Normes des isotopes stables et capture par anticorps anti-peptide (SISCAPA) l'enrichissement affinités couples de peptides avec des isotopes stables de dilution spectrométrie de masse (MRM-MS) pour fournir une mesure quantitative des peptides comme substituts pour leurs protéines respectives. Nous décrivons ici le protocole en utilisant des particules magnétiques dans un format partiellement automatisés.
Il ya un grand besoin pour des analyses quantitatives pour mesurer les protéines. Immunoessais traditionnels sandwichs, largement considéré comme l'étalon-or dans la quantification, sont associées à un coût élevé, de longs délais, et sont pleines de défauts (par exemple, les anticorps hétérophiles, l'interférence des autoanticorps, «effet crochet»). 1 Une technique alternative est l'enrichissement affinités de peptides couplée à la spectrométrie de masse quantitative, communément appelé SISCAPA (Normes des isotopes stables et capture par anticorps anti-peptide). 2 Dans cette technique, l'enrichissement d'affinité de peptides avec une dilution d'isotopes stables et la détection par sélectionnée / multiples réactions de surveillance spectrométrie de masse ( MRS / MRM-MS) fournit une mesure quantitative de peptides en tant que substituts pour leurs protéines respectives. MRS / MRM-MS est bien établie pour la quantification précise de petites molécules 3, 4 et, plus récemment, a été adapté pour mesurer les concentrations de protéines dans le plasma et les lysats cellulaires. 5-7 Pour réaliser la quantification des protéines, ces molécules plus grosses sont digérés peptides composant en utilisant une enzyme comme la trypsine. Un ou plusieurs peptides sélectionnés dont la séquence est unique à la protéine cible de cette espèce (ie "protéotypiques" peptides) sont ensuite enrichies de l'échantillon en utilisant des anticorps anti-peptide et mesurés comme substituts stoechiométrique quantitatifs pour la concentration de protéines dans l'échantillon. Ainsi, couplée à une dilution des isotopes stables (SID) méthodes (c'est à dire un dopés en isotopes stables peptide marqué standard), le SRM / MRM peuvent être utilisés pour mesurer les concentrations de peptides protéotypiques comme substituts pour la quantification des protéines dans des matrices biologiques complexes. Les tests ont plusieurs avantages par rapport aux immunoessais traditionnels. Les réactifs sont relativement moins chers à produire, la spécificité de l'analyte est excellent, les dosages peuvent être fortement multiplexé, l'enrichissement peut être réalisé à partir du plasma soigné (pas de déplétion requis), et la technique se prête à un large éventail de protéines ou des modifications d'intérêt. 8-13 Dans cette vidéo, nous démontrons que le protocole de base adaptée à une plate-forme bille magnétique.
L'étape la plus critique dans le protocole tel que décrit est d'assurer les perles restent bien mélangé pendant la période d'incubation. Permettre aux billes de se déposer au fond du puits / flacon se traduira par une variabilité accrue. Il est également important de spin-down tout liquide qui peut rester sur le haut du puits / flacon après la période d'incubation. Digestion par la trypsine reproductible est également critique. La procédure pour la digestion décrit ici a été largement utilisée dans notre laboratoire en collaboration avec SISCAPA; cependant, il est susceptible de méthodes alternatives de la digestion pourrait être optimisée pour un ensemble donné de protéines cibles 15 élution de l'anticorps libre ne pas interférer avec la détection de l'. peptide, probablement parce que l'anticorps est exclu de la colonne ou élue au plus tard les peptides, mais les anticorps peuvent être réticulés aux billes protéines G avant l'enrichissement d'affinité dans des expériences importantes ou si anticorps libre devient un problème. Nous avons également jugé utile de placer un aimant en dessous de la plaque d'échantillon sur le passeur d'échantillons ainsi que le lavage de la colonne piège dans le sens inverse du flux (par rapport au chargement) pour éliminer toutes les billes ou des particules résiduelles. En plus de l'approche décrite par billes magnétiques, la technique peut également être adapté à un format de colonne (ie la chromatographie d'affinité). 12, 16
Une fois que l'utilisateur est à l'aise avec le protocole général, la technique est également prête à plusieurs modifications qui améliorent le dosage global. 11 Premièrement, il est possible d'analyser des analytes multiples dans un seul test en combinant les anticorps dans l'étape d'enrichissement (multiplexage par exemple). Le spectromètre de masse est capable de analysant simultanément un grand nombre d'analytes. Deuxièmement, l'augmentation du volume de l'échantillon original améliore la sensibilité du dosage.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par le NCI clinique protéomique Technology Assessment Center (CPTAC) subvention (# U24 CA126476) ainsi que d'une subvention de l'industrie du divertissement de la Fondation (FEI) et le Fonds des femmes FEI recherche sur le cancer au Consortium du cancer du sein découverte de biomarqueurs, et dons généreux de la Fondation Keck, la Fondation des Canaries, et le Paul G. Allen Family Foundation.
Name of the material | Company | Catalogue number |
---|---|---|
1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 |
Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 |
Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific | 97002540 |
Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 |
Foil cover for 96 well plate | Excelscientific | 12-169 |
Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen | 521-01-151 |
X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 |
Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific | HSP 9601 |
Table 1: Materials
Name of the material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Urea | Sigma Aldrich | U6031 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Dithiothreitol (DTT) | Pierce | 20291 | “no-weigh dithiothreitol” |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I1149 | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | L5401 | |
CHAPS | Thermo Fisher Scientific | 28300 | |
Formic acid | EMD | 11670 | |
Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific | A998-1 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 242853 |
Table 2: Reagents
Solution | Comments (optional) |
---|---|
100 mM Tris pH 8 | |
9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
Stable isotope standard mastermix | |
Anti-peptide antibody mastermix |
Table 3: Solutions to be prepared