Kararlı İzotop Standartlar ve Anti-Peptid Antikorlar (SISCAPA) kendi proteinler için vekilleri olarak peptidler kantitatif ölçüm sağlamak için kararlı izotop dilüsyon kütle spektrometresi (MRM-MS) ile peptitler çiftler yakınlık zenginleştirme yakalayın. Burada kısmen otomatik bir biçimde manyetik parçacıklar kullanarak protokol açıklar.
Proteinlerin ölçümünde kantitatif testleri için büyük bir ihtiyaç vardır. Ölçümde büyük ölçüde altın standart olarak kabul Geleneksel sandviç immunoassay, yüksek maliyetli, uzun teslim süresi ile ilişkilidir ve sakıncaları (örneğin antikorlar, otoantikor girişim, 'kanca etkisi') ile doludur. 1 alternatif bir tekniktir zenginleştirme yakınlığına . peptidlerin kantitatif kütle spektrometresi ile birleştiğinde, genellikle SISCAPA (Anti-Peptid Antikorlar Kararlı İzotop Standartları ve Capture) olarak adlandırılan bu teknikte 2 / çoklu seçilen reaksiyon izleme kütle spektrometresi ile stabil izotop seyreltme ve algılama ile peptitler afinite zenginleştirme ( SRM / MRM-MS), peptidler, kendi proteinler vekilleri olarak kantitatif ölçüm sağlar. SRM / MRM-MS, küçük moleküllerin 3, 4 doğru kantitatif için kurulan ve daha yakın zamanda, plazma ve hücre lizatları proteinlerinin düzeyini ölçmek için adapte edilmiştir. Proteinlerin kantitatif ulaşmak için 5-7, bu büyük moleküllerin sindirilir bileşeni peptidler gibi tripsin gibi bir enzim kullanarak. Dizisi bu türün hedef protein (yani "proteotypic" peptitler) özgü bir veya daha fazla seçilmiş peptidler daha sonra anti-peptid antikorları kullanarak örnek zenginleştirilmiş ve kantitatif stokiyometrik vekilleri örnek protein konsantrasyonu olarak ölçülür. Bu nedenle, stabil izotop seyreltme (SID) yöntemleri (yani bir çivili-peptid standart etiketli stabil izotop), SRM / MRM karmaşık biyolojik matrisler proteinlerin ölçümü için vekilleri gibi proteotypic peptidlerin konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılan olabilir. Akuple Deneyleri geleneksel immunoassay göre bazı avantajları vardır. Reaktifler oluşturmak için nispeten daha az pahalı, özgüllüğü analit için mükemmel, testlerin son derece çoğullanır zenginleştirme düzgün plazma (tükenmesi gerekli) yapılan ve tekniği, proteinler ya da değişiklikler geniş bir yelpazeye uygun olabilir bir manyetik boncuk platformuna adapte olarak bu video ilgi. 8-13 temel protokol göstermektedir.
Tarif edildiği gibi, protokolde en kritik adım boncuk kuluçka dönemi boyunca iyi karıştırılmış kalır sağlanmasıdır. Boncuk iyi / flakon altına yerleşmek için izin artan değişkenlik neden olacaktır. Aynı zamanda önemli bir kuluçka dönemi sonrasında iyi / flakon üstüne kalır herhangi bir sıvı aşağı spin. Tekrarlanabilir tripsin sindirim da önemlidir. Ancak, sindirim muhtemel alternatif yöntemleri, belirli bir hedef proteinlerin için optimize edilmiş olabilir 15 Elüsyon ücretsiz antikor tespiti ile karışmaz; sindirim için prosedür SISCAPA ile birlikte laboratuvarda yaygın olarak kullanılmıştır Burada anlatılan antikor peptidler daha sonra sütun veya elutes hariç, ama antikor büyük deneylerde ya da serbest antikor varsa afinite zenginleştirme önce Protein G boncuk çapraz olabilir çünkü büyük olasılıkla peptid, bir sorun olur. Biz de herhangi bir kalıntı boncuk veya parçacıklar kaldırmak için örnek otosampler plakası gibi, akış ters yönde tuzak sütun yıkama altında bir mıknatıs (yükleme karşılaştırıldığında) yerleştirmek için yararlı bulduk. Açıklanan manyetik boncuk yaklaşıma ek olarak, tekniği de bir sütun biçiminde (yani afinite kromatografisi) adapte olabilir 12, 16
Kullanıcı genel bir protokol ile rahat sonra, bu teknik, aynı zamanda genel analiz geliştirmek bazı değişiklikler için uygun. İlk 11, birden fazla analitler zenginleştirme adım (yani çoklama) antikorlar birleştirerek tek bir tahlil analiz etmek mümkündür. Kütle spektrometresi, aynı anda çok sayıda analitlerin analiz yeteneğine sahiptir. İkinci olarak, orijinal örnek hacminin artırılması testin duyarlılığını artırır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NCI Klinik Proteomik Teknoloji Değerlendirme Merkezi (CPTAC) hibe (# U24 CA126476) yanı sıra Eğlence Endüstrisi Vakfı (EIF) ve AYF Kadınlar Kullanıcı Kanser Araştırma Fonu Meme Kanseri Biyomarker Discovery Konsorsiyumu bir hibe tarafından finanse edilen, ve oldu Keck Vakfı, Kanarya Vakfı, Paul G. Allen Aile Vakfı cömert hediyeler.
Name of the material | Company | Catalogue number |
---|---|---|
1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 |
Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 |
Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific | 97002540 |
Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 |
Foil cover for 96 well plate | Excelscientific | 12-169 |
Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen | 521-01-151 |
X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 |
Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific | HSP 9601 |
Table 1: Materials
Name of the material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Urea | Sigma Aldrich | U6031 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Dithiothreitol (DTT) | Pierce | 20291 | “no-weigh dithiothreitol” |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I1149 | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | L5401 | |
CHAPS | Thermo Fisher Scientific | 28300 | |
Formic acid | EMD | 11670 | |
Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific | A998-1 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 242853 |
Table 2: Reagents
Solution | Comments (optional) |
---|---|
100 mM Tris pH 8 | |
9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
Stable isotope standard mastermix | |
Anti-peptide antibody mastermix |
Table 3: Solutions to be prepared