Summary
Uma das características patológicas da doença de Alzheimer é a formação de amilóide β proteína placas neuríticas positivo. Neste protocolo, descrevemos dois métodos para detectar placas neuríticas em camundongos transgênicos modelo AD: detecção imunohistoquímica utilizando o método ABC e DAB e detecção fluorescente usando o método thioflavin S coloração.
Abstract
Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa levando à demência. Formação de placas neuríticas é uma das características patológicas da doença de Alzheimer. O componente central de placas neuríticas é uma pequena proteína filamentosa proteína chamada amilóide β (Aâ) 1, que é derivada da clivagem proteolítica seqüencial da proteína precursora beta-amilóide (APP) por β-secretase e γ-secretase. A hipótese amilóide implica que Aγ contendo placas como o mecanismo subjacente tóxicos em patologia 2. A análise post-mortem da presença de placas neuríticas confirma o diagnóstico da DA. Para promover nossa compreensão da neurobiologia Aγ na patogênese da AD, várias linhagens de camundongos expressando AD relacionados com mutações nos genes APP humanos foram gerados. Dependendo da gravidade da doença, esses ratos desenvolvem placas neuríticas em diferentes idades. Esses camundongos servem como ferramentas de valor inestimável para o estudo da patogênese e desenvolvimento de drogas que podem afetar o caminho de processamento APP e formação de placas neuríticas. Neste protocolo, empregamos um método imuno-histoquímico para detecção específica de placas neuríticas em camundongos modelo AD. Vamos especificamente discutir a preparação de extrair o cérebro meia, fixação paraformaldeído, cryosectioning, e dois métodos para detectar placas neurótico em camundongos transgênicos AD: detecção imuno-histoquímica usando o método ABC e DAB e detecção fluorescente usando o método thiofalvin S coloração.
Protocol
1. Fixação de cérebros de camundongos e cryosectioning
- Camundongos transgênicos são sacrificados com gás de dióxido de carbono, seguido por decapitação eo cérebro extraído.
- O cérebro é dissecada no sentido longitudinal no centro. Metade do cérebro será flash congelado em gelo seco para análise bioquímica. O outro será submerso em paraformaldeído a 4% (PFA) para pelo menos 48 horas a 4 ° C.
- Após a fixação em PFA 4% para pelo menos 48 horas, o cérebro hemi é transferido diretamente para a solução de sacarose 30% e colocou a 4 ° C. No ponto, o cérebro hemi deve ser flutuante na solução de sacarose. Quando o cérebro hemi afundou para o fundo, normalmente exigindo cerca de 48 horas, ele está pronto para ser incorporado em outubro para cryosectioning.
- Antes cryosectioning, monte uma camada fina de outubro na maçaneta e deixe congelar a -20 ° C. Remova o cerebelo do resto do cérebro hemi e coloque sobre a camada de outubro congelados. Cobrir imediatamente o cérebro hemi com outubro e deixe lentamente congelar a -20 ° C. Uma vez que a incorporação de outubro o cérebro se tornou opaco, ele está pronto para ser seccionado.
- Definir a espessura de cada seção para 30 mm. Coletar cada fatia em um recipiente com solução de D'Olomos.
2. Procedimento de imuno-histoquímica para placas neuríticas (free seções flutuante)
- Tratar cada seção em 88% de ácido fórmico por 15 minutos. Após o tratamento ácido fórmico, a seção vai desativar temporariamente opaco e pode aparecer a murchar.
- Retire cada seção em um prato e lave com Tx-PBS (0,3% Triton X-100 em PBS) por 5 X 3 min, agitando suavemente.
- Peróxido de bloco endógena bloqueio 0,5% H 2 O 2 em Tx-PBS, RT 30 min, agitando suavemente.
- Lavar a lâmina com Tx-PBS por 10 min X 3, agitando suavemente.
- Seção do bloco com 5% de leite desnatado sem gordura dissolvida em Tx-PBS em temperatura ambiente por uma hora, agitando suavemente.
- Incubar seções em anticorpo primário (biotinilado 4G8, 1:500-1:2000, Signet) diluído em PBS-Tx contendo 5% de leite a 4 ° C durante a noite, agitando suavemente.
- Lavar a lâmina com Tx-PBS por 10 min X 3, agitando suavemente.
- Prepare protocolo ABC fabricante da solução seguinte (Elite ABC, Vector Laboratories). Incubar a mistura de seções ABC por 30 min, agitando suavemente.
- Lavar a lâmina com Tx-PBS por 10 min X 3, agitando suavemente.
- Prepare 3,3 tetrahidrocloreto 'diaminobenzidina (DAB) (Vector Laboratories) protocolo do fabricante seguinte. Incubar seções em DAB mistura de 5-10 min. Neste ponto, você vai observar uma cor acastanhada desenvolver em cada seção.
- Lavar a lâmina com Tx-PBS por 10 min X 3, agitando suavemente.
- Seções de livre flutuação do cérebro são montados em gelatina slides revestido, para ajudar na adesão do tecido. Seções são então ar seco seguido por limpeza com uma série de xileno e montados em Entellen.
- Placas são visualizadas em microscopia de luz em aumento de 40X e são quantificados avaliando a contagem de placa médio por fatia para cada rato.
3. Thioflavin S coloração procedimento para a detecção de placas neuríticas
- Sacrifício do mouse e procedimento de extração do cérebro são, tal como indicado nos pontos 1.1 a 1.5.
- Monte 4-5 seções cérebro hemi numa lâmina de vidro e deixar completamente o ar seco antes da coloração.
- Lavagem das lâminas com etanol 70% por 1 minuto.
- Lavagem das lâminas com etanol 80% por 1 minuto.
- Incubar as lâminas em solução filtrada (filtro de 0,2 mm) thioflavin S (1% em 80% de etanol) por 15 minutos. (Solução Thioflavin S precisa ser filtrada antes de cada utilização). Nota: proteger thioflavin S da luz e proteger lâminas coradas da luz.
- Lavagem das lâminas com etanol 80% por 1 minuto.
- Lavagem das lâminas com 70% de etanol minutos 1.
- Lavar com água destilada duas vezes.
- Slides montagem em solução aquosa meios de montagem e permitir que as lâminas secar no escuro por pelo menos duas horas, seguido por lamínula de vedação com unhas polonês claro. Cortes corados deve ser armazenado no escuro a 4 ° C.
- A fluorescência verde placas manchada poderia ser visualizado com microscropy fluorescente. Analisar slides dentro de uma semana porque a coloração vai desaparecer com o tempo.
4. Resultados representante
Em nosso estudo recente sobre a eficácia do medicamento anti-epiléptico e ácido valpróico estabilizador de humor (VPA) para inibir a formação de placas neuríticas, foi utilizada a imunocoloração acima descritos e thioflavin S coloração procedimentos para identificar placas neuríticas em ratos AD modelo (3). A Figura 1 representa um típico 9 meses de idade APP23 camundongo transgênico, corados com anti-Aâ usando 4G8 biotinilado e detectados através do método ABC. Placas neuríticas são claramente identificados com o anticorpo e são indicados pelas setas brancas. Usando coloração thioflavin S, detectamos deposição de placas neuríticas 2 meses de idade APP23xPS transgenic ratos (Figura 2). Obrigado Thioflavin S placas neuríticas Aâ contendo parece verde sob microscopia de fluorescência (indicado por setas brancas). Nós mostramos que o tratamento com VPA, a formação de placas neuríticas é significativamente reduzido (3). Em outro estudo, estudamos a hipóxia ligação molecular subjacente e patogênese AD. Mais uma vez, usando tanto a coloração imuno-histoquímica anti-4G8 Aâ e coloração thioflavin S, descobrimos que a hipóxia facilitou a formação de Aâ contendo placas neuríticas (4).
Figura 1. Análise imunohistoquímica da formação de placas neuríticas em camundongos transgênicos AD. APP23 ratos na idade de nove meses foram sacrificados e foram dissecados, fixo, e seccionados. Placas neuríticas no hipocampo foram detectados através de um anticorpo anti-4G8 Aâ e foram desenvolvidos utilizando os métodos ABC e DAB. As placas foram visualizadas por microscopia de luz com 40X. Setas brancas apontam para placas neuríticas Aâ.
Figura 2. Coloração Thioflavin S de placas neuríticas em ratos AD modelado. APP23xPS45 dupla camundongos transgênicos às 8 semanas de idade foram sacrificados e foram dissecados, fixo, e seccionados. Pragas neuríticas no hipocampo estão foram confirmados pela coloração fluorescente thioflavin S e visualizados por microscopia em aumento de 40X. Setas brancas indicam placas neuríticas manchada thioflavin S.
Discussion
Imunohistoquímica utilizando o anticorpo biotinilado rotulados manchas 4G8 placas neuríticas na AD modelado camundongos com especificidade. O resultado coloração permite a quantificação e comparação da carga de placa bacteriana entre os diferentes grupos de tratamento. Existem vários passos cruciais que poderiam afetar o resultado. Porque o cérebro hemi não são perfundidos antes da extração do crânio, o cuidado deve ser usado durante o processo de extração, a fim de evitar danos para o cérebro hemi. Além disso, uma vez que o cérebro é hemi passivamente perfundidos, recomendamos incubando-o em PFA 4% para pelo menos 48 horas a 4 ° C antes da imersão em solução de sacarose a 30%. Alternativamente, a perfusão transcardial poderia ser feito antes de extrair o cérebro. Se o cérebro é fixada corretamente, ele deve ter uma textura emborrachada. No caso em que o cérebro não é fixa adequadamente, as seções serão rasgões na solução Olomos D'ou durante os procedimentos de coloração.
O anticorpo monoclonal é 4G8 reativa para resíduos de aminoácidos 17-24 de Aâ e reconheceu o epítopo na seqüência do núcleo (VFFAE). Desde 4G8 é derivado de espécies mouse, ele tende a dar uma coloração mais fundo. Assim, optou-se incubar as seções na diluição indicada com considerações para alcançar um verdadeiro sinal, minimizando coloração de fundo.
Além de imunocoloração para a detecção de placas neuríticas usando o anticorpo 4G8, um método thioflavin S coloração também é usado para identificar placas. Thioflavin S é uma mistura homogênea de corante que resulta de metilação de dehydrothiotoluidine com ácido sulfônico. Thioflavin S não se liga seletivamente conteúdo folha beta de proteínas, tais como aquelas em oligômeros amilóide. Após a ligação, thioflavin sofre uma mudança de característica azul do seu espectro de emissão. Por outro lado vinculativo thioflavin S com as formas monoméricas não vai provocar uma mudança de azul e não podia ser detectado com microscópio de fluorescência. Coloração Thioflavin S oferece uma alternativa rápida para triagem de amilóide como a intensidade de fluorescência permite boa visualização de pequenas quantidades de depósitos de amilóide. No entanto, uma desvantagem sobre coloração thioflavin S é a falta de especificidade. Muitos componentes do tecido, incluindo contendo folhas beta extensa, como fibrinoids, hialina, queratina, etc, têm uma afinidade bastante para este corante.
Disclosures
Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o The University of British Columbia Animal Care e da comissão Use e diretrizes CIHR.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), a Família Townsend, e Jack Brown e Família Alzheimer Research Foundation (para WAS). WS é o titular da Cátedra de Pesquisa do Canadá na Doença de Alzheimer. PTTL é suportado pelas Ciências Naturais e Conselheiro Pesquisa de Engenharia e Michael Smith Fundação de Saúde de Bolsas de Investigação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
