Summary
AD의 병리 학적 특징 중 하나는 아밀로이드 β 단백질의 긍정적인 neuritic plaques의 형성이다. immunohistochemical 감지 thioflavin S 얼룩 방법을 사용하여 ABC와 DAB 방법과 형광 검출을 사용하여이 프로토콜에서 우리는 유전자 변형 AD 모델 마우스에서 neuritic plaques를 감지하는 두 가지 방법을 설명합니다.
Abstract
알츠하이머 병 (AD)은 치매로 이어지는 가장 일반적인 neurodegenerative 무질서이다. Neuritic 플라크 형성이 알츠하이머 질환의 병리 학적 특징 중 하나입니다. neuritic plaques의 중심 구성 요소는 β - secretase와 γ - secretase에 의해 베타 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차 proteolytic 절단에서 파생되는 작은 filamentous 단백질이라는 아밀로이드 β 단백질 (Aβ) 1입니다. 아밀로이드 가설 AD 병리 2 기본 독성 메커니즘으로 plaques을 Aγ 함유 것을 알아볼 수 있습니다. neuritic 플라크의 존재의 사후 분석 AD의 진단을 확인합니다. 광고 pathogenesis에 Aγ 신경 생물학 우리의 이해를 더하기 위해 인간의 APP의 유전자에 AD 관련 변이를 표현하는 다양한 마우스 종자가 생성되었습니다. 질병의 정도에 따라,이 마우스는 다른 연령대에 neuritic plaques을 개발합니다. 이 생쥐는 APP 처리 경로와 neuritic 플라크 형성에 영향을 미칠 수있는 pathogenesis 및 약물 개발 연구를위한 귀중한 도구 역할을합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 광고 모델 마우스에서 neuritic plaques의 구체적인 검출을위한 immunohistochemical 방법을 사용합니다. thiofalvin S 얼룩 방법을 사용하여 ABC와 DAB 방법과 형광 검출을 사용 immunohistochemical 감지 : 우리는 구체적으로 절반 뇌, paraformaldehyde 고정, cryosectioning 및 광고 형질 전환 마우스에서 신경질 plaques를 감지하는 두 가지 방법을 추출에서 준비에 대해 설명합니다.
Protocol
1. 마우스 두뇌의 고정 및 cryosectioning
- 유전자 변형 생쥐는 잘린 및 추출 두뇌 뒤에 이산화탄소 가스를 사용하여 희생하고 있습니다.
- 두뇌는 중앙에 길이 방향 해부하는 것입니다. 두뇌의 절반은 생화 학적 분석을위한 드라이 아이스에 냉동 플래시됩니다. 다른 4 적어도 48 시간 동안 4 % paraformaldehyde (PFA)에 빠져들 것이다 ° C.
- 최소한 48 시간 4% PFA에 고정 후, 헤미의 두뇌는 30 % 자당 용액에 직접 전송하고 4 배치 ° C. 시점에서, 헤미의 두뇌는 자당 솔루션에 떠 있어야합니다. 헤미의 두뇌는 보통 48시간에 대한 요구, 아래로 침몰하면 cryosectioning 위해 OCT에 포함된 될 준비가 된 것입니다.
- cryosectioning 전에 손잡이에서 OCT의 얇은 레이어를 탑재하고 -20 ° C.에서 프리즈 수 냉동 OCT의 레이어에 헤미의 두뇌와 장소의 나머지에서 소뇌를 제거합니다. 즉시 OCT와 헤미 두뇌를 커버 천천히 -20 ° C.에서 프리즈 수 두뇌가 불투명 켜져있는 OCT의 포함되면, 그것은 sectioned 될 준비가 된 것입니다.
- 30 μm의 각 부분의 두께를 설정합니다. D' Olomos 솔루션과 용기에 각각의 슬라이스를 수집합니다.
2. neuritic plaques에 대한 Immunohistochemistry 절차 (무료 부동 섹션)
- 15 분 동안 88% 개미 산성의 각 섹션을 처리합니다. 개미 산성 치료 후 섹션은 일시적으로 불투명 설정하고, 주름에 나타날 수 있습니다.
- 부드러운 잡고 5 분 X 3 TX - PBS (0.3 % 트리톤 PBS에서 X - 100)와 접시와 세척에 각 섹션을 제거합니다.
- 블록 내생 과산화수소는 0.5 % TX - PBS, RT에서 H 2 O 2 부드러운 잡고 30 분 차단.
- 부드러운 잡고 10 분 X 3 TX - PBS로 섹션을 씻으십시오.
- 부드러운 잡고 1 시간 동안 실온에서 TX - PBS에 용해 5% 아닌 지방 탈지 우유와 함께 블록 섹션을 참조하십시오.
- TX - PBS는 4에서 5 %의 우유를 포함하는으로 희석 주 항체의 섹션 (4G8을 Biotinylated, 1:500-1:2000, 인장) ° C 부드러운 잡고 하룻밤. 품어
- 부드러운 잡고 10 분 X 3 TX - PBS로 섹션을 씻으십시오.
- ABC 솔루션 다음과 같은 제조 업체의 프로토콜 (엘리트 ABC, 벡터 연구소를) 준비. 부드러운 잡고 30 분 ABC 혼합물의 섹션을 품어.
- 부드러운 잡고 10 분 X 3 TX - PBS로 섹션을 씻으십시오.
- 3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB) (벡터 연구소) 다음과 같은 제조 업체의 프로토콜을 준비합니다. 50-10 분 DAB 혼합물의 섹션을 품어. 이 시점에서, 당신은 갈색 색상이 각 부분에 대한 개발 준수합니다.
- 부드러운 잡고 10 분 X 3 TX - PBS로 섹션을 씻으십시오.
- 자유 부동 뇌 섹션은 조직 부착을 도울 수 있도록 젤라틴 코팅 슬라이드에 장착됩니다. 섹션 공기가 크실렌의 일련 취소하여 다음과 Entellen에 탑재 건조 후 수 있습니다.
- Plaques은 40X 배율의 빛을 현미경 하에서 시각 있으며, 각각의 마우스에 대한 슬라이스 당 의미 플라크 수를 평가하여 계량하고 있습니다.
3. Thioflavin S는 neuritic plaques의 검출을위한 절차를 염색법
- 마우스 희생과 두뇌 추출 절차와 같은 섹션 1.1 1.5로 표시됩니다.
- 산 4-5 헤미 뇌 유리 슬라이드에 섹션과 완전히 얼룩하기 전에 건조 공기 수 있습니다.
- 1 분 70 % 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오.
- 1 분 80 %를 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오.
- 15 분 동안 필터링 (0.2 μm의 필터) thioflavin S 솔루션 (에탄올 80 %에서 1 %)에 슬라이드를 품어. (Thioflavin S 솔루션은 각각의 사용하기 전에 필터링해야합니다.) 참고 : 빛과 thioflavin S를 보호하고 빛으로부터 스테인드 슬라이드를 보호합니다.
- 1 분 80 %를 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오.
- 70 % 에탄올 일분과 슬라이드를 씻으십시오.
- 증류수로 두 번 씻으십시오.
- 수성 장착 미디어와 슬라이드 투명 매니큐어로 밀봉 coverslip 뒤에 최소한 2 시간 동안 짙은 어둠 속에서 건조 수 있도록 마운트 슬라이드. 스테인드 섹션 4의 어둠 속에 보관해야 ° C.
- 녹색 형광 스테인드 plaques는 형광 microscropy과 시각 수 있습니다. 얼룩이 시간 함께 사라질 것이다 때문에 일주일 이내 슬라이드를 분석할 수 있습니다.
4. 대표 결과
안티 간질 약물과 neuritic 플라크 형성을 억제하는 기분 안정제 valproic 산성 (VPA)의 효능에 대한 최근 연구에서는, 우리는 위에서 설명한 immunostaining을 사용하고 thioflavin S는 광고 모델 마우스 (3)에서 neuritic plaques를 식별하는 절차를 염색법. 그림 1은 안티 Aβ 사용하여 biotinylated 4G8 물들일과 ABC 방식을 통해 감지 전형 9개월 된 APP23 형질 전환 마우스를 나타냅니다. Neuritic plaques는 명확하게 항체으로 표시되며 흰색 화살표로 표시됩니다. thioflavin S 얼룩을 사용하여, 우리는 2 달이 넘은 APP23xPS 트라 neuritic 플라크 증착을 감지nsgenic 마우스 (그림 2). Thioflavin S 바운드 Aβ 함유 neuritic의 plaques은 형광 현미경 (흰색 화살표로 표시)에서 녹색으로 나타납니다. 우리는 VPA 치료와 neuritic 플라크 형성이 상당히 (3) 감소는 것을 보여주었다. 또 다른 연구에서는, 우리는 분자 링크를 기본 hypoxia 및 광고 pathogenesis을 공부했다. 다시 두 4G8 방지 Aβ immunohistochemistry의 얼룩과 thioflavin S 염색법을 사용하여, 우리는 hypoxia가 neuritic plaques (4)이있는 Aβ의 형성을 촉진 발견했습니다.
그림 1. AD 유전자 변형 생쥐에서 neuritic 플라크 형성 Immunohistochemical 분석 9. 개월 나이에 APP23 생쥐가 희생되었고 해부했다는 고정하고, sectioned. hippocampal에 Neuritic plaques는 안티 Aβ 항체 4G8를 사용하여 감지되었으며 ABC와 DAB 방법을 사용하여 개발되었습니다. plaques은 40X로 가벼운 현미경에 의해 시각되었습니다. 화이트 화살표가 Aβ의 neuritic plaques을 가리 킵니다.
그림 2. AD 모델 생쥐에서 neuritic plaques의 Thioflavin S 얼룩. 올드 8주에서 APP23xPS45 두 유전자 변형 생쥐는 희생되었고 해부되었다, 고정하고, sectioned. hippocampal에 Neuritic 재앙은 thioflavin S 형광 염색법을 사용하여 확인 및 40X 배율에서 현미경에 의해 시각되었습니다 있습니다. 화이트 화살표 thioflavin S 스테인드 neuritic의 plaques를 나타냅니다.
Discussion
biotinylated 표시 4G8 항체 얼룩에게 광고 neuritic plaques를 사용 Immunohistochemistry은 특이성과 쥐를 모델. 얼룩의 결과는 부량 및 다른 치료 그룹 사이의 플라크 부하의 비교를하실 수 있습니다. 결과에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 헤미의 두뇌는 두개골에서 추출하기 전에 perfused 있지 않기 때문에,주의가 헤미 두뇌에 손상을 방지하기 위해 추출 과정에서 사용해야합니다. 헤미의 두뇌가 수동적으로 perfused이기 때문에 더욱이, 우리는 4 적어도 48 시간 4퍼센트 PFA에 잠복기 권장 ° C 이전에 30 % 자당 솔루션 잠수함이 잠수합니다. 또는 transcardial 재관류는 두뇌를 추출하기 전에 할 수 있습니다. 두뇌가 제대로 고정되면, 그것은 고무 질감이 있어야합니다. 두뇌가 제대로 고정되지 않은 경우에는 섹션 쉽게 D' Olomos 솔루션이나 얼룩 절차 중에 눈물 것입니다.
4G8 단클론 항체는 아미노산 잔류물 Aβ의 17-24에 반응하고 핵심 시퀀스 (VFFAE)에 에피토프을 인식. 4G8가 마우스 수종에서 파생된 것이므로, 그것은 높은 배경 얼룩을주는 경향이있다. 따라서, 우리는 배경 얼룩을 최소화하면서 고려 진정한 신호를 달성하기 위해 함께 표시된 희석에서 섹션을 품어하기로 결정했습니다.
4G8 항체를 사용하여 neuritic plaques 감지 immunostaining 이외에도, thioflavin S 얼룩 방법도 plaques을 식별하는 데 사용됩니다. Thioflavin S는 동질적인 염료 혼합물이다 sulfonic의 산성과 dehydrothiotoluidine의 methylation 결과에서 해당. Thioflavin S가 아닌 선택과 같은 아밀로이드 oligomers 이들과 같은 단백질의 베타 시트 내용을 바인딩합니다. 바인딩시 thioflavin는 방출 스펙트럼의 특성 푸른 변화를 겪습. 반대 monomeric 양식 thioflavin S 바인딩은 파란 변화를 이끌어내는하지 않으며 형광 현미경으로 발견하지 못했습니다. 형광의 강도가 아밀로이드 예금 소량의 좋은 시각화를 허용 등 Thioflavin S 얼룩이 아밀로이드에 대한 화면으로 빠른 대안을 제공합니다. 그러나, thioflavin S 얼룩 얘기가 하나 단점은 특이성의 부족이다. 이러한 fibrinoids, 유리 모양의, 각질 등으로 포함하는 광범위한 베타 시트를 포함한 많은 다른 조직 구성이 염료에 대한 다소 친근감을 가지고 있습니다.
Disclosures
모든 실험은 브리티시 컬럼비아 애니멀 케어 및 사용위원회 CIHR 지침의 대학에 따라 실시되었다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 타운센드 가족, 잭 브라운 가정 알츠하이머 연구 재단 (WAS)를 지원했습니다. WAS는 알츠하이머 병에있는 캐나다 연구 의자의 소유자입니다. PTTL는 자연 과학 및 공학 연구 상담 및 건강 연구 장학금에 대한 마이클 스미스 재단에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
