Ons experiment zal laten zien hoe je een sequencing analyse van bacteriële soorten transloceren in het perifere bloed van HIV-positieve patiënten uit te voeren.
De gezonde maag-darmkanaal is fysiologisch gekoloniseerd door een grote verscheidenheid aan commensale microben die de ontwikkeling van de humorale en cellulaire mucosale immuunsysteem 1,2 beïnvloeden.
Microbiota is afgeschermd van het immuunsysteem via een sterke mucosale barrière. Infecties en antibiotica is bekend dat zowel de normale maag-darmkanaal barrière en de samenstelling van de ingezeten bacteriën, wat kan leiden tot mogelijke immuun afwijkingen drie veranderen.
HIV veroorzaakt een breuk in de gastro-intestinale barrière met progressieve uitval van mucosale immuniteit en lekkage in de systemische circulatie van bacteriële bioproducten, zoals lipopolysaccharide en bacteriële DNA-fragmenten, die bijdragen tot systemische activering van het immuunsysteem 4-7. Microbiële translocatie is betrokken in HIV / AIDS immunopathogenese en de respons op de therapie 4,8.
Ons doel was om de samenstelling van de bacteriën transloceren in het perifere bloed van HIV-geïnfecteerde patiënten te karakteriseren. Na te streven ons doel hebben we het opzetten van een PCR-reactie voor de panbacteric 16S ribosomial gen, gevolgd door een sequentie-analyse.
In het kort, is volbloed van zowel HIV-geïnfecteerde en gezonde proefpersonen gebruikt. Gezien het feit dat gezonde personen normale darm homeostase momenteel geen translocatie van microflora wordt verwacht in deze patiënten. Na de hele bloedafname door venapunctie en plasma scheiding, wordt DNA geëxtraheerd uit plasma en wordt gebruikt om een breed scala PCR-reactie voor de panbacteric 16S ribosomial gen 9 uit te voeren. Na de PCR product zuivering, klonen en sequencing analyses worden uitgevoerd.
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar Gianni Scimone voor een uitstekende hulp bij het maken van video.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
PCR primers | Invitrogen | ||
Agarose | Eppendorf | C1343 | |
DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
Bactoagar | Invitrogen | ||
Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |