷盗总RNA提取
- 收获20分离成虫和面粉/酵母培养他们从文化的甲虫幼虫（每个文化之间应该包含500-1000幼虫）。消除面粉或酵母颗粒研磨前甲虫。
- 消毒板凳区，迫击炮和杵（以及考虑把手套）RNaseZap（Ambion公司，公司）使用此过程删除核糖核酸的所有痕迹，研磨前的甲虫。
- 幼虫在液态氮研磨成细粉末使用迫击炮和杵和T同时保持液体氮 ，以确保粉末保持冻结，直到提取液加入到50 mL离心管ransfer的粉末。
- 让多余的液体氮蒸发粉。液体氮蒸发后，均质200μL提取缓冲液中的甲虫粉（每20个甲虫幼虫），其中包含的Tris - HCl 25毫米，5毫米的β-巯基乙醇，1毫米EGTA，苯甲脒0.1毫米， 200毫米氯化钾，10 ％甘油，10毫米咪唑和20U RNasin，pH值7.5和孵化冰浴30分钟。
- 离心20分钟15000转的匀浆液在4 ° C，收集上清和闪光灯冻结在二氮液体样品。如果有必要，样品可存放于-80 ° C过夜。
- 使用的RNeasy试剂盒（QIAGEN）提取总RNA。
5， 在体外重组，赤拟谷盗端粒酶
- 混合使用50μLT 的 20微克重组他的标签TC叔谷盗总RNA结合缓冲液中含有的Tris - HCl 25毫米，200毫米氯化钾，10％甘油，5毫米β-巯基乙醇，10毫米咪唑，pH值7.5。
- 孵育TC叔-两小时的总RNA混合物在22 ° T中的彗星谷盗裂解RNasin抑制剂，以防止RNA降解的存在。
- 复杂的多Ni - NTA柱纯化，以去除裂解杂质和多余的RNA。
6。端粒酶重复序列扩增法（TRAP）分析
- 混合4微克镍- NTA纯化T。谷盗端粒酶在50μL伸长缓冲液含20毫米的Tris - HCl（pH值- 8.3），7.5毫米氯化镁 2，63毫米氯化钾，0.05％，0.01％BSA，1毫米EGTA吐温20，0.5毫米dNTPs，1μMTCAS - TS DNA引物（5' - AAGCCGTCGAGCAGAGTC - 3'），并孵育的混合物在30 ° C为60分钟，让重组T. TCAS - TS的DNA引物伸长率谷盗端粒酶。
- 拉长的单链DNA（单链DNA）反应混合物中加入等体积的苯酚氯仿提取。摇动轻轻直到乳液均匀的混合物。
- 五分钟12000转离心样品在4 ° C至分离污染物的单链DNA。
- 样品的顶部的水层转移到1.5 mL Eppendorf管中，添加一个终浓度为10毫米NaOAc（pH值5.0），MgCl 2的1毫米，66.4％的乙醇，然后让样品沉淀-20隔夜° C。
- 在三十分钟15000转的旋转样品在4 ° C颗粒沉淀的单链DNA。倒出使用移液器的解决方案，然后添加200μl70％乙醇的样品从样品其余NaOAc和MgCl 2的洗。以相同的速度和温度重新颗粒样品，离心五分钟的样品。
- 倒出的乙醇溶液使用移液器和删除允许Eppendorf管中，在室温下孵育三分钟乙醇剩下的痕迹。在样品中的乙醇会干扰PCR扩增步骤。
- 在50μlPCR反应缓冲液含10毫米的Tris - HCl（pH为8），50 mM的氯化钾， 氯化镁 2 2毫米，100μMdNTPs（dATP的液重悬的单链DNA颗粒（含端粒酶拉长产品和TCAS - TS底漆）， dGTP和dTTP），10μM[32 P] dCTP，1微米TCAS - CX引物（5' - GTGTGACCTGACCTGACC - 3'）和1.25 U Taq DNA聚合酶。
- PCR扩增端粒酶伸长产品（94 ° C为30秒，50 ° C 30秒，和72℃1分钟29周期），使他们12％的聚丙烯酰胺凝胶上可见。
- 前运行的Tris -硼酸- EDTA（TBE）的运行缓冲液含有44.5毫米三，硼酸44.5毫米，1毫米EDTA，pH值8三十分钟之前运行的PCR样本的12％的凝胶。经过预运行和装载凝胶PCR反应，在185伏特运行凝胶为1.5-2小时，在4℃或冰上°。
- 干凝胶和使用磷光体成像板，可视化的活动。
7。代表性的成果：
例如体积排阻色谱纯化的TC叔后如图2所示。集中净化后的蛋白质12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上运行，被证明是99％以上的纯（图2A）。还提供了体积排阻色谱（S200）是（图2B），以证明其纯度和纯化蛋白质样品总量不足。 5毫克后，所有已完成的纯化步骤蛋白产量通常是获得虽然最终产量可能有所不同。
代表TRAP法一个重组的T。谷盗端粒酶是如图3所示，米切尔等。12 。可以看出，但在1巷，端粒酶产品分步进行的阶梯他们是缺席的RNase处理端粒酶和泳道2和3分别叔的活性中心突变体（D251A）样品。
图1。参与重组的重组TC叔步骤的流程图。首先，重组TC叔过在大肠杆菌中表达大肠杆菌 。的蛋白质是由镍，阳离子交换和体积排阻色谱纯化。的T.谷盗甲虫在内部培养和它们的幼虫是用于分离的总RNA。纯化的TC叔和总RNA，然后混合重组端粒酶的RNP复杂，并随后陷阱检测是用来确认的RNP复杂，是一个积极的端粒酶。
图2。体积排阻色谱和TC叔蛋白SDS - PAGE分析。 （一）12％SDS聚丙烯酰胺凝胶的TC叔蛋白后体积排阻色谱。 TC叔蛋白（70 kDa）的SDS - PAGE凝胶上的迁移速度更快，因为它具有很高的等电点（PI - 9.8）（B）尺寸排除色谱TC叔蛋白（Superdex S200）。
图3。 在体外的陷阱检测重组赤拟谷盗端粒酶适应米切尔等12 。巷1：野生型TC叔和总RNA分离出甲虫幼虫。巷2：野生型TC叔和RNase处理幼虫总RNA和细胞提取物。巷3：活性部位突变TC叔（D251A）和甲虫幼虫总幼虫RNA。
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Discussion
这里介绍的方法可以为大量生产的T 的催化亚基谷盗可溶性活性形式，结构和生化研究端粒酶叔。 TC叔过度表达的方法是敏感微妙的变化，在温度或从上述这些细胞密度和蛋白表达水平可以显着地影响。具体来说，我们发现，诱导蛋白表达的细胞之前，在600 nm的光密度达到0.5，或降低温度至30 ° C诱导前，在蛋白质产量显着减少。
在净化方面，TC叔蛋白质有一个基本的等电点（PI - 9.8），所以可以利用的能力紧密结合的阳离子交换柱，产量高盐样品装载和洗纯蛋白质样品浓度。如果感兴趣的蛋白质有这个协议可以适应代的阳离子交换阴离子交换柱，和重新优化的清洗条件，以达到最佳的蛋白纯度低的等电点（PI <5）。
在组装的酶，这里介绍的方法只是一种端粒酶全酶的部分重建，因为它不包括任何端粒酶相关蛋白。虽然这些组件不存在，重组后的端粒酶从 T重组TC叔和总RNA的组成谷盗幼虫是积极的，如图3所示。端粒酶染色体末端添加多个相同的重复的独特的能力，称为重复添加Processivity一个过程，可以通过可视化产品在陷阱凝胶的阶梯。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这里介绍的研究是由宾夕法尼亚州的卫生署，埃利森医学，V和祖母绿基础支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen, EMD Millipore | 70956 | |
| 2YT Broth | TEKnova, Inc. | Y0215 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C | |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | ||
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Healthcare | ||
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | EMD Millipore | UFC903008 | |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 | |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 | |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803-100mL | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N251B | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
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