Summary
安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM - MS）を有するペプチドの結合親和性の濃縮をキャプチャします。ここでは、部分的に自動化された形式で磁性粒子を使用してプロトコルを記述する。
Abstract
タンパク質の測定で定量的なアッセイのための大きい必要性がある。主に定量のゴールドスタンダードと考えられ、伝統的なサンドイッチイムノアッセイは、、高コスト、長いリードタイム、および欠点（例えば異好性抗体、自己抗体干渉、"フック効果"）をはらんでいるに関連付けられています。1の代替テクニックは、親和性の濃縮です。定量的質量分析法と相まってペプチドから、一般的にSISCAPA（抗ペプチド抗体による安定同位体の標準とキャプチャ）と呼ばれる。このテクニック2、複数の/選択反応モニタリング質量分析法による安定同位体希釈や検出を有するペプチドの親和性の濃縮は、（ SRM / MRM - MS）は 、それぞれのタンパク質のための代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供します。 SRM / MRM - MSがよく低分子化合物3、4の正確な定量のために確立されており、最近では血漿と細胞ライセート中のタンパク質の濃度を測定するために適応されています。タンパク質の定量を達成するために5-7、これらのより大きな分子はに消化されていますトリプシンなどの酵素を使用して、コンポーネントのペプチド。その配列はその種の標的タンパク質（すなわち"proteotypic"ペプチド）に固有の一つ以上の選択されたペプチドは、抗ペプチド抗体を用いて試料から濃縮およびサンプル中のタンパク質濃度の定量的な化学量論の代理として測定されます。したがって、安定同位体希釈（SID）の方法（すなわちスパイクインのペプチド標準ラベル安定同位体）に結合、SRM / MRMは、複雑な生体マトリックス中のタンパク質の定量のための代理としてproteotypicペプチドの濃度を測定するために使用することができます。アッセイは、従来のイムノアッセイに比べていくつかの利点があります。試薬が生成するために比較的安価な、分析物に対する特異性が優れている、アッセイは、高度に多重化、濃縮は、きちんとした血漿（ない枯渇が不要）から実行、および技術は、タンパク質や改造の広い配列に従順であることができることができます。興味深い。8-13このビデオでは、磁気ビーズのプラットフォームに適応としての基本的なプロトコルを示しています。
Protocol
実験方法：
アッセイは、合成ペプチドおよび抗ペプチド抗体を必要とします。選択されたペプチドは、目的のタンパク質に固有のものでなければ、8〜22アミノ酸を含む、および既知の翻訳後修飾を持たせるべきではありません。メチオニン残基は一般的に回避し、二塩基性アミノ酸（例えば（株）、KR、RR）を含むペプチドは望ましくないされています。この手法の場合、それは、ペプチドのC末端（すなわち、KまたはRがラベル）で（13 Cおよび15 N）重い標識アミノ酸を組み込んだ、内部標準として安定同位体標識されたペプチドを使用するのが一般的です。
次のプロトコルは、Epitomics社（バーリンゲーム、カリフォルニア州）とニューイングランドペプチド（ガードナー、MA）から合成ペプチドから得られた抗ペプチド抗体を用いて、マウスのタンパク質オステオポンチンからペプチドGDSLAYGLRを測定するために開発されたアッセイを説明します。 1）ペプチド3の濃縮）質量分析法による分析、複雑なタンパク質混合物、2のトリプシン消化を）：プロトコルは、主に3つの手順（図1）で構成されています。それは、マウスオステオポンチン蛋白質を添加したヒト血漿サンプルで展示されます。
1。トリプシン酵素消化およびクリーンアップ
- 氷上で10μLきちんとした血漿のアリコートを解凍。
- BCAアッセイによる総タンパク質濃度を決定し、任意の懸濁物質を除去するためにサンプルを遠心してください。
- その蓄積管から1000μLディープウェルプレートとピアス可能なフィルムでカバーにピペット10μL分注し。
- 各サンプルに新鮮9M尿素/ 30mMのジチオスレイトール（DTT）（最終濃度6Mの尿素/ 20mMのDTT）の20μLを追加。
- 37℃で30分間インキュベート℃に
- 各サンプルに新鮮な500mMのヨードアセトアミド（最終IAM 50mm）を3μLを加える。
- 、暗所、室温で30分間インキュベートする。
- 100mMのトリス（pH 8）（〜0.6Mに希釈するの尿素）257μLを加える。
- トリプシンストック溶液（;：基板の比1:50酵素のための1μg/μL）を10μLを加える。
- インキュベート37 ° Cで一晩（12〜16時間）。
- きちんとしたギ酸（終濃度1％）の3μLを加える。
- 安定同位体の標準を（多重化アッセイを行う場合は、複数の規格が追加され、通常、これは標準的な同位体標識されたペプチドの10μLを含む50〜100 fmolの程度）に追加します。
- 80％のアセトニトリル、廃棄フロースルーの0.1％ギ酸500μLを加えオアシスカートリッジのプレートを洗浄してください。この3回繰り返します。
- 水中0.1％ギ酸500μLを加えることによってカートリッジのプレートを平衡化し、フロースルーを捨てる。この4回繰り返します。
- カートリッジのプレートにダイジェストのサンプルをロードし、流れが非常に遅いですので、真空を調整する。
- 水中0.1％ギ酸500μLで洗浄し、フロースルーを捨てます。この3回繰り返します。
- 1000μlのディープウェルプレート（フロースルーを破棄しない）に80％アセトニトリルの0.1％ギ酸の2 × 500μLを添加することにより溶出するペプチド。
- 乾燥するまで（またはspeedvac）溶出液を凍結乾燥。 （凍結乾燥が好ましい方法です）
- 再構成するには、50μLPBS +0.03％CHAPSを添加することによりペプチドを乾燥させた。
2。ペプチドのイムノアフィニティー濃縮
- 標準的なキングフィッシャー96ウェルプレートにサンプルを移す。
- 1μgの抗体とターゲットごとに1.5μLプロテイン- G被覆磁性ビーズを（それが前の加算にビーズに抗体を架橋するためのオプションです）を追加します。ビーズをよく振ったり、ボルテックスで中断されていることを確認します。
- 箔でプレートをカバーしています。
- 穏やかにビーズが中断されるように転倒して（12〜16時間）一晩インキュベートする。
- 箔の表面から液体を除去するために5秒間に32 × gでプレートを遠心する。
- ホイルカバーを取り外します。
- ビーズの洗浄および溶出は、手動または自動化された方法で行うことができます。この手順では、カワセミのプラットフォーム上で自動化手順を説明します。
- 200μLのPBS +0.03％CHAPS（洗浄あたり1分）でビーズを2回洗浄する。
- PBS 200μLの1:10希釈液+ 0.03％CHAPS（1分）でビーズには1回洗浄する。
- ペプチドは、5％酢酸+ 0.03％CHAPS、25 uLのに溶出されます。
- 磁石で溶出プレートを配置し、残りのビーズを転送しないように注意しながら、96ウェルプレートに溶出液を移す。
- シーリングマットとプレートをカバーしています。
- 溶出液を含有するプレートは、分析のためのトリプル四重質量分析計に配信されます。
3。マルチプルリアクションモニタリングによる分析 - 質量分析
- SRM / MRM分析のための遷移は0.5μL/ minで質量分析計に30％アセトニトリル％ギ酸でペプチド標準のマイクロリットルのソリューションごとに1ピコモルを導入することで、選択して最適化することができます。安定した噴霧が得られれば、MS / MSスペクトルを収集する。
- 遷移は、THREを識別することにより、MS / MSスペクトルから選択されています電子ノイズの少ないスペクトルの領域において豊富なフラグメントイオン。多価ペプチドイオンの場合、y -イオンのフラグメントは、m /でdetected Z>前駆体のm / zは、通常、SRM / MRMアッセイの開発に最適です。 図2に示す476.3 MS / MSスペクトルと、選択された遷移ions> 508.3、579.3 、ペプチドGDSLAYGLR用692.4（重い安定同位体標準481.3の遷移が> 518.3、589.3、702.4示されていない）。
- 使用される質量分析装置の製造元とモデルに応じて、各遷移に合わせて最適化できる複数のパラメータがあります。ここでは、衝突エネルギーをランピングし、信号のレベルを監視することによって、各選択された遷移の衝突エネルギーを最適化。 25の衝突エネルギーは、それぞれの移行のために使用されていました。
- 次のように簡潔に、SRM / MRM分析のための一般的な構成は、次のとおりです。移動相（）0.1％ギ酸、（B）90％アセトニトリル/ 0.1％ギ酸、0.3 × 5mmのC18トラップカラム、内径75μmx 15 cmのC18分析カラム（Reprosil - PUR C18 AQ、120 °の細孔）。注入量は10μLで、サンプルは、総流量3μL/分で3％Bで5分間、ロードされ、3からの直線勾配により溶出される - 300で45％のB - 10分400 NL /分。 4000 QTRAP（ABSCIEX、フォスターシティー、CA）上の条件は、スプレー電圧2.3kV、イオン源温度150℃、12 GS1、およびカーテンガス15人。
- サンプルは、サンプルの10μLを注入することにより、SRM / MRMで分析される。ピーク面積は、プログラムのスカイラインを使って光と重いペプチドのために統合されています。14はこのケースでは、バックグラウンドノイズのない最も豊富なトランジションを使用して各サンプル中の非標識/標識ペプチドのピーク面積比（PAR）、Y5の移行を計算する（光ペプチド476.3> 579.3、重い標準ペプチド481.3> 589.3）。
4。代表的な結果：
測定されたピーク面積比（スパイク重い同位体標識されたペプチドに光内因性ペプチドの相対的な）ターゲットペプチドの定量的尺度を提供する。 図3は、SISCAPA -濃縮試料中の軽鎖および重ペプチドの例のクロマトグラムを示しています。同じ時間と複数の遷移で光と重いペプチドの溶出が身元を確認するために、各ペプチドのために監視することができることに注意してください。
図1。SISCAPAプロセスの概要図。複雑なタンパク質混合物は、ペプチドに消化される。標的ペプチドの分析対象物（内因性の分析対象とスパイク安定同位体標識内部標準）は、プロテインG -コートされた磁性粒子に固定化された抗ペプチド抗体を用いて濃縮される。単離後、標的ペプチドは磁性粒子から溶出され、内部標準に対する相対定量用質量分析法により分析した。
図2。SRM / MRMトランジションのための3つのフラグメントの選択を示すペプチドGDSLAYGLRのMS / MSスペクトル。
図3。光ペプチドの分析物のピークプロファイル（赤）と重い安定同位体標識内部標準（青）を示す例のクロマトグラム。彼らは、クロマトグラフィーシステムから溶出としてY5光ペプチド（476.3> 579.3）からの移行と標準（481.3> 589.3）というラベルの付いた重い安定同位体のクロマトグラムは、時間の経過とともにプロットされます。
Discussion
として記述されているプロトコルの中で最も重要なステップは、ビーズが潜伏期間中によく混合のまま確保しています。ビーズがうまく/バイアルの底に沈降を許可すると、増加変動が発生します。それは潜伏期間の後にも/バイアルの上に残っている可能性のある液体を、スピンダウンすることも重要です。再現性のトリプシン消化も重要です。消化ここで説明する手順は、SISCAPAと一緒に私たちの研究室で広く利用されているが、それはおそらく消化の代替方法は、標的タンパク質の特定のセットに対して最適化することができますされ遊離抗体の15溶出がの検出を妨害しない。抗体は後でペプチドよりも列または溶出から除外されますが、抗体が前に大規模な実験でまたは遊離の抗体であれば親和性の濃縮にプロテインGビーズに架橋することができますので、可能性ペプチドは、問題となる。我々はまた、任意の残留ビーズまたは粒子を除去するために流れの逆方向（ローディングに比べて）でトラップカラムを洗浄するだけでなく、オートサンプラーでサンプルプレート下の磁石を配置することが有用な発見した。に記載の磁気ビーズのアプローチに加えて、技術はまた、列の形式（すなわちアフィニティークロマトグラフィー）に適合させることができます。12、16
ユーザーは、全体的なプロトコルと快適になると、技術はまた、全体的な分析を強化するいくつかの修正に適している。最初の11は 、それが濃縮ステップ（すなわち多重化）の抗体を組み合わせることにより、単一のアッセイで多検体を分析することが可能です。質量分析計は同時に分析対象物質の大量の分析が可能です。第二に、元のサンプルの音量を大きくすると、アッセイの感度を向上させます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NCI臨床プロテオミクス技術評価センター（CPTAC）助成金（＃U24 CA126476）だけでなく、娯楽産業財団（EIF）とEIFの女性の癌研究基金から乳がんのバイオマーカー探索コンソーシアムへの助成金によって賄われて、とされケック財団、カナリー財団、およびポールG.アレンファミリー財団からの寛大な贈り物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 | |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 | |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Foil cover for 96 well plate | Excel Scientific | 12-169 | |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| Table 1: Materials | |||
| Urea | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "no-weigh dithiothreitol" |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| Formic acid | EMD Millipore | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Table 2: Reagents | |||
| 100 mM Tris pH 8 | |||
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Stable isotope standard mastermix | |||
| Anti-peptide antibody mastermix | |||
| Table 3: Solutions to be prepared | |||
References
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