Summary
Eine kürzlich entwickelte neuartige Partikelagglutinations (PA)-Assay unter Verwendung von Virus-Rezeptor-Molekül erlaubt eine schnelle und einfache Identifizierung des Poliovirus (PV). In diesem Artikel werden wir das Verfahren für die PA-Assay für PV ausweisen.
Abstract
In der Global Polio Eradication Initiative spielt Labordiagnostik eine entscheidende Rolle durch die Isolierung und Identifizierung von PV aus der Stuhlproben von akuten schlaffen Lähmungen (AFP) Fällen. In der World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV Isolierung und Identifizierung werden derzeit durch Zellkultur-System und real-time RT-PCR bzw. durchgeführt. In der post-Eradikation Ära der PV, wäre eine einfache und schnelle Identifizierung Verfahren hilfreich sein für die schnelle Bestätigung der Polio-Fälle auf der nationalen Laboratorien. In der vorliegenden Studie zeigen wir das Verfahren von neuen PA-Assay für PV Identifikation entwickelt. Das PA-Assay nutzt Zusammenspiel von PV-Rezeptor-(PVR)-Molekül und Virion, dass bestimmte und einheitliche Affinität zu allen Serotypen von PV ist. Das Verfahren ist einfach (eine Schritt-Verfahren in Reaktion Platten) und schnelle (Ergebnisse können innerhalb von 2 h Reaktionszeit erhalten werden), und das Ergebnis wird visuell beobachtet (Beobachtung der Agglutination von Gelatine-Partikel).
Protocol
1. Vorbereitung der Wartung Medium (MM) und Wachstumsmedium (GM)
Für die Herstellung von MM und GM finden Sie auf einer Polio-Labor Handbuch des WHO 1. Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 2% fetalem Kälberserum (FCS) und 10% FCS als Ersatz von MM und GM verwendet werden könnten, bzw. ergänzt.
2. Herstellung von anti-PV-Antikörper
- Rekonstituieren anti-PV-Antikörper (RIVM PV Eingabe Antiserum) durch Zugabe von Wasser (0,5 ml pro Flasche) zu jeder Flasche des Anti-PV-Antikörper (Typ 1, 2 oder 3). Fügen Sie diese rekonstituierte Antikörper-Lösungen (0,5 ml) auf 4,5 mL MM in separaten beschrifteten Röhrchen.
Hinweis: Einige viele anti-PV-Antikörper werden als gebrauchsfertige Form (0,5 ml pro Flasche) zur Verfügung gestellt. Für eine solche Menge von anti-PV-Antikörper, ist der Zusatz von Wasser für die Zubereitung nicht erforderlich. - Mix gleichen Volumen der rekonstituierten Anti-PV-Antikörper. Für anti-PV1 +2, 2 +3 oder 3 +1: Mix 1,8 ml jedes rekonstituierte Antikörper (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 ml für jede Mischung). Für anti-PV1 +2 +3: Mix 1,2 ml jedes rekonstituierte Antikörper (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 mL).
Hinweis: PV-Proben konnte ein Gemisch aus verschiedenen Serotypen von PV enthalten. Um einen Serotyp der PV in Proben mit einer Mischung aus PVs zu identifizieren, ist Pools von anti-PV-Antikörper (dh 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) notwendig. - Add 1 / 5 Volumen von FCS (0,72 ml) in jede anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1 oder 1 +2 +3) Antikörper (3,6 mL) (final 18,2% FCS).
Hinweis: Der Zusatz von FCS ist zur Reduzierung von unspezifischen Agglutination von Gelatine Partikel durch Antikörper verursacht. - Halten Sie die Antikörper-Pools bei -20 ° C bis zur Verwendung in PA Assay.
3. Rekonstitution der sensibilisierten Gelatine Teilchen
- Fügen Sie 1,5 ml Rekonstitutionspuffer im Kit mit einem Fläschchen sensibilisiert Gelatine-Teilchen (sofern als gefriergetrocknetes Pulver) enthalten.
- Gut mischen durch leichtes Klopfen
- Halten Sie die rekonstituierte sensibilisiert Partikel bei 4 ° C. Rekonstituierte Gelatine Teilchens sein könnte aktiven mindestens 2 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt, sollte aber kurz vor dem Test vorbereitet werden.
Wichtiger Hinweis:
Mischen Sie keine unterschiedlichen viel sensibilisierter Gelatinepartikel, weil die Nicht-Agglutination Bild sensibilisiert Gelatinepartikel anders sein könnte, indem die Menge der Teilchen. Für jedes Experiment, soll eine einzige Menge sensibilisiert Gelatine Partikel verwendet werden.
4. PA-Assay für PV Identifikation
- Bereiten Sie eine Mikrotiterplatte. Zur Identifizierung eines Virus-Probe, wir brauchen 5 Brunnen + mindestens eine negative Kontrolle (sensibilisiert Teilchen ohne Virus und Antikörper, sowie Nr. 6 in unten. See No Virus und Antikörper-Steuerung im Beispiel). Anzahl der Bohrungen beträgt 5 x Proben + mindestens eine Kontrolle in dem Test.
Wichtiger Hinweis:
Bitte nehmen Sie sich mindestens eine No-Virus und Antikörper-Kontrolle in den Test. Eine Durchstechflasche sensibilisiert Teilchen ist etwa für die Identifizierung von 10 Virusproben. - Add 12 ul / well anti-PV-Antikörper oder GM, die Mikrotiterplatte. Die Anordnung der Platte ist wie folgt (siehe auch Beispiel unten). In Proben ohne Antikörper (auch Nr. 1 und 6), fügen Sie 12 ul GM anstelle von anti-PV-Antikörper.
Wichtiger Hinweis:
Wenn viele PV-Proben in diesem Test geprüft werden sollte, würde Mehrkanal-Pipetten-oder Dispenser hilfreich sein für diesen Schritt.Nun # 1 Nun # 2 Nun # 3 Nun # 4 Nun # 5 Nun # 6 GM Anti-P1 +2 +3 Anti-P1 +2 Anti-P2 3 ani-T1 +3 GM - Add 12 ul / well des Virus Probe. In einer Probe ohne Virus (auch # 6), fügen Sie 12 ul GM anstelle von Virus-Lösung.
Hinweis: Virus Probe Kulturüberstand der infizierten Zellen, in der Regel L20B Zellen oder RD-Zellen.
Wichtiger Hinweis:
Wenn viele PV-Proben in diesem Test geprüft werden sollte, würde Mehrkanalpipette hilfreich sein für diesen Schritt.Nun # 1 Nun # 2 Nun # 3 Nun # 4 Nun # 5 Nun # 6 Virenprobe Virenprobe Virenprobe Virenprobe Virenprobe GM - Nehmen Sie rekonstituierte sensibilisiert Partikel-Lösung von 4 ° C bis Raumtemperatur, und klopfen Sie leicht vollständig aussetzen Partikel.
Wichtiger Hinweis:
Nach der vollständigen Suspension der Partikel durch leichtes Klopfen, sollten die Teilchen sofort zu den Platten gegeben werden, bevor die suspendierten Teilchen Niederte und bilden nicht-homogene Lösung. - Fügen Sie 25 ul / Vertiefung der sensibilisierten Partikel in jede Vertiefung.
Wichtiger Hinweis:
Nach Zugabe von sensibilisierten Partikel, sollte die Platte sofort auf Platte Mischen unterzogen werden, um eine einheitliche Reaktion der Proben beginnen. Deshalb sollte neben der sensibilisierten Partikel durch Spender zu einer zeitlichen Verzögerung zwischen den Proben in der Platte zu minimieren durchgeführt werden. - Legen Sie die Mikrotiterplatte auf einen Teller Mixer und mischen die Platte für 30 Sekunden.
- Legen Sie die Mikrotiterplatte auf weißem Papier (zur Erleichterung der visuellen Beobachtung) auf einem Tisch bei Raumtemperatur (15 ~ 30 ° C) für 2 h.
Wichtiger Hinweis:
Bewegen Sie sich nicht die Platte, während und nach der Reaktion für die Beobachtung der Ergebnisse und Fotos zu machen. Die gebildeten Agglutination ist nicht stabil und einfach durch Verschieben der Platten gestört. - Machen Sie Fotos von der Platte.
Wichtiger Hinweis:
Teilansicht des Fotos konnte nicht genügend Daten für eine spätere Untersuchung und Überprüfung der Ergebnisse für die Interpretation. Mehrere Fotos zu ergreifen, um all die Vertiefungen der Platten mit Schwerpunkt auf die Agglutination Bild der Brunnen decken.
5. Die Interpretation der Ergebnisse
- Identifikation von positiven und negativen Brunnen. Vergleichen Sie die Agglutination in den Proben mit der No-Virus und Antikörper-Kontrolle (Fällung von Gelatine Partikeln, nicht-Agglutination) (Abbildung 1 und 2). Bilder der Agglutination, die eindeutig aus kein Virus und keine Antikörper-Steuerung (non-Agglutination, Negativ-Kontrolle) unterschieden werden sollte als positiv beurteilt werden, und Bilder von Agglutination, die ähnlich wie die negative Kontrolle sind als negativ beurteilt werden. Proben, die klar, aber nur teilweise Agglutination zeigen könnte als positive, aber die Aufnahme als "positiv (Teil-Agglutination)" beurteilt werden.
- Identifikation von PV. Interpretieren Sie die Ergebnisse auf positive und negative Brunnen mit anti-PV-Antikörper gegen PV-Serotypen identifizieren. Prinzip der Interpretation des Ergebnisses ist ähnlich dem der Neutralisationstest in Zellkultur-System (zB positiv für anti-P1 +2 Antikörper zeigt, dass die Probe vom Typ 3 PV enthält).
6. Repräsentative Ergebnisse
Repräsentatives Ergebnis von PA Assay PV Identifikation ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle PV-Stämme gebildet Agglutination der sensibilisierten Gelatine-Partikel (keine Antikörper-Proben). In Anwesenheit von entsprechenden anti-PV-Antikörper, Fällung von Gelatine-Partikel (non-Agglutination) ähnlich kein Virus und keine Antikörper-Steuerung (negative Kontrolle) beobachtet wurde (z. B. PV1 (Sabin) in Gegenwart von anti-P1 +2 oder anti-P3 1-Antikörper).
Abbildung 1. Identifikation von PV durch PA Assay. Virus-Lösungen von PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) und PV3 (Sabin) (Virustiter von 1,2 x 10 8 CCID 50 / 12 ul, 8,2 x 10 7 CCID 50 / 12 ul, und 3,5 x 10 7 CCID 50 / 12 ul,), wurden für die Identifizierung von PA-Assay verwendet. Kein Virus und keine Antikörper-Kontrolle zeigte Fällung von Gelatine-Partikel (non-Agglutination, Negativ-Kontrolle).
Abbildung 2. Die Interpretation der Positive and Negative Brunnen. Virus-Lösungen von PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) und PV3 (Sabin) (Virustiter von 2,4 x 10 8 CCID 50 / 25 ul, 1,7 x 10 8 CCID 50 / 25 ul, und 7,3 x 10 7 CCID 50 / 25 ul bezeichnet) wurden verdünnt 1 / 20 bis 1 / 320 und dann 25 ul der verdünnten Proben wurden durch PA-Assay ohne Anti-PV-Antikörper untersucht.
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Discussion
Die einzigartige Punkt dieser PA-Assay ist die Nutzung von PVR-Molekül statt Anti-PV-Antikörper für den Nachweis von PV 2. Dies ermöglicht eine spezifische Wechselwirkung der sensibilisierten Gelatinepartikel mit PV mit einer einheitlichen Affinität zu allen drei Serotypen des PV 3-6. Wir benutzten einen Immunoadhäsin Form von PVR (PVR-IgG2a) für die Sensibilisierung der Gelatine Partikeln, weil monomeren Formen der PVR nur moderate Affinitäten zu den einzelnen Bindungsstelle am Virion (Dissoziationskonstante von 10 -7 ~ -8 M) 7 haben, 8, und erfolgreich beobachtet spezifische Agglutination der sensibilisierten Gelatinepartikel mit PV-Isolate. Mit der hohen Spezifität und Affinität Uniform der sensibilisierten Partikel, sind die kritischen Faktoren der PV Identifikation in der PA-Assay 1) Virustiter (für gültige Nachweis der PV durch PA-Assay) und 2) Interpretation der Agglutination (für die korrekte Identifikation von PV) .
Generell Isolaten Virustiter von PV in der Zellkultur-System ist in einer Reihe von 6 bis 8 Oktober CCID 50 / 50 ul. Die Nachweisgrenzen der PA Assay (Bildung komplette Agglutination) für Typ-1, 2 und 3 PV wurden 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50 und 9.1x10 5 CCID 50, bzw. 2. Die PA-Assay korrekt identifiziert die meisten der PV-Isolate auch in der Gegenwart anderer nicht-PV Enteroviren. Bei einigen Proben enthielten eine Mischung aus verschiedenen Serotypen von PV, nicht geringe Serotyp nachgewiesen werden. Klare Agglutination sollte mit ausreichender Virustiter über der Nachweisgrenze gebildet werden. Im Falle der Agglutination in No Antikörper Probe war unklar oder teilweise, sollten die Isolate in RD-Zellen erneut verstärkt werden, um den Titer 9 zu erhöhen.
Teilweise Agglutination beobachtet, wenn die Virustiter war gering und nur unter der Nachweisgrenze. Deutlicher Unterschied der Agglutination von Negativ-Kontrolle könnte als positive in PA-Assay beurteilt werden. Allerdings, ganz feine Unterschied der Agglutination als positiv irreführen könnten die Interpretation der Ergebnisse beurteilt. Daher sollten die Ergebnisse der Positiv (partielle Agglutination) als unterstützende Informationen für eventuell durch kleinere Serotypen der Isolate verursacht werden. Allerdings würden diese Informationen hilfreich sein, wenn folgende Analyse (Sequenzierung des PV-Isolate oder real-time RT-PCR) schlug eine Möglichkeit, dass die Probe eine Mischung aus verschiedenen Serotypen von PV enthalten ist, oder der nur teilweisen Agglutination wurde keine Antikörper Probe beobachtet, wo die niedrige Virustiter wäre die Hauptursache der unklaren Ergebnissen.
Der Vorteil der PA-Assay für PV Identifikation ist in der Einfachheit des Verfahrens und Interpretation der Ergebnisse. Dies würde ermöglichen eine einfache Einführung des Tests zu jeder Laboratorien, die PV-Isolation mit der Zellkultur-System, und ohne spezielle Ausrüstung, Material und Schulungen. Die Nutzung von Typ-spezifische monoklonale Antikörper ermöglichen könnten die Entwicklung neuer Verfahren für die Differenzierung von PVs (Wildtyp oder Impfstoff-like-Stämme), die wichtige Informationen für das Eigentum des PV bieten würde Isolate zusammen mit genetischen Differenzierung von RT-PCR und genomischer Sequenzierung 10, 11.
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Disclosures
Souji Masujima ist ein Mitarbeiter der New Product Design Department, Fujirebio Inc.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, Junko Wada für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken Prof. Akio Nomoto für die freundliche Bereitstellung eines Baculovirus-Expressionsvektors für PVR-IgG2a. Diese Studie wurde teilweise unterstützt von Grants-in-Aid für die Förderung der Ausrottung der Kinderlähmung und Forschung für neu auftretende und neu auftretender Infektionskrankheiten vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Soziales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
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