Summary
정량 PCR을 사용하여, 우리는 잘 설립된 여자 CAM 모델이 양적 먼 기관으로 인간의 종양 세포의 전이를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
Abstract
전이 암 세포가 일차 종양에서 보급하는 동안, 주위 조직으로 침범하고, 멀리 떨어진 장기로 확산. 전이는 많은 조직 유형, 기간 변수 기간을 포함하고 자주 어려운 조사 수치 만들기, 장기 이내 깊은 발생할 수 복잡한 과정이다. 또한, 전이성 프로세스의 효능이 어려운 종양 세포 행동의 단일 측면의 기여를 평가하는 전이성 폭포의 여러 단계에 의해 영향을받습니다. 그 결과, 전이의 assays 자주 전이를 공부하는 반드시 현실 컨텍스트를 제공하기 위해 실험 동물에서 수행됩니다. 불행히도,이 모델은 더 이상 자신의 복잡한 생리학에 의해 복잡하게됩니다. 여자의 난자는 chorioallantoic 멤브레인 (CAM), 종양 세포의 xenografting에 수용되는 달걀 껍질 아래에있는 잘 vascularized 엑스트라 배아 조직의 접근으로 인해, 전이를 공부하는 많은 한계를 극복 생체내 모델에서 독특한 (그림 1). 또한, 여자는 배아가 자연스럽게 immunodeficient이기 때문에, CAM은 쉽게 정상과 종양 조직 모두의 engraftment을 지원합니다. 가장 중요한 조류 CAM 성공적으로 성장, 침공, angiogenesis, 그리고 microenvironment의 개조를 포함하여 대부분의 암 세포 특성을 지원합니다. 이것은 암 전이로 이어질 가능성과 새로운 치료제로 전이성 암의 반응을 예측하는 경로의 조사를 위해 모델이 매우 유용합니다. 종 특정 Alu PCR에 의해 전파 세포의 검출은 양적 25 세포처럼 몇 가지에 의해 식민지 아르 장기 전이를 평가하는 것이 가능합니다. 인간 표피 암종 세포 라인 (HEp3)를 사용하여 우리는 여자의 간, 폐를 포함하여 먼 장기에 암 세포의 자발적인 전이를 분석이 모델을 사용합니다. 또한, Alu - PCR 프로토콜을 사용 우리는 전이의 개별 요소 intravasation, 체포, 넘쳐 흐름, 그리고 식민을 분석하고 quantitate하는 도구로 감도와 분석의 재현성을 보여줍니다.
Protocol
1. xenografting 위해 달걀 (자발적인 전이)를 준비
- 갓 수정된 닭고기 달걀은 10 100 ° F에서 일 및 60 %의 습도에 대한 회전 배양기에 incubated 수 있습니다. 계란 4 번 각각의 시간을 회전하고 있습니다.
- 발달 10 일째에 계란은 계란 선반에 그들의 측면에 표시됩니다. 거위 목 램프 또는 기타 적합한 광원은 airsac가있는 계란의 뭉툭한 끝에 달걀 껍질에 빛을 빛나는하여 촛불 달걀을하는 데 사용됩니다.
- chorioallantoic 정맥이 위치하고 표시됩니다. 이 정맥은 그것이 몇 가지 큰 혈관의 교차점입니다 달걀 껍질의 상단에 위치하고 있습니다. 이 지점 시점에서 혈관은 CAM 멀리 아래로 방울 및 배아에 연결됩니다. 1cm 사각형 상자가 정맥의 분기점에서 약 1cm 떨어진 달걀 껍질에 연필로 그린 것입니다. 를 포함하고 광장 주변 지역은 다음 요오드에 배어 면봉을 사용하여 청소합니다.
- 실리콘 카바이드 숫돌 (Dremel 부분 # 84922) 구멍이 공기 색으로 계란의 뭉툭한 끝 통해 뚫고있다가 장착되어 회전 절삭 도구 (Dremel)를 사용합니다. 이 같은 도구를 사용하여 구멍은 달걀 껍질 막의 짧은 중지, 계란 위에 이전에 그려진 사각형 안에 뚫고있다. 끝에 훌륭한 버와 25 게이지 주사 바늘은 기본 CAM 찢어하지 않도록주의되는 달걀 껍질 막의 작은 구멍을 만드는 데 사용됩니다. CAM은 이후 airsac에있는 구멍에 대한 위치 ¼ "tygon 튜빙의 일부로 장착되어 자동 피펫 에이드로 만든 부드러운 흡입을 사용하여 사각형의 영역에 달걀 껍질 막의 분리이다. 흡입을 적용시, 공기 주머니는 광장에 구멍 아래 CAM이 성공적으로 달걀 껍질에서 멀리 떨어되었음을 나타내는 것입니다. CAM을 떨어뜨린 후, 공기 색과 chorioallantoic 정맥 근처 광장에있는 구멍에 구멍이 테이프 실험실 테이프 조각으로 봉인합니다. 달걀은 이후에 종양 세포를 접목의 기대에 100 ° F 60 %의 습도에서 고정 인큐베이터에 게재됩니다. 연속 묘사를 위해 그림 1을 참조하십시오.
2. 정맥 주사에 대한 계란을 준비하는 것은 (실험 전이)
- 갓 수정된 닭고기 달걀은 12 100 ° F에서 일 및 60 %의 습도에 대한 회전 배양기에 incubated 수 있습니다. 계란 4 번 각각의 시간을 회전하고 있습니다.
- 발달 일 12 계란은 계란 선반에 그들의 측면에 표시됩니다. 거위 목 램프 또는 기타 적합한 광원은 airsac가있는 계란의 뭉툭한 끝에 달걀 껍질에 빛을 빛나는하여 촛불 달걀을하는 데 사용됩니다.
- chorioallantoic 정맥이 위치하고 표시됩니다. 0.5 cm의 사각형으로 1cm 직접 정맥 위에 달걀 껍질에 연필로 그린 것입니다. 를 포함하고 광장 주변 지역은 다음 요오드에 배어 면봉을 사용하여 청소합니다.
- 작은 창이 Dremmel 드릴 비트를 (# 118)를 사용하여 그려진 위치에 달걀 껍질에 만들어집니다. 창이 이후 미네랄 오일 드롭과 투명 렌더링되는 기본 달걀 껍질 막을 폭로 제거됩니다. 그래픽 묘사에 대한 그림 5A를 참조하십시오.
- 이 시점에서 공기 색과 chorioallantoic 정맥 근처 광장에있는 구멍에 구멍이 테이프 실험실 테이프 조각으로 봉인합니다. 달걀은 이후에 종양 세포를 주사의 기대에 100 ° F 60 %의 습도에서 고정 인큐베이터에 게재됩니다.
3. 접목이나 사출에 대한 종양 세포를 준비.
- 잔여 미디어, 트립신, 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 제거하기 위해 xenografting 들어, 종양 세포는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 그들의 문화 요리로부터 분리되며 인산염의 10 볼륨 세탁 (PBS) 살린 버퍼.
- IV 주입 들어, 교양 세포는 nonenzymatic 셀 분리 솔루션을 사용하여 분리되며, 혈청이없는 DMEM로 세탁. 이상)
- 세포는 hemacytometer로 집계와 접목을 위해 10-40000000 세포 / ML에서 PBS에 resuspended하거나, 또는 IV 주입을위한 1,000,000 세포 / ML에서 혈청없는 DMEM에 resuspended 있습니다.
4. 새로 노출된 CAM (자연 전이)에 종양 세포를 접목
- 달걀은 인큐베이터에서 제거하고 작은 창이 새 공기 주머니가 형성되었습니다 이전에 그려진 사각형의 위치에서 절단합니다. 이것은 가장 쉽게 절단 휠 (# 409 원형 절단 휠과 Dremel 도구)이 장착된 회전 도구를 사용하여 이루어집니다. 바늘 코 포셉의 두 사람은 달걀 껍질의 작은 부분을 제거하고 기본 CAM을 폭로하는 데 사용됩니다.
- 목화 - 스쳐 작은 주걱을 (피셔 브랜드 # 23-400-001)를 사용하여 CAM은 5 번 abraded입니다. 약간의 피가 목화에 분명해야합니다. 즉시 CAM을 손상 후 세포 현탁액의 25μl가 손상된 영역에 배치됩니다. 세포의 최적의 숫자가 결정됩니다 Empirically하지만 0.5X10 5 1X10 6 범위하실 수 있습니다. 난자에 창문이 테이프로 단단히 밀봉하고 새끼는 세포가 정착 수 있도록 10~15분에 대해 서 남아 있습니다. 십오분 후 달걀이 정지 인큐베이터에 반환됩니다.
- 종양은 특정 응용 프로그램과 사용하는 종양 세포주의 특성에 따라 5-8일에 대한 성장을 사용할 수 있습니다. 연속 묘사를 위해 그림 1을 참조하십시오.
5. 종양 세포의 정맥 주사 (실험적 전이)
- 세포 현탁액의 30 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 100μl 것은 각각의 배아의 allantoic 정맥에 주입, 계란은 고정 인큐베이터에 반환하고 추가 1~7일 거기에 남아 있었다.
- 서로 다른 시간 지점에서, 폐 이하 CAM은 각 배아에서 수확되며 아래에 설명된대로, 종양 세포의 검출을위한 처리.
6. 수확 종양과 여자의 조직
- 해부 영역이 준비됩니다. 분석은 매우 민감한 PCR 방식을 사용하여 인간 DNA를 quantifying하여 전이성 세포를 감지합니다. 그것은 외인성 DNA와 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 해부는 전용 지역에서 수행하고 해부를 통해 도구는 각 동물 사이에 청소합니다. 내장을 제거하는 기본 종양과 한 세트를 제거 한 세트를 계란을 절단 한 설정 해부 과정에서 도구의 3 별도의 세트를 사용하여 샘플의 교차 오염을 방지하기 위해. 또한, 넷 씻어 용기는 각 동물 간의 도구 rinsing 연속 사용됩니다. 시퀀스에서 이러한 세척은 다음과 같습니다 1) 더블 증류수, 2) 더블 증류수, 3) 염소 표백제, 4) 70 % 에탄올.
- 달걀은 정지 인큐베이터에서 제거하고 동물을 마취 및 안락사에 15 분 동안 얼음에 게재됩니다. 창문은 종양이 표시되고 그러한 열립니다. 달걀 껍질의 일부를 제거하여 더 큰 창문을 열면 필요할 수 있습니다. 기본 종양은 CAM에서 resected 무게, 그리고 조직학에 대한 처리됩니다.
- 여자는 동등 반쪽으로 반경 껍데기를 절단하여 달걀 껍질에서 제거됩니다. 배아는 컷 껍질에서 decanted 최대 깨끗한 무게는 보트를 가슴쪽으로 전송됩니다. 동물은 도구의 신선하고 깨끗한 집합을 이용한 해부합니다. 동물은 흉골을 통해 절단에 의해 열립니다. 일단 배아 역시 오른쪽 또는 왼쪽으로 기억 상실증이 수집에서 간장의 일부 열려 있습니다. 내장은 이후 모래 주머니에 연결된 식도에 부드럽게 당기와 기관을 연결 visera를 절단하여 제거됩니다. 폐에 상처 수집하기 위해 흉곽은 가슴 판은 구분 개설되고 마음이 제거됩니다. 이 시점에서 그것은 폐암의 사면 주위에 절단이 가능합니다 (머리에 가까운 가기 흉곽, 호흡 관을 따라 횡경막과 오른쪽 하단을 따라 왼쪽). 일관성을 위해 같은 폐는 각 동물에 수집됩니다. 수확 조직 샘플은 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다 또는 DNA의 격리를 위해 즉시 처리할 수 있습니다.
7. 게놈 DNA의 분리 및 정량 PCR 분석
- 게놈 DNA는 Sybr 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트 (시그마 - 알드리치 카탈로그 # XNATRG)를 사용하여 조직에서 추출됩니다. 추출 DNA는 깨끗한 eppendorf 튜브에 전송하고 -20 ° C에 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다. 이후 PCR 반응에 사용하기 전에 nuclease 무료로 물 속에 DNA 1시 50분을 희석하는 것이 중요합니다. 또는 DNA는 표준 DNA 추출 프로토콜 (Zijlstra 외., 2002)의 번호를 사용하여 추출하실 수 있습니다.
- 인간의 DNA는 인간의 Alu 시퀀스에 대한 정량 PCR의 특정을 사용하여 여자의 조직에서 발견됩니다. 정량 PCR은 Exract - N - 앰프 키트에서 SYBR 녹색 증폭을 사용하여 수행됩니다 Alu 특정 primers를 사용하여. PCR 키트 SYBR 녹색, 버퍼, 솔츠 dNTPS, DNA 형성 촉매 효소 및 Jumpstart는 DNA 형성 촉매 항체를 포함하는 2X 반응 믹스와 함께 제공됩니다. 반응 혼합물은 각 프라이머의 0.4μM와 15μl의 최종 볼륨으로 구성되어 있습니다. 압축을 푼 DNA를 사용하는 대부분의 경우는 1시 50분는 양적 데이터를 제공합니다 희석을 위해, 그러나, 템플릿 DNA의 최적의 금액은 경험적으로 최적화해야 할 수 있습니다. 치킨 GAPDH의 primers는 PCR은 Alu 시퀀스에 대해 다음 조건에서 실행되는 내부 통제으로 사용됩니다 : 95시 효소 활성 ° 95 30 사이클 뒤에 2 분 C ° 30 S., 63를위한 C ° C 30 S. 72 ° 30 C S. 닭고기 GAPDH에 대한 반응 조건은 그러나 40 사이클로 PCR을 확장해야 할 수 있습니다 Alu에 대한 설명들에게 동일합니다.
- 전이의 정량 분석은 제어 그룹 (Schmittgen 및 Livak, 2008 실험 그룹을 비교 ΔΔCt 방법을 사용 수행됩니다;. Zijlstra 외를, 2002). 또는 표준 곡선은 압축을 풉니다 - N - 앰프 키트 (Zijlstra 외., 2002)를 사용하여 압축을 푼 인간의 종양 세포의 희석 계열을 사용하여 생성할 수 있습니다. 통계 중요성은 학생 T - 테스트 또는 제어 및 실험 그룹의 Anova 분석을 사용하여 평가됩니다.
8. 대표 결과 :
그림 1. 닭 배아 전이 모델. 주요 단계에서 단면에있는 모델의 모습을 보여주는 A) 4 패널 다이어그램 : 1. 부화 10 일 후. CAM은 거의 최대 크기에 도달했습니다. 동맥과 정맥은 계란의 상단에 대한 위치 Allantoic 정맥과 별개로 볼 수 있습니다. 2. 바로 달걀 껍질에 구멍을 드릴링 후 달걀 : airsac에 하나 allantoic 정맥에 대한 부착 지점에 인접한 하나. 3. 가벼운 진공 후 외관 airsac을 벗어나 CAM을 드롭하는 데 사용되었습니다. 종양 세포 (파란색)은 떨어졌다 CAM에 적용됩니다. 4. 이식할 종양 세포의 성장 수 있도록 후, 닭 배아의 조직과 함께 종양을 분석 수확 아르 B) 모델의 시리얼 묘사 :. 1. 계란을 잠복기. 2. allantoic 정맥의 위치., 3 마킹. 달걀 껍질에 구멍을 시추. 4. CAM을 떨어진다. 5. 접목 종양 세포., 6 오프닝 커팅. 종양 세포를 적용., 7. 얼음에 계란을 냉각하는 것은 사전에 조직을 수집합니다. 8. 성장 7 일 후 종양을 수확.
그림 2. 캠 종양의 조직학. 종양 베어링 chorioallantoic 막에서 가져온 조직은 포르말린, sectioned에 고정하고 trichrome 얼룩로 처리되었습니다. CAM의 성장 7 일 이후 A) HEp3 종양. B와 C가 보여주는 종양과 두 기질에서 확대 영역을 보여줍니다. D) normals CAM.
그림 3. 전이의 정량 분석 세로. 높거나 낮은 전이성 능력 (HEp3 M (하이) 각각 HEp3 M (낮은))으로 머리와 목 암의 HEp3에 대한 변형은 Alu PCR을 사용하여 전파하는 능력에 대해 분석했다. 텐 동물 칠일의 기간 동안 각 시점에서 분석했다. 이 샘플은 # 조직을 cells/50mg 같은 표준 곡선에 대한 계량 및 이후 표현했다.
그림 4. 동물 자연 전이 세포의 억제는 종양의 전이 억제 항체 1A5로 치료. 종양은 일 - 10 태아의 CAM에 적용 5X10 5 HEp3 세포를 사용하여 형성되었습니다. 절반 동물 방지 CD151 항체 1A5 대우 있던 종양 세포를 적용한 후에 3 일. 종양 - 베어링 동물의 폐는 이틀 후에 수확 및 정량 실시간 PCR alu를 받게되었습니다. chGAPDH의 반대로 양적 실시간 PCR은 호스트의 게놈 DNA의 상당 수량 (ΔΔCt 메소드 (양적 두 그룹을 비교하는 B를 사용했다)의 존재를 확인하는 데 사용되었다.
그림 5. 전이성 폭포에서 체포, 성장, 그리고 intravasation을 평가. 체포, 성장 속도, 그리고 intravasation의 비율 : 기본적으로 보조 기관에 전이는 세 가지 측면의 기여에 의해 정의됩니다. 이들은 실험 전이 (A)와 자발적인 전이 (B)의 조합을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 체포은 세포의 숫자로 정의 실험 전이 (A)를 사용하면 2 시간 게시 주사를 발견했습니다. 체포 세포의 생존과 성장은 휴대폰 번호 이용하려면 포스트 주사의 변화로 결정됩니다. 성장은 3-7 일 동안 확산의 속도로 정의됩니다. Intravasation는 자발적인 전이 (B) 번호 intravasated 전지는 값이 일 6 일 현재 전이성 부담의 성장 예측 초과 일 7 전이성 부담 선물로 정의됩니다 사용 결정됩니다.
그림 6. CAM에서 전이성의 머릿속으로 확장. GFP를 표현 HEp3 세포 발달 하루 12 정맥 주입했다. 일 1, 3, 5에 달걀이 희생되었고 CAM의 섹션은 형광등 스테레오 현미경으로 몇 군데했다. 진한 녹색 배경이 달걀 껍질에 의해 만들어진, vasculature는 검은색 선으로 표시로 볼 수 있으며, 종양 세포는 밝은 녹색 관광 명소로 볼 수 있습니다.
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Discussion
병아리 CAM은 암 생물학과 전이성 진행의 다양한 측면을 연구하기위한 모델 시스템으로 수십 년 동안 사용되었습니다. 전이성 능력 원리 평가는 휴면의 분석을 포함하는 그룹의 다양한하여이 모델에서 수행되었습니다 (. 아귀레 Ghiso 외, 1999; Ossowski과 제국, 1983), 조직 개조 (Deryugina 외, 2005;. 안 - Dantona . 외, 1999), 그리고 전이 (Zijlstra 외, 2008;. Zijlstra 외, 2002).. 그것은 사용하기 때문입니다 자사의 용이성, xenografts를 수락하기 위해 능력의 암 생물학을위한 매우 매력적인 모델을 계속하며, 저렴한 비용 (챔버 외, 1982;. 챔버 외, 1990).. 인간의 구체적인 Alu 기반의 정량 PCR (.. 김 외, 1998; Zijlstra 외, 2002)를 사용하여 우리는 인간 cpidermoid 암종 세포 라인 HEp3의 전이성 보급 (그림 3)을 분석할 수있는 능력을 보여줍니다. 또한 우리는 전이 억제 항체 1A5 (.; Zijlstra 외, 2008). 그림 4 (테스타 외, 1999)를 사용 억제 치료의 평가에서이 기술의 유틸리티를 보여줍니다.
전이성 능력과 치료 반응을 평가 수있는 이외에,이 모델은 또한 양적 전이성 폭포 (Zijlstra 외., 2002)의 개별 구성 요소를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 종양 세포의 정맥 주사에 의해 실험적인 전이를 사용하여,이 모델은 암 세포 보조 기관에 체포와 그 이후의 성장 (그림 5A)의 분석을 위해 수 있습니다. 성장이 속도는 종방향 자연 전이 분석의 전이성 부담 (그림 5B)를 예측하는 데 사용할 수 있습니다. Intravasation는 자발적인 전이 (B) 번호 intravasated 세포가 일 7 전이성 부담 선물 마이너스 값이 일 6 전이성 부담 선물의 성장 예측과 같이 정의됩니다 사용 결정됩니다.
. 루이스 동부 표준시, 기술의 확장 여기보고, 우리는 최근 종양 microenvironment (레옹 외, 2010을 대상으로 찬란 분류 nanoparticles를 사용하여 생체내에서 종양 세포의 행동 (. Zijlstra 외, 2008), 시각화하는 새로운 전략을 개발 알., 2006). 이러한 발전 방법을 통해이 모델의 유틸리티는 생존, 설치 및 종양 세포의 성장을 지원하는 복잡하고 역동적인 변화를 시각화하기 위해 악용될 수 있습니다. 여자 CAM의 상대적으로 저렴한 비용으로, immunodeficient 자연, 사용의 용이성과 적응성과 함께 이러한 기술은, 이미징 및 암 전이의 정량 분석이 모델은 가치가합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 아낌없이 수정된 난자를 제공 타이슨 식품 주식 회사를 인식 싶어요. 샨나 아놀드는이 프로토콜을 찍는 동안 계기되었다. Trenis 팔머는 루스 L. Kirschstein 내셔널 리서치 서비스 수상 (F31 국립 암 연구소)에서 국립 보건원에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 CCSRI 부여 # 700537 JDL 및 NIH / NCI 부여 # CA120711 - 01A1 및 AZ로 CA120711 - 01A1에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
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