Summary

רצף של מיקרופלורת חיידקים דם היקפיים: הניסיון שלנו עם HIV נגועים חולים

Published: June 11, 2011
doi:

Summary

הניסוי שלנו יציגו כיצד לבצע ניתוח רצף של מינים translocating חיידקי בדם ההיקפי של חולי איידס.

Abstract

מערכת העיכול בריאה מבחינה פיזיולוגית יישבו על ידי מגוון רחב של חיידקים commensal המשפיעים על התפתחות של 1,2 מערכת הריריות הלחות ואת החיסונית התאית.

החיידקים הוא מוגן מפני מערכת החיסון דרך מחסום הרירית חזק. זיהומים ואנטיביוטיקה ידועים לשנות גם את המכשול נורמלי מערכת העיכול ואת הרכב של חיידקים תושב, אשר עלול לגרום הפרעות החיסון ניתן 3.

HIV גורם פרצה מחסום העיכול עם כישלון מתמשך של חסינות זליגת הרירית תוך מחזור מערכתי של bioproducts חיידקי, כגון lipopolysaccharide ושברי DNA בקטריאלי, אשר תורמת להפעלת מערכת החיסון מערכתית 4-7. טרנסלוקציה מיקרוביאלית הוא מעורב immunopathogenesis HIV / איידס ועל התגובה לטיפול 4,8.

אנו שמטרתו לאפיין את ההרכב של חיידקים translocating בדם ההיקפי של HIV-נגועים. כדי לרדוף אחרי המטרה שלנו הקמנו תגובת PCR עבור הגן 16S panbacteric ribosomial ואחריו ניתוח רצף.

בקצרה, כל דם משני הנושאים HIV נגועים ובריאים משמש. בהתחשב בעובדה אנשים בריאים הנוכחית הומאוסטזיס מעיים רגילה ללא טרנסלוקציה של מיקרופלורת צפוי בחולים אלו. לאחר איסוף הדם כולו על ידי venipuncture והפרדה פלזמה, הדנ"א מופק פלזמה המשמש לביצוע מגוון רחב PCR תגובה עבור 16S panbacteric ribosomial גן 9. ניתוחים לאחר טיהור PCR המוצר, שיבוט רצף מבוצעות.

Protocol

טיפול של דגימות דם נגוע ב-HIV דורש כמה המלצות חשובות. דגימות דם של כל חייב להיות מועבר דליפה הוכחה מכולות חזקים. יש להקפיד בעת לקיחת הדגימה, כדי למנוע זיהום חיצוני של מכולה של כל הניירת המלווה את הדגימה. כל האנשים עיבוד דם נגוע חייב ללבוש כפפות. כפפות יש לשנות לרח?…

Discussion

<p class="jove_content"> הננו להראות פרוטוקול ה-PCR / ריצוף לאפיין את טרנסלוקציה של חיידקים דם היקפיים של HIV-נגוע יחידים.</p><p class="jove_content"> תוצאות אמינות ביותר מתקבלים בעת שימוש פלזמה שנאספו EDTA המכילים צינורות. לאחר דגימה דם, פלזמה צריכים להיות מופרדים על ידי צנטריפוגה בתוך 2 / 3 שעות, כדי למנוע שבר השפלה haemolysis ו-DNA. ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה ג'יאני Scimone לסיוע מעולה עם ביצוע וידאו.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
Easty-DNA Kit Invitrogen K 180001  
Chloroform Sigma-Aldrich C2432  
Ethanol Sigma-Aldrich E7203  
UltraPure Waer Invitrogen 10977049  
Lysozyme Fluka 62970 10 μg/mL in Distillated Water
AmpliTaq Gold Applied Biosystem 26478701  
Microcon 100 Millipore 42413  
PCR primers Invitrogen    
Agarose Eppendorf C1343  
DNA ladder Invitrogen 15628019  
Purelink PCR micro kit Invitrogen K310050  
LB Agar, powder Invitrogen 22700025  
Bactoagar Invitrogen    
Ampicillin Invitrogen 11593027 10 mg/mL in Distillated Water
X-gal Invitrogen 15520034 40mg/mL in DMF
IPTG Invitrogen 15529019 100mM in Distillated water
Topo TA cloning kit Invitrogen K450002  
Purelink Quick Plasmid Miniprep kit Invitrogen K210010  
Big dye Applied Biosystem 4337455  
DyeEx 2.0 spin kit Qiagen 63204  

References

  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
  2. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
  3. Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease. Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).
  4. Brenchley, J. M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).
  5. Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe. Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).
  6. Jiang, W. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).
  7. Marchetti, G. Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy. AIDS. 22, 2035-2038 (2008).
  8. Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. , (2010).
  9. Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).

Play Video

Cite This Article
Merlini, E., Bellistri, G. M., Tincati, C., d’Arminio Monforte, A., Marchetti, G. Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients. J. Vis. Exp. (52), e2830, doi:10.3791/2830 (2011).

View Video