Summary
हाल ही में विकसित उपन्यास कण समूहन (PA) वायरस के रिसेप्टर अणु उपयोग परख पोलियो वायरस (पीवी) की एक तेजी से और आसानी से पहचान की अनुमति दी. इस अनुच्छेद में, हम पहचान के लिए पी.वी. पीए परख के लिए प्रक्रिया को दिखा देंगे.
Abstract
वैश्विक पोलियो उन्मूलन पहल में, प्रयोगशाला निदान अलग और तीव्र झूलता हुआ पक्षाघात मामलों (एएफपी) के मल के नमूने से पी.वी. की पहचान के द्वारा एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के वैश्विक पोलियो प्रयोगशाला नेटवर्क, पी.वी. अलगाव और पहचान वर्तमान में सेल संस्कृति प्रणाली और वास्तविक समय RT-पीसीआर, क्रमशः का उपयोग करके प्रदर्शन किया जा रहा है. पी.वी. के उन्मूलन के बाद के युग में, राष्ट्रीय प्रयोगशालाओं में पोलियो मामलों की पुष्टि के लिए तेजी से सरल और तेजी से पहचान की प्रक्रिया उपयोगी होगा. वर्तमान अध्ययन में, हम पहचान के लिए पी.वी. विकसित उपन्यास पीए परख की प्रक्रिया दिखाएगा. यह पीए परख पी.वी. रिसेप्टर अणु (पीवीआर) और virion है कि पी.वी. के सभी सीरमप्रकारों के लिए विशिष्ट और वर्दी आत्मीयता की बातचीत का इस्तेमाल. प्रक्रिया सरल है (प्रतिक्रिया प्लेटों में एक कदम प्रक्रिया) है और तेजी से (परिणाम प्रतिक्रिया के 2 घंटे के भीतर प्राप्त किया जा सकता है), और परिणाम नेत्रहीन (जिलेटिन कणों के समूहन का अवलोकन) मनाया जाता है.
Protocol
1. रखरखाव के माध्यम तैयार करना (एम एम) और विकास मध्यम (जीएम)
एमएम और जीएम की तैयारी के लिए, 1 डब्ल्यूएचओ के एक पोलियो प्रयोगशाला पुस्तिका देखने के लिए कृपया. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और 10% FCS एमएम और जीएम के विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रमशः के साथ पूरक है.
2. विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी तैयार
- Reconstitute विरोधी विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी (टाइप 1, 2, या 3) की प्रत्येक शीशी पानी (शीशी प्रति 0.5 एमएल) जोड़कर एंटीबॉडी पी.वी. (RIVM पी.वी. टाइपिंग antiserum). अलग लेबल ट्यूबों में 4.5 एम एम के एमएल इस पुनर्गठन एंटीबॉडी समाधान (0.5 एमएल प्रत्येक) जोड़ें.
नोट: विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी के कुछ बहुत पुनर्गठन प्रपत्र (शीशी प्रति 0.5 एमएल) के रूप में प्रदान की जाती हैं. विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी के ऐसे बहुत कुछ के लिए, पानी के पुनर्गठन के लिए इसके अलावा आवश्यक नहीं है. - पुनर्गठन विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी के बराबर मात्रा में मिश्रण. विरोधी PV1 2, 3, 2, या एक 3: मिक्स प्रत्येक पुनर्गठन एंटीबॉडी के 1.8 एमएल (एमएल 1.8 + 1.8 एमएल = प्रत्येक मिश्रण के लिए 3.6 एमएल). विरोधी PV1 3 2: प्रत्येक पुनर्गठन एंटीबॉडी के 1.2 एमएल (एमएल 1.2 + 1.2 एमएल + 1.2 एमएल एमएल 3.6 =) मिक्स.
नोट: पी.वी. नमूने पी.वी. के विभिन्न सीरमप्रकारों का एक मिश्रण हो सकता है. पीवी के मिश्रण के साथ नमूनों में पीवी के एकल सीरोटाइप की पहचान करने के लिए, विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी (यानी 1 2, 2 3, 3 1, 1 2 3) पूल के लिए आवश्यक है. - प्रत्येक (एक दो 2, 3, 1, 3, या 1 3 2) (3.6 एमएल प्रत्येक) एंटीबॉडी (अंतिम 18.2% एफसीएस) विरोधी पी.वी. FCS (एमएल 0.72) के 1 / 5 मात्रा जोड़ें.
नोट: FCS के अतिरिक्त गैर विशिष्ट जिलेटिन एंटीबॉडी द्वारा कारण कण के समूहन की कमी के लिए है. - -20 डिग्री सेल्सियस तक पीए परख में उपयोग एंटीबॉडी पूल रखें.
3. अवगत जिलेटिन कण के पुनर्गठन
- पुनर्गठन बफर के 1.5 एमएल किट में अवगत जिलेटिन कण की एक शीशी (फ्रीज सूखे पाउडर के रूप में प्रदान की) शामिल जोड़ें.
- कोमल दोहन द्वारा अच्छी तरह मिक्स
- 4 में पुनर्गठन अवगत कण डिग्री सेल्सियस रखें जिलेटिन कण पुनर्गठन सक्रिय हो कम से कम 2 सप्ताह 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा, सकता है, लेकिन बस परख पहले तैयार किया जाना चाहिए.
महत्वपूर्ण नोट:
अवगत जिलेटिन कणों के बहुत अलग मिश्रण, क्योंकि गैर समूहन छवि अवगत जिलेटिन कणों के कणों के बहुत से अलग हो सकता है मत करो. प्रत्येक प्रयोग के लिए, अवगत जिलेटिन कण के एक एकल बहुत कुछ किया जाना चाहिए.
4. पी.वी. पहचान के लिए पीए परख
- एक सूक्ष्म अनुमापन थाली तैयार है. एक वायरस के नमूने की पहचान के लिए, हम 5 कुओं की जरूरत + कम से कम एक नकारात्मक नियंत्रण (नीचे में वायरस और एंटीबॉडी के बिना अवगत कण # अच्छी तरह से 6 उदाहरण में कोई वायरस और एंटीबॉडी नियंत्रण देखें.). कुओं की कुल संख्या 5 x नमूने + परख में एक कम से कम नियंत्रण है.
महत्वपूर्ण नोट:
एक कम से कम परख में कोई वायरस और एंटीबॉडी के नियंत्रण रखना. अवगत कण की एक शीशी लगभग 10 वायरस के नमूने की पहचान के लिए है. - अनुमापन - सूक्ष्म थाली करने के लिए / 12 अच्छी तरह से विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी या जीएम की μL जोड़ें. थाली की व्यवस्था है के रूप में इस प्रकार (भी नीचे उदाहरण देखें). एंटीबॉडी (# अच्छी तरह से 1 और 6) के बिना नमूने में, जीएम के 12 μL के बजाय विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी जोड़ें.
महत्वपूर्ण नोट:
यदि कई पी.वी. नमूने इस परख में परीक्षण किया जाना चाहिए, multichannel विंदुक या निकालने की मशीन के इस कदम के लिए मददगार होगा.# खैर 1 # खैर 2 # खैर 3 # अच्छी तरह से 4 # खैर 5 # खैर 6 जीएम विरोधी-P1 +2 +3 विरोधी-P1 2 विरोधी-P2 3 ani-P1 3 जीएम - 12 / अच्छी तरह से वायरस नमूना μL जोड़ें. वायरस के बिना एक नमूना (# अच्छी तरह से 6) में, जीएम के 12 μL के बजाय वायरस समाधान जोड़ें.
नोट: नमूना वायरस संक्रमित कोशिकाओं, आमतौर पर L20B कोशिकाओं या आरडी कोशिकाओं की संस्कृति सतह पर तैरनेवाला है.
महत्वपूर्ण नोट:
यदि कई पी.वी. नमूने इस परख में परीक्षण किया जाना चाहिए, multichannel विंदुक इस कदम के लिए मददगार होगा.# खैर 1 # खैर 2 # खैर 3 # अच्छी तरह से 4 # खैर 5 # खैर 6 वायरस नमूना वायरस नमूना वायरस नमूना वायरस नमूना वायरस नमूना जीएम - कमरे के तापमान 4 डिग्री सेल्सियस से पुनर्गठन अवगत कण समाधान, ले लो और धीरे पूरी तरह से कणों को निलंबित नल.
महत्वपूर्ण नोट:
कोमल दोहन द्वारा कणों की पूरी निलंबन के बाद, कण प्लेटों को तुरंत निलंबित कणों precipita से पहले जोड़ाते और फार्म गैर सजातीय समाधान. - 25 / अच्छी तरह से सभी कुओं को अवगत कण μL जोड़ें.
महत्वपूर्ण नोट:
बाद अवगत कण की इसके अलावा, थाली तुरंत मिश्रण थाली किए जाना चाहिए नमूनों की वर्दी रिएक्शन शुरू इसलिए अवगत कण के अलावा निकालने की मशीन का उपयोग करने के लिए थाली में नमूने के बीच एक समय अंतराल को कम करके किया जाना चाहिए. - एक थाली मिक्सर पर अनुमापन - सूक्ष्म थाली रखो और 30 सेकंड के लिए थाली मिश्रण.
- कमरे के तापमान पर एक मेज पर माइक्रो अनुमापन सफेद कागज पर थाली रखो (दृश्य अवलोकन के सुविधा के लिए) (15 ~ डिग्री सेल्सियस) के लिए 30 2 एच.
महत्वपूर्ण नोट:
परिणामों के अवलोकन और तस्वीरें लेने के लिए प्रतिक्रिया के दौरान और बाद थाली हिलना मत. गठन समूहन स्थिर नहीं है और आसानी से प्लेटें चलती से परेशान है. - प्लेट की तस्वीरें ले लो.
महत्वपूर्ण नोट:
फोटो के आंशिक दृश्य बाद में परीक्षा और व्याख्या के लिए परिणामों की समीक्षा के लिए पर्याप्त डेटा नहीं दे सकता है. कई तस्वीरें प्लेटों के सभी कुओं कुओं के समूहन छवि पर ध्यान केंद्रित को कवर करने के लिए लिया जाना चाहिए.
5. परिणामों की व्याख्या
- सकारात्मक और नकारात्मक कुओं की पहचान. नमूनों में है कि कोई वायरस और एंटीबॉडी के नियंत्रण (जिलेटिन कणों, गैर समूहन की तेज़ी) (चित्रा 1 और 2) के साथ समूहन की तुलना करें. समूहन की छवियाँ है कि स्पष्ट रूप से कोई वायरस और कोई एंटीबॉडी नियंत्रण (गैर समूहन, नकारात्मक नियंत्रण) से प्रतिष्ठित कर रहे हैं सकारात्मक रूप में न्याय किया जाना चाहिए, और समूहन की छवियों है कि नकारात्मक नियंत्रण के लिए समान हैं नकारात्मक रूप में न्याय किया जाना चाहिए. नमूने है कि स्पष्ट है, लेकिन केवल आंशिक समूहन शो '(आंशिक समूहन) सकारात्मक' के रूप में सकारात्मक है, लेकिन रिकार्ड के रूप में आंका जा सकता है.
- पी.वी. की पहचान. विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी के साथ सकारात्मक और नकारात्मक कुओं पी.वी. सीरमप्रकारों की पहचान के आधार पर परिणामों की व्याख्या. परिणाम की व्याख्या के सिद्धांत है कि सेल संस्कृति प्रणाली में बेअसर परीक्षण (जैसे विरोधी P1 के दो एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक संकेत करता है कि नमूना प्रकार 3 पी.वी. शामिल) के समान है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
पीए परख पी.वी. पहचान के प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1 में दिखाया गया है सभी पी.वी. उपभेदों अवगत जिलेटिन कणों के समूहन (नमूनों नहीं एंटीबॉडी) का गठन किया. इसी विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी, जिलेटिन कणों (गैर समूहन) नहीं वायरस के समान की तेज़ी और कोई एंटीबॉडी के नियंत्रण (नकारात्मक नियंत्रण) की उपस्थिति में (उदाहरण के लिए, PV1 (साबिन) या दो विरोधी-P1 की उपस्थिति में मनाया गया विरोधी P3 1) एंटीबॉडी.
चित्रा 1. पी.वी. के पीए परख द्वारा पहचान. PV1 (साबिन) के वायरस समाधान, (साबिन) PV2 और PV3 (साबिन) (1.2 x 10 8 50 CCID / 12 μL, 8.2 x 10 7 CCID μL 50 / 12 के वायरस titers, और 3.5 x 10 7 50 / 12 μL, क्रमशः CCID) पीए परख द्वारा पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया. कोई वायरस और कोई एंटीबॉडी नियंत्रण जिलैटिन कणों (गैर - समूहन, नकारात्मक नियंत्रण) की तेज़ी देखी गई.
चित्रा 2. PV1 (साबिन) के वायरस समाधान, (साबिन) PV2, और PV3 (साबिन) (2.4 x 10 8 CCID μL 50 / 25 के वायरस titers, 1.7 x 10 8 CCID μL 50 / 25, और सकारात्मक और नकारात्मक कुओं की व्याख्या. 7.3 x 10 7 CCID μL 50 / 25, क्रमशः) 1 / 20 1 / 320 से पतला थे, और फिर पतला नमूने के 25 μL विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी बिना पीए परख द्वारा जांच की गई.
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Discussion
इस पीए परख के अद्वितीय बिंदु 2 पी.वी. का पता लगाने के के लिए पीवीआर अणु के बजाय विरोधी पी.वी. एंटीबॉडी के उपयोग है. यह पी.वी. 3-6 के सभी तीन सीरमप्रकारों के लिए एक समान आत्मीयता के साथ अवगत जिलेटिन पी.वी. कणों के साथ एक विशेष बातचीत की अनुमति देता है. हम जिलैटिन कणों के संवेदीकरण है के लिए पीवीआर के एक immunoadhesin प्रपत्र (पीवीआर IgG2a) का इस्तेमाल किया, क्योंकि पीवीआर के monomeric रूपों virion पर केवल एकल बंधनकारी साइट के लिए उदार समानताएं (पृथक्करण -7 10 की निरंतर ~ -8 एम ) 7, 8, और सफलतापूर्वक पी.वी. आइसोलेट्स के साथ अवगत जिलेटिन कणों के विशिष्ट समूहन मनाया. उच्च विशिष्टता और अवगत कणों के समान आत्मीयता के साथ, पीए परख में पी.वी. पहचान के महत्वपूर्ण कारक हैं 1) वायरस टिटर (पीए परख द्वारा पी.वी. के वैध पता लगाने के लिए) और 2) की व्याख्या समूहन (पीवी की सही पहचान के लिए) .
आम तौर पर, पी.वी. के वायरस टिटर सेल संस्कृति प्रणाली में आइसोलेट्स 10 का 6 से 8 50 CCID / 50 μL की एक सीमा में है . पीए टाइप 1, 2, और 3 पी.वी. के लिए परख (पूरा समूहन बनाने) का पता लगाने सीमा 1.5x10 6 50 CCID, CCID 50 5.3x10 5, और 9.1x10 5 50 CCID, क्रमशः 2 थे . पीए परख सही ढंग से पी.वी. के सबसे पहचान भी अन्य गैर पी.वी. enteroviruses की उपस्थिति में आइसोलेट्स. हालांकि, कुछ नमूने के लिए पी.वी. के विभिन्न सीरमप्रकारों का एक मिश्रण होता है, मामूली सीरोटाइप पता लगाया जा असफल रहा. साफ समूहन का पता लगाने सीमा से ऊपर पर्याप्त वायरस टिटर के साथ का गठन किया जाना चाहिए. मामले में कोई एंटीबॉडी नमूना में समूहन अस्पष्ट या आंशिक था, आइसोलेट्स होना चाहिए फिर से आरडी कोशिकाओं में प्रवर्धित टिटर 9 वृद्धि .
आंशिक समूहन जब वायरस टिटर कम और बस का पता लगाने सीमा के नीचे था मनाया गया. नकारात्मक नियंत्रण से समूहन साफ अंतर पीए परख में सकारात्मक रूप में आंका जा सकता है. हालांकि, समूहन का काफी सूक्ष्म अंतर सकारात्मक गुमराह सकता है परिणामों की व्याख्या के रूप में न्याय. इसलिए, सकारात्मक (आंशिक समूहन) के परिणामों के लिए संभवतः आइसोलेट्स की मामूली सीरमप्रकारों की वजह से सहायक जानकारी के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हालांकि, इस जानकारी सहायक हो सकता है जब निम्नलिखित विश्लेषण (पीवी आइसोलेट्स या वास्तविक समय RT-पीसीआर के जीनोमिक अनुक्रमण) एक संभावना का सुझाव दिया है कि नमूना पी.वी. के विभिन्न सीरमप्रकारों का एक मिश्रण होता है, या केवल आंशिक समूहन नहीं एंटीबॉडी नमूना के लिए मनाया गया, जहां कम वायरस टिटर अस्पष्ट परिणामों के प्रमुख कारण होगा.
पी.वी. पहचान के लिए पीए परख का लाभ प्रक्रिया और परिणाम व्याख्या की सादगी में है. यह विशेष उपकरण, सामग्री, और प्रशिक्षण उपलब्ध कराने के बिना हर सेल संस्कृति प्रणाली के साथ पी.वी. अलगाव का आयोजन प्रयोगशालाओं को परख का आसान परिचय की अनुमति होगी. प्रकार के विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उपयोग की अनुमति सकता है पीवी के भेदभाव (जंगली या टीका - तरह उपभेदों प्रकार) है कि पी.वी. की संपत्ति की महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करेगा के लिए उपन्यास विधि का विकास आनुवंशिक भेदभाव के साथ RT-पीसीआर और जीनोमिक द्वारा आइसोलेट्स अनुक्रमण 10, 11.
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Disclosures
Souji Masujima नई उत्पाद डिजाइन विभाग, Fujirebio इंक का एक कर्मचारी है
Acknowledgments
हम उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Junko वाडा आभारी हैं. हम पीवीआर - IgG2a के लिए एक baculovirus अभिव्यक्ति वेक्टर प्रदान करने के लिए कृपया प्रो Akio Nomoto के लिए आभारी हैं. इस अध्ययन में भाग अनुदान द्वारा समर्थित किया गया पोलियो उन्मूलन के संवर्धन और उभरते और पुनः उभरती स्वास्थ्य, श्रम और कल्याण मंत्रालय से संक्रामक रोगों पर अनुसंधान के लिए सहायता.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
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