Summary
Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono le cellule pacemaker del tratto gastrointestinale (GI). Essi formano reti complesse tra le cellule muscolari lisce e fibre neuronali post-gangliari per regolare contrattilità gastrointestinale. Qui vi presentiamo metodi di immunofluorescenza trasversale e con tutto il supporto di visualizzazione murini reti ICC.
Abstract
Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono mesenchimali derivate "cellule pacemaker" del tratto gastrointestinale (GI) che generano spontanei onde lente necessaria per la peristalsi e mediare ingresso neuronali dal sistema1 nervoso enterico. Diversi sottotipi di ICC forma reti distinte nella muscolare del tratto gastrointestinale 2,3. Perdite o danni a queste reti è associato con una serie di disturbi della motilità 4. ICC cellule esprimono il recettore tirosin-chinasi KIT sulla membrana plasmatica e KIT immunocolorazione è stata utilizzata negli ultimi 15 anni per l'etichetta della rete ICC 5,6. È importante sottolineare che l'attività KIT normale è necessario per lo sviluppo ICC 5,6. Trasformazione neoplastica delle cellule ICC risultati in tumori stromali gastrointestinali (GIST), che spesso porto guadagno di funzione mutazioni KIT 7,8. Abbiamo recentemente dimostrato che ETV1 è un lignaggio specifico fattore di sopravvivenza espresso nel lignaggio ICC / GIST ed è un regolatore trascrizionale maestro necessari sia per la formazione normale rete ICC e della tumorigenesi GIST 9. Abbiamo inoltre dimostrare che collabora con mutazioni attivanti KIT nella tumorigenesi. Qui, descriviamo i metodi per la visualizzazione delle reti di ICC nei topi, in gran parte sulla base di protocolli precedentemente pubblicato con il 10,11. Più recentemente, il canale del cloro anoctamin 1 (ANO1) è stato caratterizzato come un marker specifico di membrana ICC 11,12. A causa della loro localizzazione membrana plasmatica, immunofluorescenza di entrambe le proteine possono essere usate per visualizzare le reti ICC. Qui, descriviamo la visualizzazione delle reti ICC da fisso cyrosections congelati e preparati montare tutto.
Protocol
1. Dissezione di mouse tratto gastrointestinale
- Topi da locali in materia di eutanasia IUCAC
- Pin ogni arto sulla superficie di polistirolo e risciacquare superficie addominale con il 70% di etanolo. Aprire cavità addominale con incisione lungo la linea mediana dal diaframma al pube. Fare un'alzata al esofago distale e un secondo taglio a livello intestinale distale di grandi dimensioni e rimuovere il tratto gastrointestinale dallo stomaco all'ano in blocco, con attenzione al taglio dei legamenti del duodeno e cieco con piccole forbici. Luogo tratto gastrointestinale in una piastra di Petri con PBS. Sezionare via mesentere con pinzette (Figura 1). Per separare stomaco, intestino tenue e intestino crasso, tagliato a piloro e la giunzione ileocecale. Sciacquare il lume di ogni parte del tratto gastrointestinale con PBS usando una siringa da 5 ml collegata ad un ago di alimentazione (topi più anziani) o un ago senza punta (più giovani topi).
- Stomaco aperto, intestino tenue e intestino crasso, lungo il confine mesenterica. Tagliate due pezzi per ogni parte del tratto gastrointestinale, una per la visualizzazione montare tutto e uno per cryosection.
2. Tutto montare la preparazione del campione e immunocolorazione
- Posizionare il pezzo intero di ogni parte del tratto gastrointestinale in un tubo di 1,5 centimetri microcentrifuga riempito con 1,0 ml di acetone ghiacciate e campioni correzione per almeno 1 ora a 4 ° C. I campioni possono essere conservati per un massimo di 1 settimana a -20 ° C. Noi di solito conservare i campioni in acetone e procedere per preparare cyrosections.
- Lavare 2X campione con PBS. Collocare il campione in capsula di Petri con PBS. Sotto dissezione miscroscope, con attenzione raschiare strato mucoso con un bisturi tenendo una estremità con un paio di pinzette, lascia la tonaca muscolare.
- Muscolo può essere tagliato in pezzi 5mm per colorazione con anticorpi diversi. Non conservare per più di 2 giorni in PBS prima della colorazione.
- Passi blocco e l'incubazione può essere fatto in un pozzetto di un 24-pozzetti o in una provetta per microcentrifuga 1,5 ml. Blocco con 0,5 ml di tampone di bloccaggio (siero di capra al 5%, 0,1% Triton X-100 in PBS per 1 ora a 4 ° C).
- Incubare con l'anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio e ruotare la notte a 4 ° C. Abbiamo utilizzato con successo ACK-2 Kit anti-ratto, coniglio anti-Ano1, e di coniglio anti-PGP9.5 anticorpi per immunostaining monte tutto.
- Lavare per almeno 2X 5 con PBS sul rotore a temperatura ambiente.
- Incubare con anticorpo secondario diluito in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente su rotatori. Noi in genere utilizzano Alexa Fluor 488 anti-coniglio e Alexa Fluor 594 anticorpi anti-topo.
- Lavare per 15 minuti 3 volte con PBS su rotatori a temperatura ambiente.
- Montare sulla slitta, lato sierose sulla parte superiore per garantire l'orientamento del tessuto durante la microscopia. Questo orientamento garantirà il lato sierose per affrontare il coprioggetto ed essere incontrati prima come ci si concentra nella diapositiva su un microscopio. Facciamo questo in un microscopio da dissezione. A volte, abbiamo brevemente esaminare il tessuto al microscopio a fluorescenza per orientare correttamente. Al microscopio a fluorescenza per visualizzare Kit o Ano1, si dovrebbe incontrare il CPI-MY prima rete dal lato del coprioggetto. Avanti, aspirare PBS per quanto possibile, senza asciugare completamente. Aggiungere 50 ml di set di supporti di montaggio duro (usiamo Prolungare Gold) e poggiate delicatamente scivolare coperchio sulla parte superiore del tessuto. Permettere l'impostazione di montaggio durante la notte a temperatura ambiente e conservare i vetrini a -80 ° C.
- Per l'esame microscopico, abbiamo usato un microscopio a campo largo con una Z-drive. Abbiamo usato sia un obiettivo 20X aria (NA 0.75, apocromatico piano) o olio obiettivo 60X (NA 1.4, apocromatico piano) e preso 2 micron o 1 micron Z-sezioni che coprono l'intero muscolare. Le immagini sono state successivamente deconvoluted utilizzando il software Autoquant deconvoluzione. In alternativa, molti altri hanno usato la microscopia confocale, invece, con risultati simili.
3. Cryosection preparazione e immunocolorazione
- Luogo ogni parte del tratto gastrointestinale, lato sierose verso il basso, piatto su carta da filtro. Tagliare la carta da filtro di tutto il tessuto. Tessuto posto su carta da filtro nel 4% paraformaldeide (PFA) in PBS (noi diluire 32% paraformaldeide in flaconcino sigillato in PBS a destra prima dell'uso) per 2 ore a temperatura ambiente. Fissaggio può essere fatto in un 6 - o 12-pozzetti a seconda delle dimensioni del tessuto, o in un tubo microcentrifuga 1,5 ml. Se fatto in lamiera, parafilm per minimizzare l'esposizione PFA. Tempi di fissazione più lunga può portare a mascherare l'antigene, in particolare per l'ACK-2 anti-kit di anticorpi.
- Rimuovere il tessuto da PFA e luogo nel 30% di saccarosio in PBS. Lasciare tessuto ad affondare durante la notte a 4 ° C.
- Equilibrare tessuto con rapporto 1:1 del 30% saccarosio e ottobre per 1 ora. Quindi montare il tessuto in verticale cryomold pieno di ottobre L'asse longitudinale del tratto gastrointestinale va in parallelo con la cyrosections. Nell'esaminare topi con differenti genotipi o con diversi trattamenti, può essere utile per montare il tessuto da diversi tipi di mouse sul cryomold stesso per assicurare l'elaborazione parallela. Congelamento in ghiaccio secco e mettere in freezer -80 ° C per la conservazione.
- Tagliare 10 criosezioni micronsul vetrino e conservare congelatore a -80 ° C. Noi di solito tagliato due sezioni per vetrino. Noi di solito procedere alla colorazione H & E di una diapositiva cryosection.
- Per immunofluorescenza, prima equilibrare scivolo a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi disegnare cerchio intorno al tessuto usando penna PAP.
- Blocco con 150 ml di tampone di bloccaggio (come per tutta la immunostaining montaggio) per 1 ora.
- Aspirare il tampone di bloccaggio e aggiungere 150 microlitri anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio e incubare una notte a 4 ° C in una camera umidificata.
- Lavare 5 min 2X con PBS.
- Incubare con anticorpo secondario diluito in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente. Noi in genere utilizzano Alexa 488 anti-coniglio e Alexa 594 anticorpi anti-topo.
- Lavare per 15 minuti 3 volte con PBS.
- Aspirare senza scivolare completamente l'essiccazione dei tessuti. Aggiungere una goccia di serie dura montaggio di mezzi con DAPI (usiamo Prolungare Gold) e posto # 1.5 coprioggetti. Porre il vetrino a temperatura ambiente per una notte per impostare e conservare in congelatore -80 ° C.
- Acquisire immagini tripla fluorescenza con DAPI, FITC e Texas Red set di filtri.
4. Rappresentante dei risultati:
Qui, usiamo l'intestino crasso come esempio. H & E macchia di saccarosio protetto fisso sezione congelata utilizzata per immunofluorescenza mostra alcuni artefatti rispetto ad una sezione di paraffina di riferimento (Figura 2), dove la linea gialla demarks plesso mioenterico tra gli strati muscolari circolari e longitudinali e la demarks linea verde al confine tra le mucosa e muscularlis. Esaminando il cryosection, dalla sierosa a mucosa, è più sottile del primo incontro longitudinale muscolare (LM) strato seguito da spessore del muscolo circolare (CM) strato. La sezione dovrebbe essere in parallelo con il muscolo longitudinale in modo che il nucleo di LM dovrebbe essere un po 'allungata, mentre i nuclei delle CM deve essere piccolo e rotondo. Tra la LM e CM sono plexi mioenterico fatta di neuroni che macchia con PGP9.5. PGP9.5 anche i processi neuronali macchie in tutto il CM. Il mioenterico ICC rete (ICC-MY) circondano il plesso mioenterico e sono fatti di cellule multipolare. All'interno dello strato muscolare longitudinale, ci sono rari ICC intramuscolare (IM-ICC), che sono cellule bipolari in parallelo con il muscolo. All'interno dello strato muscolare circolare, ci sono abbondanti ICC-IM che sono anche le cellule bipolari che corrono paralleli con il muscolo circolare e sono sezionato con questo taglio. All'incrocio tra la tonaca muscolare e la sottomucosa, la rete sottomucosa CPI composta da ICC-SMP è una rete di piatto ICC multipolare. Esaminando l'intero kit di montaggio immunocolorazione del grosso intestino, ci si dovrebbe aspettare di incontrare l'ICC-MY prima rete, e poi il CPI-IM della CM, e ICC-SMP reti, ci si concentra dal coprioggetto (Figure. 3) . Misura volumetrica delle reti di ICC con ricostruzione in 3D di interi montare le immagini sono state descritte 10. Utilizzando a grande campo microscopio, vi sia una significativa out-of-plane fluorescenza nelle immagini prima che può essere rimosso dopo deconvoluzione (figura 3). Incompleta stripping della mucosa si tradurrà in fluorescenza di fondo elevato. ANO1 è un altro marker della Corte penale internazionale e co-immunocolorazione di KIT e ANO1 mostra sovrapposizione completa di colorazione ICC (Figura 4).
Rappresentante Figura 1. Sezionato tratto gastrointestinale del mouse, ristampato con il permesso 13.
Figura 2. A) Rappresentante colorazione H & E della intestino del mouse di grandi dimensioni di criosezioni preparato come descritto e paraffina riferimento incorporato sezione che mostra alcuni manufatti restringimento di criosezioni. Il demarks linea gialla del plesso mioenterico e la linea blu separa la mucosa dalla muscolare. B) Rappresentante Kit (rosso, ACK-2) e PGP9.5 (verde) immunofluorescenza doppia con DAPI (blu) di contrasto dell 'intestino del mouse di grandi dimensioni. LM: CM longitudinale muscolare: muscolo circolare. Scala bar 20 micron.
Figura 3. Rappresentante Kit (rosso, ACK-2) con tutto il montaggio immunofluorescenza dello stesso campo a tre piani focali, l'ICC-il mio aereo a LM / CM confine, l'ICC-IM aereo nel CM, e la CPI- aereo SMP al CM / sottomucosa confine. Immagini RAW e le immagini deconvoluted sono mostrati. Scala bar 20 micron.
Figura 4. Rappresentante doppia immunofluorescenza di Ano1 (verde) e Kit (rosso, ACK-2) nel grande intestino. Scala bar 20 micron.
Discussion
Cellule interstiziali di Cajal sono stati inizialmente caratterizzati da Santiago Ramóón y Cajal esattamente un secolo fa con le macchie cromato di blu di metilene e l'argento di muscolare gastrointestinale. Cajal inizialmente pensato CPI sono stati i neuroni in base al loro processi che ricordano di assoni e dendriti. Nel corso di molti anni successivi, lo studio della biologia ICC è stato limitato dalla mancanza di marcatori specifici fino alla scoperta di questo KIT non solo si esprime in ICC, ma è necessario anche per il loro sviluppo 6. Da allora, KIT immunofluorescenza è stato ampiamente utilizzato nello studio della biologia e della Corte penale internazionale ha portato anche l'apprezzamento della ICC in altri organi contrattili come la vescica urinaria. Recentemente, ANO1 è stato identificato come un secondo marcatore affidabile ICC.
Ci sono state numerose pubblicazioni negli ultimi 15 anni, utilizzando l'immunofluorescenza per identificare ICC con la fissazione vari e tecniche di montaggio. Nelle nostre mani "fisso-congelato" criosezioni che sono stati prefissati con paraformaldeide e saccarosio protette funziona meglio rispetto al acetone o paraformaldeide post-fissazione dopo criosezionamento. Per i montaggi tutto, abbiamo trovato che la fissazione di acetone mediante dissezione della mucosa dà i risultati più robusti.
Storicamente, l'ACK-2 è stato l'anticorpo Kit di scelta per l'identificazione del mouse ICC. Si tratta di un topo monoclonale che riconosce il dominio extracellulare ed è anche un anticorpo che causa il blocco ileo quando somministrato a vivere topi. Tuttavia, l'ACK-2 epitopo viene lentamente distrutto da fissazione paraformaldeide e non viene salvato da metodi standard di recupero dell'antigene. Abbiamo scoperto che l'ACK-4 epitopo è più resistente alla fissazione paraformaldeide. Rispetto al fisso blocchi congelati e sezioni, blocchi di paraffina e le sezioni morfologia conserva meglio ed è più suscettibile di archiviazione a lungo termine (Figura 4). Né ACK ACK-2-4, né sono stati utilizzati con successo in sezioni di paraffina. Abbiamo caratterizzato che D13A2, un anticorpo monoclonale di coniglio nuovo, funziona particolarmente bene in entrambe le sezioni fisse congelati e paraffina del tratto gastrointestinale.
Kit è espresso in diversi altri tipi cellulari, tra cui i melanociti, cellule ematopoietiche, cellule germinali e, in particolare mastociti, che si trovano anche nel tratto GI. Fortunatamente, le cellule si trovano la maggior parte dell'albero è la mucosa e non nella muscolare. Colorazione doppia con coniglio anti-topo Ano1 e anti-kit in grado di eliminare marcatura non specifica di ciascun anticorpo (Figura 4). E 'anche interessante notare che l'espressione relativa di kit e Ano1 tra sottoclassi di ICC sembra diverso. Per esempio, nel piccolo intestino, la colorazione Kit è molto più intensa in mioenterico ICC rispetto al CPI del muscolo plesso profondo mentre Ano1 colorazione è comparabile.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute (K08CA140946, a YC), (5F32CA130372, per PC), (R01CA102774 e R01HL055748 a PB), il Dipartimento della Difesa (PC094302 a YC), il Fondo Famiglia Shuman per la Ricerca GIST (a PC), e il Consorzio Cancro Starr (per PC, YC, CLS e PB). Vorremmo ringraziare Katia Manova, Fan Ning, e Mesurh Turkekul della struttura molecolare di base MSKCC Citologia aiuto per criosezionamento e immunocolorazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane Labs | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling Technology | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher Scientific | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | BD Biosciences | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
References
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