Summary
En utilisant la PCR quantitative, nous montrons comment le bien-établie chiches CAM modèle peut être utilisé pour analyser quantitativement la métastase des cellules tumorales humaines à des organes éloignés.
Abstract
Pendant la métastase des cellules cancéreuses de diffuser de la tumeur primaire, envahissent les tissus environnants, et se propage à des organes éloignés. Métastase est un processus complexe qui peut impliquer de nombreux types de tissus, des périodes de durée de temps variable, et se produisent souvent dans les organes profonds, il est difficile d'enquêter et de quantifier. En outre, l'efficacité du processus métastatique est influencé par de multiples étapes de la cascade métastatique qui rend difficile d'évaluer la contribution d'un seul aspect du comportement des cellules tumorales. En conséquence, les essais métastases sont fréquemment effectuées sur des animaux pour fournir un contexte forcément réaliste dans lequel l'étude des métastases. Malheureusement, ces modèles sont encore compliquées par leur physiologie complexe. L'embryon de poulet est un unique modèle in vivo qui permet de surmonter de nombreuses limites à l'étude de la métastase, en raison de l'accessibilité de la membrane chorio (CAM), un bien vascularisé extra-embryonnaires tissus situés au-dessous de la coquille qui est réceptif à la xénogreffe de cellules tumorales (figure 1). En outre, depuis l'embryon de poulet est naturellement immunodéficientes, le CAM soutient aisément la prise de greffe de tissus normaux et tumoraux. Surtout, le CAM aviaire soutient avec succès la plupart des caractéristiques des cellules du cancer, y compris la croissance, l'invasion, l'angiogenèse et de remodelage du microenvironnement. Cela rend le modèle particulièrement utile pour l'enquête sur les voies qui mènent à la métastase du cancer et de prédire la réponse d'un cancer métastatique de nouveaux agents thérapeutiques potentiels. La détection de cellules disséminées par les espèces-PCR spécifique Alu permet d'évaluer quantitativement les métastases dans des organes qui sont colonisés par aussi peu que 25 cellules. Utilisation de la ligne homme carcinome épidermoïde cellule (HEp3), nous utilisons ce modèle pour analyser la métastase spontanée des cellules cancéreuses à des organes éloignés, y compris le foie de poulet et du poumon. Par ailleurs, en utilisant le protocole Alu-PCR, nous démontrons la sensibilité et la reproductibilité de l'essai comme un outil pour analyser et quantifier intravasation, l'arrestation, l'extravasation, et la colonisation comme des éléments individuels de la métastase.
Protocol
1. Préparer les oeufs pour xénogreffe (métastase spontanée)
- Fraîchement pondus des oeufs de poule fertilisés sont incubés dans un incubateur à tourner pendant 10 jours à 100 ° F et 60% d'humidité. Les oeufs sont tournés quatre fois par heure.
- Le jour de développement 10 les oeufs sont placés sur le côté dans un rack d'oeuf. Une source de lumière en col de cygne de la lampe ou autre matériau approprié est utilisé pour les oeufs bougie en faisant la lumière dans la coquille de l'oeuf à l'extrémité émoussée de l'œuf où les sacs aériens se trouve.
- La veine chorio est localisé et marqué. Cette veine est située au sommet de la coquille où il est la jonction de plusieurs gros vaisseaux sanguins. A ce point de ramification du vaisseau sanguin descend, loin de la CAM et accorde à l'embryon. Une boîte carrée de 1 cm est dessiné avec un crayon sur la coquille d'environ 1 cm loin du point de ramification de la veine. La région, y compris et autour de la place est ensuite nettoyé avec un coton-tige imbibé d'iode.
- En utilisant un outil de coupe rotatif (Dremel) équipé d'une pierre de broyage en carbure de silicium (partie # 84922 Dremel) un trou est percé dans l'extrémité émoussée de l'œuf dans le sac d'air. L'utilisation de ce même outil un trou est percé dans le carré préalablement dessiné au-dessus de l'œuf, s'arrêtant de la membrane coquille. Une aiguille de la seringue de calibre 25 avec une fraise bien sur la fin est utilisé pour faire un petit trou dans la membrane coquille en faisant attention de ne pas déchirer le sous-jacentes CAM. Le CAM est ensuite détaché de la membrane coquille dans le domaine de la place en utilisant une aspiration douce créé avec une aide pipette automatique équipé d'un morceau de ¼ "tube Tygon placé contre le trou dans le sacs aériens. En appliquant aspiration, une poche d'air devrait-dessous du trou dans le carré qui signifie que la CAM a été abandonné avec succès loin de la coquille. Après la CAM est tombé, le trou dans le sac d'air et le trou situé sur la place près de la veine chorio est scellé avec un morceau de ruban de laboratoire bande. Les œufs sont ensuite placés dans un incubateur à stationnaires à 100 ° F et 60% d'humidité dans l'attente de la greffe des cellules tumorales. Voir figure 1 pour une représentation séquentielle.
2. Préparer les oeufs pour injection intraveineuse (métastases expérimentales)
- Fraîchement pondus des oeufs de poule fertilisés sont incubés dans un incubateur à tourner pendant 12 jours à 100 ° F et 60% d'humidité. Les oeufs sont tournés quatre fois par heure.
- Le jour de développement 12 les oeufs sont placés sur le côté dans un rack d'oeuf. Une source de lumière en col de cygne de la lampe ou autre matériau approprié est utilisé pour les oeufs bougie en faisant la lumière dans la coquille de l'oeuf à l'extrémité émoussée de l'œuf où les sacs aériens se trouve.
- La veine chorio est localisé et marqué. Un rectangle de 1 cm par 0,5 cm est dessiné au crayon sur la coquille de l'oeuf directement au-dessus de la veine. La région, y compris et autour de la place est ensuite nettoyé avec un coton-tige imbibé d'iode.
- Une petite fenêtre est créée dans la coquille de l'oeuf à l'emplacement établi en utilisant le foret Dremmel (# 118). La fenêtre est enlevée pour exposer la membrane sous-jacente coquille qui est ensuite rendu transparent avec goutte d'huile minérale. Voir la figure 5A pour une représentation graphique.
- À ce point, le trou dans le sac d'air et le trou situé sur la place près de la veine chorio est scellé avec un morceau de ruban de laboratoire bande. Les œufs sont ensuite placés dans un incubateur à stationnaires 100 ° F et une humidité de 60% dans l'anticipation de l'injection des cellules tumorales.
3. Préparer les cellules tumorales pour la greffe ou injection.
- Pour xénogreffe, les cellules tumorales sont détachés de leurs boîtes de culture à l'aide de trypsine / EDTA et lavée avec 10 volumes de tampon phosphate salin (PBS) afin de retirer tous les supports résiduelle, la trypsine, ou de l'EDTA.
- Pour une injection IV, les cellules cultivées sont détachées à l'aide de cellules-dissociation non enzymatique solution, et lavé avec du DMEM sans sérum. et)
- Les cellules sont comptées avec un hématimètre et resuspendues dans du PBS à 10-40 millions de cellules / ml pour le greffage, ou bien remises en suspension dans du DMEM sans sérum à 1 millions de cellules / ml pour injection intraveineuse.
4. La greffe des cellules tumorales sur le nouvellement exposées CAM (métastase spontanée)
- Les œufs sont retirés de l'incubateur et une petite fenêtre est coupé à l'emplacement de la place préalablement établie, où la poche d'air nouveau s'est formé. Ceci est plus facile à faire avec un outil rotatif équipé d'une roue de coupe (outil Dremel avec le # 409 roue de coupe circulaire). Une paire de pinces à bec pince est utilisée pour enlever la petite section de coquille d'oeuf et d'exposer la CAM sous-jacent.
- L'utilisation d'un coton-tige (marque Fisher # 23-400-001) le CAM est abrasé 5 fois. Un peu de sang devrait être évident sur le coton. Immédiatement après avoir endommagé la CAM, 25 pi de la suspension cellulaire est placée sur la zone endommagée. Le nombre optimal de cellules est déterminé empirically mais peut varier de 5 à 1X10 0.5x10 6. La fenêtre dans l'œuf est scellé hermétiquement avec du ruban adhésif et les poussins sont laissé au repos pendant 10-15 minutes, afin de permettre aux cellules de s'installer. Après 15 minutes les œufs sont retournés à l'arrêt incubateur.
- Les tumeurs sont autorisés à cultiver pendant 5-8 jours, selon l'application spécifique et la nature de la lignée de cellules tumorales utilisées. Voir figure 1 pour une représentation séquentielle.
5. L'injection intraveineuse de cellules tumorales (métastases expérimentales)
- En utilisant une jauge de 30 100 pi d'insuline seringue de suspension cellulaire est injectée dans la veine allantoïdienne d'embryons, les oeufs ont été retournés à un arrêt incubateur et est resté là pendant une 1-7 jours supplémentaires.
- À des moments distincts, les poumons ou la came inférieure sont récoltées de chaque embryon et traités pour la détection des cellules tumorales, comme décrit ci-dessous.
6. Récolte des tumeurs et les tissus de poussins
- Une zone de dissection est préparé. Le test détecte les cellules métastatiques par la quantification de l'ADN humain en utilisant une approche très sensible de PCR. Il est donc très important pour éviter la contamination avec de l'ADN exogène. Les dissections sont effectuées dans une zone dédiée et tout au long des dissections les outils sont nettoyés entre chaque animal. Afin de prévenir la contamination croisée de vos échantillons au long du processus de dissection trois ensembles distincts d'outils sont utilisés: un pour couper les oeufs, un jeu pour enlever la tumeur primaire et un jeu pour enlever les organes internes. En outre, les quatre conteneurs sont utilisés pour laver les séquentielle de rinçage des outils entre chaque animal. Dans la séquence de ces lavages sont: 1) l'eau bidistillée, 2) le double de l'eau distillée, 3) eau de javel, et 4) 70% d'éthanol.
- Les œufs sont retirés de l'incubateur et stationnaires placés sur la glace pendant 15 minutes pour anesthésier et euthanasier les animaux. Les fenêtres sont ouvertes telles que les tumeurs deviennent visibles. Ouverture des fenêtres plus grandes en supprimant certains de la coquille peut être nécessaire. Les tumeurs primaires sont réséquées de la CAM, pesé, et traitées pour l'histologie.
- Le poussin est retiré de la coquille en coupant la coquille radialement en deux moitiés égales. L'embryon est décanté de la coquille couper et transféré à un côté propre poids maternel bateau jusqu'à. L'animal est disséqué avec l'aide d'une douce, propre jeu d'outils. L'animal est ouvert par incision du sternum. Une fois que l'embryon est ouvert, un morceau du foie à partir soit le lobe droit ou gauche sont collectées. Les organes internes sont ensuite retiré en tirant doucement sur l'oesophage attaché au gésier et couper les Visera qui relient les organes. Afin de recueillir les poumons couper la cage thoracique est ouverte, le plastron est séparé et le cœur est enlevé. A ce stade, il est possible de couper sur les quatre côtés du poumon (le sommet le plus proche à la tête du côté gauche le long de la cage thoracique, le fond près de la membrane et le côté droit le long de la trachée). Par souci de cohérence, le même poumon est recueillie dans chaque animal. Échantillons de tissus récoltés sont stockés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure ou peuvent être traitées immédiatement pour l'isolation d'ADN.
7. Isolement de l'ADN génomique et l'analyse quantitative par PCR
- L'ADN génomique est extrait à partir des tissus en utilisant les SYBR Green Extract-N-Amp tissus PCR Kit (Sigma-Aldrich catalogue XNATRG). L'ADN extrait peut être transféré dans un tube eppendorf propre et conservés à -20 ° C ou utilisé immédiatement. Il est important de diluer l'ADN 1:50 dans la nucléase eau libre avant de l'utiliser dans la réaction PCR subséquente. Alternativement, l'ADN peut être extrait en utilisant n'importe quel nombre de protocoles standard de l'extraction de l'ADN (Zijlstra et al., 2002).
- L'ADN humain est détectée dans les tissus de poussins à l'aide quantitative PCR spécifique pour les séquences Alu humaine. PCR quantitative en utilisant des amorces spécifiques Alu est réalisée en utilisant l'amplification SYBR vert du kit Exract-N-Amp. Le kit est livré avec une PCR mélange réactionnel contenant 2x SYBR green, tampon, des dNTP sels, la Taq polymérase et l'anticorps Jumpstart Taq. Le mélange réactionnel est constitué dans un volume final de 15μl, avec 0.4μM de chaque amorce. Pour la plupart des cas en utilisant l'ADN extrait dilué à 1:50 fournira des données quantitatives, cependant, la quantité optimale d'ADN matrice peut-être besoin d'être optimisé de façon empirique. Poulet amorces GAPDH sont utilisées comme contrôle interne La PCR est exécuté dans les conditions suivantes pour les séquences Alu: activation polymérase à 95 ° C pendant 2 min suivie de 30 cycles à 95 ° C pendant 30 s., 63 ° C pendant 30 s. , 72 ° C pendant 30 s. Les conditions de réaction pour le poulet GAPDH sont identiques à celles décrites pour Alu Cependant il peut être nécessaire de prolonger la PCR pour 40 cycles.
- L'analyse quantitative de la métastase est réalisée en utilisant la méthode ΔΔCt comparant des groupes expérimentaux à un groupe témoin (Schmittgen et Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). Alternativement, une courbe standard peuvent être générés en utilisant une série de dilution de cellules tumorales humaines extraites à l'aide du kit Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 2002). La signification statistique est évaluée en utilisant test t de Student ou l'analyse Anova des groupes témoins et expérimentaux.
8. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Le modèle de métastases d'embryon de poulet. A) Un schéma illustrant les quatre experts ont l'apparence du modèle en coupe transversale à des étapes clés: 1. Après 10 jours d'incubation. Le CAM a atteint presque la taille maximale. Les artères et les veines sont nettement visibles avec la veine allantoïdien positionnée contre le sommet de l'œuf. 2. L'œuf immédiatement après le forage de deux trous dans la coquille: l'un dans l'sacs aériens et un adjacent au point d'attache pour la veine allantoïdienne. 3. L'apparition, après un vide léger a été utilisé pour évacuer les sacs aériens et déposer la CAM. Les cellules tumorales (en bleu) sont appliqués à la CAM a chuté. 4. Après avoir laissé les cellules tumorales greffées à croître, la tumeur et des tissus de l'embryon de poulet sont récoltées pour analyse B) Une représentation de série du modèle: 1.. L'incubation des oeufs., 2. Marquage de l'emplacement de la veine allantoïdienne., 3. Percer des trous dans la coquille., 4. La chute du CAM., 5. Couper une ouverture pour la greffe des cellules tumorales., 6. En appliquant les cellules tumorales., 7. Refroidissement des œufs sur la glace avant de recueillir des tissus., 8. La récolte de la tumeur après 7 jours de croissance.
Figure 2. Histologie des tumeurs CAM. Tissus prélevés sur des membranes chorio portant une tumeur a été fixé dans le formol, sectionnées et traitées avec un trichrome. A) HEp3 tumeur après sept jours de croissance sur la CAM. B et C montrent des régions amplifiées de A montrant à la fois la tumeur et le stroma. D) les normales CAM.
Figure 3. L'analyse quantitative longitudinale des métastases. Variantes pour la tête et du cou avec un carcinome HEp3 la capacité métastatique haute ou basse (HEp3 M (High) et HEp3 M (basse), respectivement) ont été analysés pour leur capacité à diffuser à l'aide Alu PCR. Dix animaux ont été analysés à chaque point de temps pour la durée de 7 jours. Ces échantillons ont été quantifiés sur une courbe standard et par la suite exprimé comme # cells/50mg tissus.
Figure 4. L'inhibition de cellules métastase spontanée chez les animaux traités avec l'anticorps 1A5 métastases inhibant. Les tumeurs ont été formés en utilisant 5X10 5 HEp3 cellules appliquée à la CAM de la journée-10 embryons. Trois jours après l'application les cellules tumorales de la moitié des animaux ont été traités avec l'anticorps anti-CD151 1A5. Les poumons des animaux porteurs de tumeurs ont été récoltés deux jours plus tard et soumis à la PCR quantitative en temps réel alu. Inversement quantitative PCR en temps réel des chGAPDH a été utilisée pour confirmer la présence de quantités équivalentes d'ADN génomique hôte (La méthode ΔΔCt été utilisé pour comparer les deux groupes quantitativement (B).
Figure 5. Évaluer l'arrestation, la croissance et intravasation dans la cascade métastatique. Fondamentalement, une métastase d'un organe secondaire est défini par les contributions de trois aspects: l'arrestation, le taux de croissance, et le taux de intravasation. Ceux-ci peuvent être quantifiés en utilisant une combinaison de métastases expérimentales (A) et la métastase spontanée (B). En utilisant les métastases expérimentales (A) l'arrestation est défini comme le nombre de cellules détectées après l'injection 2h. Survie et croissance des cellules arrêtés est déterminé que la variation du nombre de cellules après injection de 24 heures. La croissance est défini comme le taux de prolifération pendant les jours 3-7. Intravasation est déterminée en utilisant la métastase spontanée (B) où le nombre de cellules intravasated est définie comme la charge de présenter le jour 7 métastatique qui excède la valeur prédite par la croissance du fardeau métastatique présents le jour 6.
Figure 6. L'expansion Visualisation de l'métastatique dans le CAM. HEp3 cellules exprimant la GFP ont été injectées par voie intraveineuse à 12 jours de développement. Au jour 1, 3 et 5 un œuf a été sacrifié et une section de la CAM a été imagées avec un microscope stéréo fluorescentes. Le fond vert sombre est créée par la coquille de l'oeuf, la vascularisation est visible sous forme de lignes noires, et les cellules tumorales sont visibles aussi brillante taches vertes.
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Discussion
Le CAM poussin a été utilisé pendant des décennies comme un système modèle pour étudier divers aspects de la biologie du cancer et la progression métastatique. Principe de l'évaluation des capacités métastatiques ont été réalisées dans ce modèle par une variété de groupes, y compris l'analyse de la dormance (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski et Reich, 1983), le remodelage tissulaire (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999), et les métastases (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. Il continue d'être un modèle très attrayant pour la biologie du cancer à cause de sa facilité d'utilisation, sa capacité à accepter les xénogreffes, et son faible coût (Chambers et al, 1982;. Chambers et al, 1990).. Utiliser humain spécifique basée Alu-PCR quantitative (Kim et al, 1998;.. Zijlstra et al, 2002), nous démontrons la capacité d'analyser la diffusion métastatique de la lignée de carcinome à cellules cpidermoid HEp3 (figure 3). En outre, nous démontrent l'utilité de cette technique dans l'évaluation de l'inhibition thérapeutique utilisant l'anticorps 1A5 métastases inhibitrice (figure 4, (Testa et al, 1999;. Zijlstra et al, 2008).).
En plus d'être en mesure d'évaluer la capacité métastatique et la réponse au traitement, ce modèle peut également être utilisé pour l'étude quantitative des composants individuels de la cascade métastatique (Zijlstra et al., 2002). En utilisant la métastase expérimentale par injection intraveineuse de cellules tumorales, ce modèle permet l'analyse de l'arrestation de cellules cancéreuses dans les organes secondaires et leur croissance ultérieure (figure 5A). Ce taux de croissance peut être utilisée pour prédire le fardeau métastatique dans un essai de métastases spontanées longitudinale (figure 5B). Intravasation est déterminée en utilisant la métastase spontanée (B) où le nombre de cellules intravasated est définie comme le fardeau de présenter métastatique au jour 7, moins la valeur prédite par la croissance de l'actuel fardeau métastatique au jour 6.
Comme une extension des techniques présentées ici, nous avons récemment développé de nouvelles stratégies de visualiser le comportement des cellules tumorales in vivo (Zijlstra et al, 2008.), Qui utilisent des nanoparticules marquées par fluorescence pour cibler le microenvironnement tumoral (Leong et al, 2010;. Lewis et al., 2006). Grâce à ces méthodes avancer, l'utilité de ce modèle peut être exploitée pour visualiser les changements complexes et dynamiques qui favorisent la survie, la création et la croissance des cellules tumorales. Ces technologies, couplé avec le coût relativement bas, la nature immunodéficientes, la facilité d'utilisation, et l'adaptabilité de la CAM chiches font de ce modèle précieux pour l'imagerie et l'analyse quantitative des métastases du cancer.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous voulons reconnaître Tyson Foods Inc généreusement offert des œufs fécondés. Shanna Arnold a joué pendant le tournage de ce protocole. Trenis Palmer a été soutenu par le National Institutes of Health dans le Prix Ruth L. Kirschstein National Research Service (F31 Institut national du cancer). Ce travail a été partiellement pris en charge par IRSCC Grant # 700537 à LDJ et le NIH / NCI octroi # CA120711-01A1-01A1 et CA120711 à AZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
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