Summary
Poliovirus (PV) virüs alıcı molekül kullanan son zamanlarda geliştirilen bir roman partikül aglütinasyon (PA) tahlil hızlı ve kolay bir kimlik izin verdi. Bu makalede, biz PA PV kimlik tayini için prosedür gösterecektir.
Abstract
Küresel Polio Eradikasyon Girişimi, laboratuvar tanısı, akut flask paralizi (AFP) vakalarının dışkı örneklerinden izole edilip tanımlanması PV kritik bir rol oynamaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Küresel Polio Laboratuvarı Network, PV izolasyon ve tanımlama şu anda sırasıyla hücre kültürü sistemi ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanılarak yapılmaktadır. PV-eradikasyonu sonrası çağda, basit ve hızlı bir şekilde tespit işlemleri ulusal laboratuvarlar çocuk felci vakalarının hızlı onay için yararlı olacaktır. Bu çalışmada, biz PV tanımlanması için geliştirilen roman PA testinin prosedürü gösterecektir. Bu PA testi PV reseptör (PVR) molekülü ve PV tüm serotipleri belirli ve düzgün bir benzeşme virion etkileşimi kullanmaktadır. İşlem son derece basittir (reaksiyon plakalar bir adım prosedürü) ve hızlı (sonuçlar reaksiyon 2 saat içinde elde edilebilir), ve sonuç görsel (jelatin parçacıkların aglütinasyon gözlem) görülmektedir.
Protocol
1. Bakım ortamın hazırlanması (MM) ve büyüme ortamı (GM)
MM ve GM hazırlanması için, 1 Çocuk Felci laboratuar kılavuzuna bakın lütfen. Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM),% 2 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 10 FCS sırasıyla, MM ve GM yerine kullanılabilecek ile desteklenmiştir.
2. Anti-PV antikorların hazırlanması
- Anti-PV antikor (tip 1, 2 veya 3) Her flakon (vialde 0.5 ml) su ekleyerek sulandırın anti-PV antikor (RIVM PV yazarak antiserum). Bu sulandırılmış antikor çözümleri (her biri 0.5 mL), MM ayrı etiketli tüpler 4,5 ml ekleyin.
Not: Bazı anti-PV antikor birçok sulandırılmış formu (vialde 0.5 mL) olarak verilmiştir. Anti-PV antikor böyle bir lot için, sulandırıldıktan için su eklenmesi gerekli değildir. - Sulandırılmış bir anti-PV antikor eşit miktarda karıştırın. Anti-PV1 +2, 2 +3 veya 3 +1: Mix her sulandırılmış antikor 1.8 mL (1.8 mL her bir karışım için + 1.8 ml = 3.6 ml). Anti-PV1 +2 +3: 1.2 mL (1.2 mL + 1.2 ml + 1.2 ml = 3.6 mL) her sulandırılmış antikor karıştırın.
Not: PV örnekleri PV farklı serotipleri bir karışımını içerebilir. PV'lerin karışımı ile örneklerinde PV tek serotip tanımlamak için gerekli olan, anti-PV antikorları (yani 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) havuzları. - FCS (0.72 ml) 1 / 5 birim, her anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) antikoru (3.6 mL Her) (son 18.2% FCS) ekleyin.
Not: FCS eklenmesi non-spesifik antikorların yol açtığı jelatin parçacığın aglütinasyon azaltılması için. - -20 ° C'de PA tayininde kadar antikor havuzları tutun.
3. Sensitize jelatin parçacık, Sulandırma
- Sensitize jelatin parçacığın bir flakon (dondurularak kurutulmuş toz olarak verilmiştir) kiti dahil sulandırıldıktan tampon 1,5 ml ekleyin.
- Nazik dokunarak iyice karıştırınız.
- 4 sulandırılmış sensitize parçacık ° C tutun Sulandırılmış jelatin parçacık, 4 ° C'de muhafaza en az 2 hafta aktif olabilir, ancak testin hemen önce hazırlanmalıdır.
Önemli not:
Sensitize jelatin parçacıklar olmayan aglütinasyon görüntü parçacıkların çok farklı olabilir, çünkü farklı sensitize jelatin parçacıklar çok karışmaz. Her deney için, tek bir çok hassaslaşmış jelatin parçacık kullanılmalıdır.
4. PV kimlik PA testi
- Bir mikro-titrasyon tabak hazırlayın. Bir virüs örneği tanımlanması için, 5 kuyu gerekir + en az bir negatif kontrol (aşağıda sensitize virüs ve antikor olmadan parçacık, iyi # 6 Örnek hiçbir virüs ve antikor kontrol bakınız). Toplam kuyu sayısı 5 x örnekleri tahlil + en az bir kontrol.
Önemli not:
Tayininde en az bir virüs ve antikor kontrol ayırın. Sensitize parçacık Bir flakon için yaklaşık 10 virüs örneklerinin belirlenmesi. - Mikro-titrasyon plaka 12 mcL / anti-PV antikor ya da GM ekleyin. (Aşağıdaki örneğe bakın) aşağıdaki gibi plaka düzenlemedir. Antikor (iyi # 1 ve 6) neden olmadan numunelerin, 12 GM mcL yerine anti-PV antikor ekleyin.
Önemli not:
Bu testte birçok PV örnekleri test edilmesi gerekir, çok kanallı pipet veya dağıtıcı Bu adım için faydalı olacaktır.Eh # 1 Eh # 2 Eh # 3 Eh # 4 Eh # 5 Eh # 6 GM anti-P1 +2 +3 anti-P1 2 anti-P2 3 ani-P1 3 GM - / Iyi virüs örneği 12 mcL ekleyin. Virüs olmayan bir örnek (iyi # 6), 12 GM mcL virüs çözümü yerine ekleyin.
Not: Virüs örnek, enfekte olmuş hücreleri, genellikle L20B hücreleri veya RD hücre kültürü süpernatant.
Önemli not:
Birçok PV numuneleri bu testte test edilecek olursa, çok kanallı pipet, bu adım için faydalı olacaktır.Eh # 1 Eh # 2 Eh # 3 Eh # 4 Eh # 5 Eh # 6 virüs örneği virüs örneği virüs örneği virüs örneği virüs örneği GM - 4 ° C oda sıcaklığına kadar sulandırılmış sensitize parçacık çözümü alın ve hafifçe dokunun parçacıklar tamamen askıya almak.
Önemli not:
Nazik dokunarak parçacıkların tam süspansiyon sonra yağış asılı kalan parçacıkları önce plakaları, parçacıklar hemen eklendi olmalıdırte ve form homojen olmayan bir çözüm. - Tüm kuyuları sensitize parçacık / iyi 25 mcL ekleyin.
Önemli not:
Sensitize parçacık eklenmesinden sonra, plaka örnekleri tek tip tepki hemen başlatmak için karıştırma plaka tabi olmalıdır. Bu nedenle, hassaslaşmış parçacık ek plakasını örnekleri arasında bir zaman farkı en aza indirmek için dağıtıcı kullanarak yapılmalıdır. - Mikro-titrasyon plaka bir plaka mikser üzerine koyun ve 30 saniye için plaka karıştırın.
- Oda sıcaklığında bir masanın üzerine beyaz kağıt üzerinde mikro-titrasyon plaka koyun (görsel gözlem kolaylığı için) (15 ~ 30 ° C) 2 saat
Önemli not:
Plaka sonuçları gözlem ve fotoğraf alma için tepkime sırasında ve sonrasında hareket etmeyin. Oluşan aglütinasyon stabil değildir ve kolayca hareketli plakalar rahatsız. - Plaka fotoğraflar çekin.
Önemli not:
Fotoğrafların Kısmi görünümü, sonuçların yorumlanması için sonraki muayene ve inceleme için yeterli veri veremiyordum. Bazı fotoğraflar, kuyulardan aglütinasyon görüntü odaklanarak plakaların tüm kuyuları kapsayacak şekilde alınmalıdır.
5. Sonuçların Yorumlanması
- Pozitif ve negatif kuyuların belirlenmesi. Hayır virüs ve antikor kontrolü (jelatin parçacıklar, non-aglütinasyon yağış) (Şekil 1 ve 2) bu örnekleri aglütinasyon karşılaştırın. Pozitif olarak değerlendirilecek hiçbir virüs ve hiçbir antikor kontrolü (non-aglütinasyon negatif kontrol) açıkça ayırt aglütinasyon Görüntüler ve aglütinasyon negatif kontrol için benzer görüntüler negatif olarak değerlendirilecektir. Açık, ancak sadece kısmi aglütinasyon gösteren Örnekleri 'Olumlu (kısmi aglütinasyon)' gibi olumlu, ancak kayıt olarak değerlendirilecektir.
- PV belirlenmesi. PV serotipleri belirlemek için anti-PV antikorları ile pozitif ve negatif kuyu dayalı sonuçları yorumlamak. Sonucun yorumlanması ilkesi hücre kültürü sistemi nötralizasyon testi (örneğin anti-P1 2 antikor için pozitif örnek tip 3 PV içerdiğini gösterir) 'e benzer.
6. Temsilcisi Sonuçlar
PA testi PV kimlik Temsilcisi sonucu Şekil 1'de gösterilmiştir. PV suşları sensitize jelatin partikülleri (No antikorlar örnekleri) aglütinasyon kurdu. Karşılık gelen anti-PV antikorları Hayır virüs benzer jelatin parçacıklar (non-aglütinasyon), yağış ve hiçbir antikorlar kontrolü (negatif kontrol) varlığında (örneğin, PV1 (Sabin) veya anti-P1 +2 varlığı gözlendi anti-P3 +1 antikorlar).
Şekil 1. PV1 (Sabin) PA yöntemi ile PV belirlenmesi Virüs çözümleri, PV2 (Sabin) ve PV3 (Sabin) (1.2 x 10 8 CCID 50 / 12 mcL, 8.2 x 10 7 CCID 50/12 mcL virüs titreleri ve 3,5 x 10 7 CCID 50/12 sırasıyla mcL), PA yöntemi ile belirlenmesi için kullanılmıştır . Hayır virüs ve hiçbir antikorlar kontrolü jelatin partikülleri (non-aglütinasyon, Negatif kontrol) yağış gösterdi.
Şekil 2. Pozitif ve Negatif kuyu PV1 (Sabin) Virüs çözümleri, PV2 (Sabin) ve PV3 (Sabin) (2.4 x 10 8 CCID 50 / 25 mcL virüs titreleri, 1.7 x 10 8 CCID 50 / 25 mcL, yorumlanması. sırasıyla 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 mcL), 1 / 320 1 / 20 sulandırılmış, ve daha sonra seyreltilmiş örneklerinin 25 mcL anti-PV antikorları olmadan PA yöntemi ile incelendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu PA testinin benzersiz bakış PV 2 tespiti için anti-PV antikor PVR molekülünün yerine kullanılmasıdır. Bu PV 3-6 üç serotipe düzgün bir yakınlığa sahip PV ile sensitize jelatin parçacıklar belirli bir etkileşim sağlar. PVR monomerik formları virion tek bağlayıcı site sadece orta yakınlık (~ -8 M 10 -7 asitlik sabiti) 7 çünkü, jelatin parçacıklar hassasiyete PVR immunoadhesin formu (PVR IgG2a) 8 ve başarıyla PV izolatların sensitize jelatin parçacıklar belirli aglütinasyon gözlenmektedir. Yüksek özgüllük ve sensitize parçacıkların aynı afinite ile virüs titresi (PA testi ile PV geçerli tespiti için) ve 2) aglütinasyon yorumlanması (PV doğru tanımlama için), PA tahlil PV kimlik kritik faktörler 1) .
Genelde, virüs titresi PV hücre kültürü sistemi izole 10 6 ila 8 CCID 50 / 50 mcL bir dizi. Tip 1, 2, ve 3 PV PA assay (tam aglütinasyon oluşturan) tespit limitleri 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50, sırasıyla 9.1x10 5 CCID 50, 2. PA tahlil doğru PV belirlenen diğer non-PV enterovirüslerin varlığında bile ayırır. Ancak, bazı örnekler için PV farklı serotipleri bir karışımını içeriyordu, küçük serotip tespit edilmesi başarısız oldu. Clear aglütinasyon tespit limitleri üzerinde yeterli virüs titresi ile oluşturulmalıdır. Antikorlar örnek yok aglütinasyon belirsiz ya da kısmi durumda, izolatların titresi 9 arttırmak için RD hücreleri yeniden amplifiye edilmelidir.
Kısmi aglütinasyon virüs titresi düşük ve sadece algılama limitlerin altında iken gözlendi. PA testinin pozitif olarak değerlendirilir negatif kontrol aglütinasyon açık bir fark olabilir. Ancak, oldukça ince bir fark aglütinasyon pozitif yanıltmak sonuçlarının yorumlanması olarak değerlendirilir. Bu nedenle, Pozitif (kısmi aglütinasyon) sonuçları muhtemelen izolatların küçük serotipleri neden olduğu için destekleyici bilgi olarak kullanılmalıdır. Basın Aşağıdaki analiz (PV izolatları veya gerçek zamanlı RT-PCR genomik sıralama), örnek PV farklı serotipleri bir karışımı içeren, ya da sadece kısmi aglütinasyon yok antikorlar örnek için gözlendi bir olasılık önerisi Ancak, bu bilgiler yararlı olacaktır düşük virüs titresi en önemli nedeni belirsiz sonuçlar olacaktır.
PV tanımlanması için PA testinin avantajı prosedürü ve sonuç yorumlama basitlik. Bu, özel ekipman, malzeme ve eğitimler vermeden, hücre kültürü sistemi ile PV izolasyon yapan her laboratuvarlarda tahlil kolay giriş sağlayacak. Türüne özgü monoklonal antikorlar kullanımı PV mülkiyet önemli bilgiler sağlayacak PV'lerin farklılaşma (yabani türü veya suşların aşı gibi) için yeni bir yöntem geliştirilmesi RT-PCR ve genomik genetik farklılaşma ile birlikte izole izin verebilir sıralama 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yeni Ürün Tasarımı Bölümü, Fujirebio Inc. Souji Masujima bir çalışanın
Acknowledgments
Junko Wada Biz onu mükemmel teknik yardım için teşekkür ediyoruz. Prof Akio Nomoto PVR-IgG2a için nazik bir bakülovirüs ifade vektör sağlamak için minnettarız. Bu çalışma kısmen desteklenen Hibeler Yardım Polio Eradikasyon Tanıtım ve Araştırma, Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı Emerging Infectious Diseases ve yeniden ortaya çıkan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
- World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
- Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
- Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
- Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
- Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
- Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
- Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
- McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
- Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
- Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
- Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
