Summary
Una partícula desarrollado recientemente la novela de aglutinación (PA) de ensayo utilizando virus molécula del receptor permite una identificación rápida y fácil de poliovirus (PV). En este artículo vamos a mostrar el procedimiento para el ensayo de PA para la identificación de PV.
Abstract
En la Iniciativa de Erradicación Mundial, el diagnóstico de laboratorio desempeña un papel fundamental mediante el aislamiento y la identificación de PV de las muestras de heces de parálisis flácida aguda (PFA). En la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Red de Laboratorios Mundial de la Poliomielitis, el aislamiento y la identificación PV están llevando a cabo mediante el sistema de cultivo celular y en tiempo real RT-PCR, respectivamente. En la era posterior a la erradicación de la energía fotovoltaica, los procedimientos de identificación simple y rápida sería de gran ayuda para la rápida confirmación de casos de polio en los laboratorios nacionales. En el presente estudio, vamos a mostrar el procedimiento de ensayo de la novela de PA desarrollado para la identificación de PV. Este ensayo PA utiliza la interacción de la energía fotovoltaica receptor (PVR) y el virión molécula que es la afinidad específica y uniforme para todos los serotipos de la energía fotovoltaica. El procedimiento es sencillo (un procedimiento de paso en las placas de reacción) y rápido (los resultados se pueden obtener dentro de las 2 h de reacción), y el resultado es visualmente observado (observación de la aglutinación de partículas de gelatina).
Protocol
1. Preparación de medio de mantenimiento (MM) y el crecimiento medio (GM)
Para la preparación de MM y GM, consulte un manual de laboratorio Polio de la OMS 1. Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con 2% de suero fetal bovino (FCS) y el 10% de FCS podrían ser utilizados como sustitutos de la MM y GM, respectivamente.
2. Preparación de anticuerpos anti-PV
- Reconstituir anti-PV anticuerpos (RIVM PV escribiendo antisuero) mediante la adición de agua (0,5 ml por vial) a cada vial de anticuerpos anti-PV (tipo 1, 2, ó 3). Añadir este anticuerpo soluciones reconstituida (0,5 ml cada una) a 4,5 ml de MM por separado en tubos etiquetados.
Nota: Algunos lotes de anticuerpos anti-PV se proporcionan en forma reconstituida (0,5 ml por vial). Para muchos de estos anticuerpos anti-PV, la adición de agua para la reconstitución no es necesario. - Mezcla de igual volumen de reconstitución anti-PV anticuerpos. Para anti-PV1 2, 2 3, o un 3: Mezclar 1,8 ml de cada anticuerpo reconstituida (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 ml de cada mezcla). Para anti-PV1 +2 +3: Mezclar 1,2 ml de cada anticuerpo reconstituida (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 ml).
Nota: las muestras PV podría contener una mezcla de diferentes serotipos de la energía fotovoltaica. Para identificar el serotipo único de la energía fotovoltaica en las muestras con mezcla de valores actuales, las mezclas de anticuerpos anti-PV (es decir, 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) es necesario. - Añadir un volumen 1 / 5 de FCS (0,72 mL) a cada anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1, o 1 +2 +3) de anticuerpos (3,6 ml cada una) (final de 18,2% FCS).
Nota: La adición de FCS es para la reducción de la no-específicas de aglutinación de partículas de gelatina causada por anticuerpos. - Mantenga las piscinas de anticuerpos a -20 ° C hasta su uso en el ensayo de PA.
3. La reconstitución de las partículas de gelatina sensibilizada
- Añadir 1,5 ml de solución tampón de reconstitución incluido en el kit a un vial de partículas de gelatina sensibilizada (siempre como polvo liofilizado).
- Mezclar bien con unos golpecitos suaves
- Mantener la partícula reconstituido sensibilizados a 4 ° C. De partículas de gelatina reconstituido puede estar activo al menos 2 semanas se mantiene a 4 ° C, pero debe estar preparado justo antes de la prueba.
Nota importante:
No mezcle muy diferente de las partículas de gelatina sensibilizada, porque la imagen no aglutinación de partículas de gelatina sensibilizada puede ser diferente por la gran cantidad de las partículas. Para cada experimento, un solo lote de partículas de gelatina sensibilizada debe ser utilizado.
4. PA ensayo para la identificación de PV
- Prepare una placa de micro-titulación. Para la identificación de la muestra de un virus, es necesario + 5 pozos por lo menos un control negativo (partículas sensibilizadas, sin virus y anticuerpos, así # 6 en adelante. Véase el control de virus y anticuerpos en el ejemplo). El número total de pozos es de 5 x + muestras al menos un control en el ensayo.
Nota importante:
Por favor, tome por lo menos un no control de virus y anticuerpos en el ensayo. Un vial de partículas sensibilizadas es aproximadamente para la identificación de 10 muestras de virus. - Añadir 12 l / pocillo de anticuerpos anti-PV o GM a la placa de micro-titulación. La disposición de la placa es el siguiente (ver también el ejemplo más abajo). En las muestras sin anticuerpos (también # 1 y 6), añadir 12 l de GM en lugar de anticuerpos anti-PV.
Nota importante:
Si muchas muestras de PV debe ser probado en este ensayo, pipetas multicanal o dispensador sería de gran ayuda para este paso.Bueno # 1 Bueno n º 2 Bueno # 3 Bueno # 4 Bien # 5 Así # 6 GM anti-P1 +2 +3 anti-P1 +2 anti-P2 3 ani-P1 3 GM - Añadir 12 l / pocillo de muestra del virus. En una muestra sin virus (y # 6), añadir 12 l de GM en vez de la solución de virus.
Nota: La muestra del virus es el sobrenadante del cultivo de las células infectadas, las células suelen L20B o células RD.
Nota importante:
Si muchas muestras de PV debe ser probado en este ensayo, pipetas multicanal sería de gran ayuda para este paso.Bueno # 1 Bueno n º 2 Bueno # 3 Bueno # 4 Bien # 5 Así # 6 de muestras de virus de muestras de virus de muestras de virus de muestras de virus de muestras de virus GM - Tome la solución reconstituida de partículas sensibilizadas a 4 ° C a la temperatura ambiente, y golpee suavemente para suspender por completo las partículas.
Nota importante:
Después de la suspensión completa de las partículas con unos golpecitos suaves, las partículas se debe agregar de inmediato a las placas antes de las partículas en suspensión precipitaciónte y la forma no homogénea solución. - Añadir 25 l / pocillo de partículas sensibles a todos los pozos.
Nota importante:
Después de la adición de partículas sensibilizadas, la placa debe ser inmediatamente sometidos a la placa de mezcla para empezar la reacción uniforme de las muestras. Por lo tanto, la adición de partículas sensibilizadas se debe realizar mediante el uso de dispensadores de reducir al mínimo un lapso de tiempo entre las muestras de la placa. - Coloque la placa de micro-titulación en un mezclador de la placa y la mezcla de la placa durante 30 segundos.
- Coloque la placa de micro-titulación en papel blanco (para mayor comodidad de la observación visual) en una mesa a temperatura ambiente (15 ~ 30 ° C) durante 2 h.
Nota importante:
No mueva el plato durante y después de la reacción para la observación de los resultados y tomar fotos. La aglutinación formado no es estable y fácilmente perturbados por movimiento de las placas. - Tomar fotos de la placa.
Nota importante:
Vista parcial de las fotos no podía dar datos suficientes para su posterior examen y revisión de los resultados para su interpretación. Varias fotos deben ser tomadas para cubrir todos los pocillos de las placas se centra en la imagen de la aglutinación de los pozos.
5. Interpretación de los resultados
- Identificación de pozos positivos y negativos. Comparar la prueba de aglutinación en las muestras con la de No hay control de virus y de anticuerpos (la precipitación de partículas de gelatina, no aglutinación) (Figura 1 y 2). Imágenes de aglutinación que se distingan claramente de ningún virus y sin control de anticuerpos (no de aglutinación, el control negativo) deben ser juzgadas como positivas, y las imágenes de aglutinación que son similares a los del control negativo debe ser juzgada como negativa. Ejemplos que muestran una clara aglutinación parcial, pero sólo podía ser juzgado como positivo, pero el registro como «positiva (aglutinación parcial).
- Identificación de la energía fotovoltaica. Interpretar los resultados sobre la base de los pozos de positivo y negativo con anticuerpos anti-PV anticuerpos para identificar los serotipos PV. Principio de la interpretación del resultado es similar a la de la prueba de neutralización en el sistema de cultivo celular (por ejemplo positivo para anti-P1 +2 anticuerpos indica que la muestra contiene el tipo 3 PV).
6. Resultados representante
Resultado representativo de la PA ensayo de identificación PV se muestra en la Figura 1. Todas las cepas PV formado aglutinación de partículas de gelatina sensibilizada (No existen anticuerpos de muestras). En presencia de los correspondientes anticuerpos anti-PV, la precipitación de partículas de gelatina (no aglutinación), similar a ningún virus y sin control de anticuerpos (control negativo) fue observada (por ejemplo, PV1 (Sabin) en la presencia de anticuerpos anti-P1 +2 o anti-P3 1 anticuerpos).
Figura 1. Identificación de la energía fotovoltaica mediante el ensayo de PA. Soluciones Virus de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) y PV3 (Sabin) (títulos de virus de 1,2 x 10 8 CCID 50 / l 12, 8,2 x 10 7 CCID 50 / 12 l, y 3.5 x 10 7 CCID 50 / 12 l, respectivamente) fueron utilizados para la identificación mediante el ensayo de PA. No hay virus y sin control de anticuerpos mostraron la precipitación de partículas de gelatina (no de aglutinación, el control negativo).
Figura 2. Interpretación de los pozos de positivo y negativo. Soluciones Virus de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) y PV3 (Sabin) (títulos de virus de 2,4 x 10 8 CCID 50 / 25 l, 1,7 x 10 8 l CCID 50 / 25, y 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 l, respectivamente) se diluye 1 / 20 a 1 / 320, y luego 25 l de las muestras diluidas fueron examinados por el ensayo de PA sin anti-PV anticuerpos.
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Discussion
El único punto de este ensayo PA es la utilización de la molécula de PVR en lugar de anticuerpos anti-PV para la detección de FV 2. Esto permite una interacción específica de las partículas sensibilizadas con gelatina de PV con una afinidad uniforme para los tres serotipos de la energía fotovoltaica 3-6. Se utilizó un formulario de inmunoadhesina de PVR (PVR-IgG2a) para la sensibilización de las partículas de gelatina, ya que las formas monoméricas de PVR sólo tienen afinidades moderada al sitio de unión simple en el virión (constante de disociación de 10 -7 ~ -8 M) 7, 8, y con éxito observa aglutinación específica de las partículas de gelatina sensibilizada con los aislados PV. Con la alta especificidad y afinidad uniforme de las partículas sensibilizadas, los factores críticos de la identificación de PV en el ensayo de PA son: 1) título de virus (válida para la detección de la energía fotovoltaica por PA ensayo) y 2) la interpretación de la aglutinación (para la correcta identificación de la energía fotovoltaica) .
En general, los virus aislados de título de la energía fotovoltaica en el sistema de cultivo celular se encuentra en un rango de 6 a 8 octubre CCID 50 / l 50. Los límites de detección del ensayo de PA (que forman la aglutinación completa) para el tipo 1, 2, 3 y PV se 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50 y 9.1x10 5 DICC 50, respectivamente 2. El ensayo PA identificó correctamente la mayoría de los aislamientos de PV, incluso en presencia de otros enterovirus no-PV. Sin embargo, para algunas muestras contenían una mezcla de diferentes serotipos de la energía fotovoltaica, serotipo menor no pudo ser detectado. Aglutinación debe ser formado con títulos de virus suficiente por encima de los límites de detección. En el caso de la aglutinación de anticuerpos de la muestra no está claro o parcial, de los aislamientos deben ser re-amplificado en células RD para aumentar el título 9.
Aglutinación parcial se observó cuando el título del virus es baja y justo por debajo de los límites de detección. Clara diferencia de la aglutinación del control negativo podría considerarse positiva en el ensayo de PA. Sin embargo, la diferencia muy sutil de la aglutinación considerarse positiva podría ser engañoso para la interpretación de los resultados. Por lo tanto, los resultados de la positiva (aglutinación parcial) debe ser utilizado como información de apoyo para posiblemente causada por los serotipos de menor importancia de los aislamientos. Sin embargo, esta información sería de gran ayuda cuando el análisis de lo siguiente (la secuencia del genoma de los aislados PV o en tiempo real RT-PCR) sugirió la posibilidad de que la muestra contenía una mezcla de diferentes serotipos de la energía fotovoltaica, o sólo aglutinación parcial se observó ninguna muestra de anticuerpos en el título del virus de baja sería la principal causa de los resultados poco claros.
La ventaja de la prueba de PA de la energía fotovoltaica es la identificación en la sencillez de la interpretación de procedimiento y el resultado. Esto permitiría fácil introducción de la prueba a todos los laboratorios que realicen el aislamiento PV con el sistema de cultivo celular, sin suministro de equipo especial, los materiales y capacitaciones. La utilización del tipo de anticuerpos monoclonales específicos podría permitir el desarrollo de métodos novedosos para la diferenciación de las venas pulmonares (tipo salvaje o una vacuna similar a las cepas) que proporcionan información importante de la propiedad de la PV aislados junto con la diferenciación genética mediante RT-PCR y la genómica la secuencia 10, 11.
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Disclosures
Souji Masujima es un empleado del Departamento de Diseño de Nuevos Productos, Fujirebio Inc.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a Junko Wada por su excelente asistencia técnica. Estamos agradecidos con el profesor Akio Nomoto de la amabilidad de ofrecer un vector de expresión de baculovirus para el PVR-IgG2a. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones-en-Ayudas a la Promoción de la Erradicación de la Poliomielitis y la Investigación Emergentes y Re-emergentes enfermedades infecciosas del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar Social.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
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- Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
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