Summary
ウイルスの受容体分子を利用して、最近開発された新たな粒子の凝集反応（PA）アッセイは、ポリオウイルス（PV）の迅速かつ容易に識別することができました。この記事では、PVの識別のためのPAのアッセイのための手順が表示されます。
Abstract
世界ポリオ撲滅イニシアティブでは、実験室診断は、急性弛緩性麻痺（AFP）症例の便検体からPVを分離し、識別することによって、重要な役割を果たしている。世界保健機関（WHO）に、世界ポリオ研究所ネットワーク、PV分離と同定は、現在、それぞれ細胞培養系およびリアルタイムRT - PCRを使用して実行されている。 PVのポスト撲滅の時代には、簡単かつ迅速な識別手順は、国立研究所でポリオ症例の迅速な確認のために有用であろう。本研究では、我々は、PVの識別のために開発した斬新なPAアッセイの手順が表示されます。このPAのアッセイは、PV受容体（PVR）分子とPVのすべての血清型に特異的かつ均一な親和性であるビリオンの相互作用を利用しています。手順は簡単です（反応プレート内の1つのステップの手順）と急速に（結果は反応の2時間以内に得ることができます）、および結果が視覚的に（ゼラチン粒子凝集反応の観察）観察される。
Protocol
1。維持培地（MM）と増殖培地（GM）の調製
MMとGMの調製のために、1のポリオ実験室のマニュアルを参照してください。ウシ胎児血清（FCS）および10％FCS 2％添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）はそれぞれ、MMとGMの代替として使用することができる。
2。抗PVの抗体の調製
- 抗PVの抗体（タイプ1、2、または3）の各バイアルに水（バイアルあたり0.5 mL）を追加することによって再構成する抗PVの抗体（RIVM PVタイピング抗血清）。別のラベルの付いたチューブでMMの4.5 mLにこの再構成された抗体溶液（0.5 mLをそれぞれ）を追加します。
注：抗PVの抗体の一部ロットが再構成されたフォーム（バイアルあたり0.5mLの）として提供されています。抗PVの抗体のような多くの場合は、再構成のための水の添加は必要ありません。 - 再構成された抗- PVの抗体の等量を混ぜる。抗PV1 +2、2 +3、または3 +1の場合：各再構成された抗体のミックス1.8mlの（それぞれの混合物1.8 mLを+ 1.8 mLの= 3.6 mL）を。各再構成された抗体のミックス1.2 mlの（1.2 mLを+ 1.2 mLの+ 1.2 mLの= 3.6 mL）中：抗- PV1 +2 +3のため。
注：PVサンプルPVの異なる血清型の混合物を含む可能性。 PVの混合物と試料中のPVの、単一の血清型を識別するには、抗PVの抗体（すなわち1 +2、2 +3、3 +1、1 +2 +3）のプールが必要です。 - 各抗PV（1 +2、2 +3、3 +1、または1 +2 +3）抗体（3.6 mLを各）（最後の18.2パーセントFCS）にFCS（0.72 mL）を1 / 5ボリュームを追加します。
注：FCSの添加は、抗体によって引き起こされるゼラチン粒子の非特異的凝集の減少のためです。 - -20℃でPAのアッセイで使用するまで抗体のプールを保持します。
3。感作ゼラチン粒子の再構成
- 感作ゼラチン粒子1バイアル（凍結乾燥粉末として提供される）にキットに含まれている再構成バッファーを1.5 mLを加え。
- 穏やかなタッピングでよく混ぜる
- 4で再構成された感作粒子℃を保つ再構成されたゼラチン粒子は、少なくとも2週間は4℃に保ち、しかしちょうどアッセイ前に準備する必要がアクティブである可能性があります。
重要な注意：
感作ゼラチン粒子の非凝集のイメージは粒子の多くによって異なる可能性があるため、感作ゼラチン粒子の異なるロットを混ぜて使用しないでください。各実験では、感作ゼラチン粒子の単一の多くを使用する必要があります。
4。 PV識別のためのPAアッセイ
- マイクロ滴定プレートを準備します。 1つのウイルスのサンプルを識別するために、我々は5ウェルを必要とする+少なくとも一つのネガティブコントロール（下のウイルスと抗体なし感作粒子、よく＃6。例ではウイルスと抗体のコントロールを参照しない）。井戸の総数は、アッセイで5 ×サンプル+少なくとも1つのコントロールです。
重要な注意：
アッセイ内の少なくとも1つはウイルスと抗体の制御を取らないしてください。感作粒子の1バイアルは10ウイルスサンプルの識別のために約です。 - マイクロ滴定プレートに抗PV抗体またはGMの12μL/ウェルを追加。プレートの配置は、（また、下記の実施例を参照）、次のとおりです。抗体なしのサンプル（よく＃1と6）で、GMの代わりに抗PVの抗体12μLを加える。
重要な注意：
多くのPVのサンプルはこのアッセイで試験する必要がある場合は、マルチチャンネルピペットまたはディスペンサーには、このステップの参考になる。よく第1位 よく第2位 よく第3位 よく、第1位 よく＃5 よく＃6 GM 抗P1 +2 +3 抗P1 2 抗P2 3 ANI - P1 +3 GM - 12μL/ウェルのウイルスのサンプルを追加。ウイルスのない一つのサンプル（よく＃6）で、12 GMのμLの代わりにウイルスのソリューションを追加します。
注：ウイルスのサンプルは通常、感染した細胞、L20B細胞またはRD細胞の培養上清である。
重要な注意：
多くのPVのサンプルはこのアッセイで試験する必要がある場合は、マルチチャンネルピペットは、このステップの参考になる。よく第1位 よく第2位 よく第3位 よく、第1位 よく＃5 よく＃6 ウイルスのサンプル ウイルスのサンプル ウイルスのサンプル ウイルスのサンプル ウイルスのサンプル GM - 室温に4℃から再構成された感作粒子溶液を取り、優しく完全に粒子を一時停止する]をタップします。
重要な注意：
穏やかなタッピングによる粒子の完全な停止の後、粒子は懸濁粒子析出する前にプレートに直ちに追加する必要があります。TEとフォームの非均質な溶液。 - すべてのウェルに感作された粒子の25μL/ウェルを追加。
重要な注意：
感作粒子の添加後、プレートはすぐにサンプルの均一な反応を開始するために混合プレートに供されてください。従って、感作粒子の添加は、プレート内のサンプルの間でタイムラグを最小限に抑えるためにディスペンサーを使用して実行する必要があります。 - プレートミキサーの上にマイクロ滴定プレートを入れ、30秒間プレートを混ぜる。
- 2時間室温でテーブルの上に白い紙の上にマイクロ滴定プレート（目視観察の便宜のために）（15〜30 ° C）を入れて
重要な注意：
結果の観察と撮影の写真のための反応の間と後の板を移動しないでください。形成された凝集が安定していないと簡単にプレートを移動することによって乱さ。 - プレートの写真を撮る。
重要な注意：
写真の部分的なビューは、後で調べると解釈の結果のレビューのための十分なデータを与えることができなかった。いくつかの写真は、井戸の凝集像を中心にプレートの全ウェルをカバーするために注意が必要です。
5。結果の解釈
- 正と負の井戸の識別。ウイルスと抗体のコントロールなしのそれ（ゼラチン粒子の析出、非凝集）（図1および2）で試料中の凝集反応を比較する。はっきりしないウイルスと、抗体のコントロール（非凝集、ネガティブコントロール）と区別されている凝集のイメージはポジティブとして判断されるべきである、とネガティブコントロールに似ている凝集のイメージがネガティブと判断されるべきである。明確なだけ部分的な凝集反応を示すサンプルは、"正（部分凝集）"として肯定的な、しかしレコードとして判断することができます。
- PVの同定。 PVの血清型を識別するために、抗PV抗体を用いた正と負の井戸に基づいて結果を解釈する。結果の解釈の原理は、細胞培養系における中和試験（例えば、正の抗P1 2抗体のサンプルは、タイプ3のPVが含まれていることを示す）のそれと似ています。
6。代表的な結果
PAアッセイPV識別の代表的な結果を図1に示されています。全てのPVの株は感作ゼラチン粒子（なし抗体サンプル）の凝集を形成する。対応する抗PVの抗体の存在下では、ウイルスおよびno抗体の制御なしに似てゼラチン粒子（非凝集）（ネガティブコントロール）の沈殿が観察された（例えば、PV1（セービン）抗P1 +2の存在下でまたは抗P3 1抗体）。
図1。 PV1（セービン）のPAアッセイによるPVの識別。ウイルスソリューション、PV2（セービン）、及びPV3（セービン）（1.2 × 10 8 CCID 12分の50μL、8.2 × 10 7 CCID 12分の50μLのウイルス力価、およびそれぞれ3.5 × 10 7 CCID 12分の50μLは、）PAのアッセイにより同定のために使用されていました。いいえウイルスとしない抗体のコントロールは、ゼラチン粒子（非凝集、ネガティブコントロール）の析出は認められなかった。
図2。正と負の井戸の解釈。PV1（セービン）のウイルスソリューション、PV2（セービン）、及びPV3（セービン）（2.4 × 10 8 CCID 25分の50μLのウイルス力価、1.7 × 10 8 CCID 25分の50μL、および7.3 × 10 7 CCID 25分の50μL、それぞれ）320分の1〜1 / 20希釈し、そしてその後、希釈した試料25μLを抗PV抗体なしでPAアッセイにより調べた。
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Discussion
このPAアッセイのユニークな点はPV 2の検出のための抗PVの抗体の代わりに、PVRの分子の使用率です。これはPV 3-6のすべての3つの血清型に均一な親和性でPV感作ゼラチン粒子の特異的相互作用が可能になります。 PVRの単量体の形態は、ビリオン上の単一の結合部位（〜-8 M、10 -7の解離定数）7、にのみ中等度の親和性を有するので、私たちは、ゼラチン粒子の感作のためにPVRのイムノアドヘシンフォーム（PVR - IgG2aを）使用8、そして成功したPVの分離株で感作ゼラチン粒子の特異的な凝集を観察した。高い特異性と感作粒子の均一な親和性で、PAのアッセイにおけるPVの同定の重要な要因は、ウイルス力価（PA抗体法による太陽光発電の有効な検出のため）と2）の凝集の解釈は（PVの正しい識別用）、1） 。
一般的に、PVの力価は、細胞培養系での分離ウイルスは、10 6〜8 CCID 50分の50μLの範囲である。タイプ1、2、3 PVのためのPAアッセイ（完全な凝集を形成する）の検出限界は1.5 × 10 6 CCID 50、5.3x10 5 CCID 50、それぞれ9.1x10 5 CCID 50、2であった。 PAアッセイ正しくPVの大部分を同定は、さらに他の非PVのエンテロウイルスの存在下で分離されます。しかし、PVの異なる血清型の混合物が含まれているいくつかのサンプルのため、マイナーな血清型が検出されるに失敗しました。明確な凝集は検出限界以上に十分なウイルスの力価を形成する必要があります。なし抗体サンプルの凝集が不明確または部分的であった場合には、分離株は、力価9を高めるために、RD細胞で再増幅されるべきである。
ウイルスの力価は、単に検出限界以下に低くしていたときは、部分的な凝集が観察された。ネガティブコントロールから凝集反応の明確な違いは、PAのアッセイで陽性と判断することができます。しかし、凝集の非常に微妙な違いは、肯定的な誤解を与えるが、結果の解釈できたと判断。したがって、正の（部分的な凝集反応）の結果は、おそらく分離株のマイナー血清型によって引き起こされるための支援情報として使用する必要があります。以下の分析（PVの分離株やリアルタイムRT - PCRのゲノム配列決定が）サンプルはPVの異なる血清型の混合物を含んでいる可能性を示唆、または一部のみ凝集がどこにない抗体のサンプルで観察されたときただし、この情報が参考になる低ウイルス力価は不明結果の主な原因となります。
PV識別のためのPAアッセイの利点は、手順と結果の解釈のシンプルさです。これは特殊な装置、材料、およびトレーニングを提供することなく、細胞培養系でPVの分離を行うすべての研究所に分析を容易に導入ができるようになります。型特異的モノクローナル抗体の利用は、PVのプロパティの重要な情報を提供するPVの差別化のための新しい方法の開発（野生型またはワクチンのような株は）RT - PCRおよびゲノムが遺伝的分化と一緒に分離できる場合がありますシーケンス10、11。
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Disclosures
総司増島は、新製品設計部、富士レビオ株式会社の従業員です。
Acknowledgments
私たちは、彼女の優秀な技術支援のための純子和田に感謝しています。私たちは親切PVR - IgG2aのためのバキュロウイルス発現ベクターを提供するための教授昭夫野本に感謝しています。この研究は、補助金ポリオ撲滅の推進と、厚生労働省からの新興再興感染症に関する研究によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
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