Summary
אחד המאפיינים הפתולוגיים של אלצהיימר היא היווצרות של חלבון הפלאק עמילואיד β חיובי מדלקת עצבים. בפרוטוקול זה נתאר שתי שיטות לאיתור פלאק מדלקת עצבים בעכברים הטרנסגניים מודל AD: זיהוי immunohistochemical באמצעות ABC ו-DAB שיטת זיהוי פלורסנט באמצעות שיטת מכתים S thioflavin.
Abstract
מחלת אלצהיימר (AD) הינה ההפרעה השכיחה ביותר ניווניות המוביל לדימנציה. היווצרות הפלאק מדלקת עצבים הוא אחד מסימני ההיכר הפתולוגי של מחלת אלצהיימר. המרכיב המרכזי של הפלאק מדלקת עצבים הוא חלבון קטן המכונה אמילואיד β פילמנטיות חלבון (Aβ) 1, אשר נגזר מחשוף proteolytic רציפים של החלבון בטא עמילואיד המבשר (APP) על ידי secretase-β ו - γ-secretase. ההשערה עמילואיד כרוך כי Aγ המכילים הפלאק כמנגנון רעילים הבסיסית לספירה הפתולוגיה 2. ניתוח שלאחר המוות של נוכחות של פלאק מדלקת עצבים מאשרת את האבחנה של א"ד. כדי לקדם את ההבנה שלנו של Aγ לנוירוביולוגיה בפתוגנזה לספירה, עכבר זנים שונים להביע את AD-הקשורים מוטציות בגנים APP האדם נוצרו. בהתאם לחומרת המחלה, עכברים אלו יפתחו הפלאק מדלקת עצבים בגילאים שונים. עכברים אלה משמשים כלי רב ערך לחקר התפתחות בפתוגנזה סמים העלולים להשפיע על עיבוד APP מסלול ורובד היווצרות מדלקת עצבים. בפרוטוקול זה, אנחנו מעסיקים immunohistochemical שיטה לגילוי ספציפי של הפלאק מדלקת עצבים בעכברים מודל AD. אנו במיוחד לדון הכנה לחילוץ מן המוח וחצי, קיבעון paraformaldehyde, cryosectioning, ואת שתי שיטות לאיתור פלאק נוירוטי בעכברים הטרנסגניים לספירה: זיהוי immunohistochemical באמצעות ABC ו-DAB שיטת זיהוי פלורסנט באמצעות שיטת מכתים S thiofalvin.
Protocol
1. קיבוע של מוח העכבר cryosectioning
- העכברים הטרנסגניים מוקרבים באמצעות גז דו תחמוצת הפחמן, ואחריו עריפת ראש והמוח חילוץ.
- המוח הוא גזור longitudinally במרכז. מחצית המוח יהיה פלאש קפוא על קרח יבש לניתוח ביוכימיים. השני יהיה שקוע paraformaldehyde 4% (PFA) במשך לפחות 48 שעות 4 ° C.
- לאחר קיבוע PFA ב -4% במשך לפחות 48 שעות, המוח חמי מועבר ישירות לתוך תמיסה סוכרוז 30% והניח על 4 ° C. בשלב מסוים, המוח צריך להיות חמי צף הפתרון סוכרוז. כאשר המוח חמי שקעו לקרקעית, בדרך כלל המחייב 48 שעות, הוא מוכן להיות מוטבע אוקטובר עבור cryosectioning.
- לפני cryosectioning, הר שכבה דקה של אוקטובר על הידית ולאפשר להקפיא ב -20 ° C. הסר את המוח הקטן משאר המוח חמי מקום על גבי שכבה של אוקטובר קפוא. מיד לכסות את המוח עם חמי אוקטובר ולאפשר לאט להקפיא ב -20 ° C. לאחר הטבעה אוקטובר המוח הפך אטום, הוא מוכן להיות מחולק.
- הגדר את העובי של כל מקטע עד 30 מיקרומטר. איסוף כל פרוסה לתוך מיכל עם פתרון Olomos ד.
2. הליך אימונוהיסטוכימיה עבור הפלאק מדלקת עצבים (סעיפים צף חינם)
- פנקו כל הקטע חומצה פורמית 88% במשך 15 דקות. לאחר הטיפול חומצה פורמית, הסעיף באופן זמני להפוך אטום עשוי להופיע להתכווץ.
- הסר כל חלק לתוך צלחת לשטוף עם TX-PBS (0.3% Triton X-100 ב PBS) במשך 5 דקות X 3 עם רעד עדין.
- החומר המחמצן אנדוגני בלוק חוסם 0.5% H 2 O 2 ב TX-PBS, RT 30 דקות עם רעד עדין.
- לשטוף עם סעיף TX-PBS למשך 10 דקות X 3 עם רעד עדין.
- בלוק עם סעיף 5% חלב דל שומן ללא שומן מומס TX-PBS בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם רעד עדין.
- דגירה מקטעים נוגדן ראשוני (Biotinylated 4G8, 1:500-1:2000, חותם) מדולל TX-PBS המכיל 5% חלב ב 4 ° C לילה עם רעד עדין.
- לשטוף עם סעיף TX-PBS למשך 10 דקות X 3 עם רעד עדין.
- הכינו פרוטוקול היצרן ABC הפתרון הבא של (עלית ABC, וקטור מעבדות). דגירה סעיפים בתערובת ABC למשך 30 דקות עם רעד עדין.
- לשטוף עם סעיף TX-PBS למשך 10 דקות X 3 עם רעד עדין.
- הכן 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (Vector Laboratories) פרוטוקול היצרן הבא. דגירה סעיפים בתערובת DAB עבור 50-10 דקות. בשלב זה, תוכלו לצפות בצבע חום לפתח על כל קטע.
- לשטוף עם סעיף TX-PBS למשך 10 דקות X 3 עם רעד עדין.
- Free-צפים חלקים במוח הם רכובים על שקופיות מצופה ג'לטין, כדי לעזור עם הידבקות רקמות. מדורים מכן הם מיובשים באוויר ואחריו ניקוי עם סדרה של קסילן רכוב Entellen.
- לוחות הם דמיינו תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 40X הם לכמת על ידי בחינה של מספר לוחית מתכוון לכל פרוסה על כל עכבר.
3. Thioflavin S מכתים הליך זיהוי של הפלאק מדלקת עצבים
- להקריב עכבר מיצוי הליך המוח כפי שצוין בסעיפים 1.1-1.5.
- הר 4-5 סעיפים חמי המוח לשקופית כוס ולאפשר לחלוטין האוויר היבש לפני מכתים.
- לשטוף שקופיות עם אתנול 70% למשך דקה 1.
- לשטוף שקופיות עם אתנול 80% למשך דקה 1.
- דגירה שקופיות פתרון מסוננים (0.2 מיקרומטר מסנן) S thioflavin (1% ב 80% אתנול) במשך 15 דקות. (פתרון S Thioflavin צריך להיות מסוננים לפני כל שימוש). הערה: להגן thioflavin S מן האור ולהגן שקופיות מוכתמים מן האור.
- לשטוף שקופיות עם אתנול 80% למשך דקה 1.
- לשטוף עם שקופיות דקה 70% אתנול 1.
- לשטוף עם מים מזוקקים פעמיים.
- מגלשות הר בתקשורת הרכבה מימית ולאפשר שקופיות יבש בחושך לפחות 2 שעה, ואחריו coverslip איטום עם לק ברור. קטעים ויטראז יש לאחסן בחושך ב 4 ° C.
- הפלאק ירוק מוכתם הקרינה יכולה להיות דמיינו עם microscropy ניאון. ניתוח שקופיות בתוך שבוע כי מכתים את ידהו עם הזמן.
4. נציג תוצאות
במחקר האחרונות שלנו על היעילות של תרופה אנטי אפילפטית לבין מייצב מצב רוח חומצה ולפרואית (VPA) לעכב היווצרות הפלאק מדלקת עצבים, השתמשנו immunostaining שתואר לעיל thioflavin S מכתים נהלים כדי לזהות פלאק מדלקת עצבים במודל עכברי אלצהיימר (3). איור 1 מייצג טיפוסי בן 9 חודש APP23 עכבר מהונדס, מוכתם אנטי Aβ 4G8 biotinylated שימוש ו לאתר באמצעות שיטת ה-ABC. הפלאק מדלקת עצבים מסומנים בבירור עם הנוגדן ו מסומנים על ידי החצים הלבנים. שימוש מכתים S thioflavin, זיהינו בתצהיר פלאק מדלקת עצבים 2 בן חודש APP23xPS transgenic עכברים (איור 2). Aβ המכילים מחויב S Thioflavin הפלאק מדלקת עצבים מופיע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק (מסומנת בחצים לבנים). הראינו כי עם טיפול VPA, היווצרות הפלאק מדלקת עצבים מצטמצם משמעותית (3). במחקר אחר, למדנו היפוקסיה הקישור המולקולריים שבבסיס הפתוגנזה ו לספירה. שוב, הן באמצעות מכתים 4G8 אנטי Aβ אימונוהיסטוכימיה ו מכתים S thioflavin, מצאנו היפוקסיה שאפשרו את היווצרות הפלאק Aβ המכיל מדלקת עצבים (4).
באיור 1. ניתוח immunohistochemical של היווצרות הפלאק מדלקת עצבים בעכברים הטרנסגניים לספירה. APP23 עכברים בגיל 9 חודשים הוקרבו והיו גזור, קבוע, מחולק. הפלאק מדלקת עצבים ב בהיפוקמפוס התגלו באמצעות 4G8 אנטי Aβ נוגדן ו פותחו תוך שימוש בשיטות ABC ו-DAB. הפלאק היו דמיינו ידי מיקרוסקופ אור עם 40X. החצים הלבנים הצבע הפלאק מדלקת עצבים Aβ.
איור 2. מכתים S Thioflavin של הפלאק מדלקת עצבים בעכברים לספירה הדגם. APP23xPS45 העכברים הטרנסגניים כפול 8 שבועות הוקרבו והיו גזור, קבוע, מחולק. המכות מדלקת עצבים ב בהיפוקמפוס הם אושרו באמצעות מכתים פלורסנט S thioflavin ו דמיינו ידי מיקרוסקופית בהגדלה של 40X. החצים מצביעים על הפלאק הלבן מוכתם S thioflavin מדלקת עצבים.
Discussion
אימונוהיסטוכימיה באמצעות biotinylated כתמים שכותרתו נוגדן 4G8 הפלאק מדלקת עצבים לספירה מודל עכברים עם סגוליות. התוצאה מכתים מאפשרת כימות והשוואה של עומס פלאק בין קבוצות הטיפול השונות. ישנם צעדים מכריעים שיכולים להשפיע על התוצאה. מכיוון שכל חמי אינם perfused לפני מיצוי מהגולגולת, טיפול אמור לשמש במהלך תהליך החילוץ, כדי למנוע נזק למוח חמי. יתר על כן, מאחר שהמוח הוא חמי perfused פסיבי, אנו ממליצים דוגרים אותו PFA 4% עבור 48 שעות לפחות ב 4 ° C לפני הצללה בפתרון סוכרוז 30%. לחלופין, זלוף transcardial יכול להיעשות לפני לחילוץ המוח. אם המוח הוא קבוע כראוי, זה צריך להיות מרקם צמיגי. במקרה שבו המוח אינו קבוע כהלכה, קטעי יהיה בקלות לקרוע בפתרון ד Olomos או במהלך ההליכים מכתים.
נוגדן חד שבטי 4G8 היא תגובתי שאריות חומצת אמינו 17-24 של Aβ והכיר epitope ברצף הליבה (VFFAE). מאז 4G8 נגזר מינים העכבר, הוא נוטה לתת מכתים רקע גבוהה יותר. לפיכך, בחרנו דגירה בסעיפים בדילול המצוין עם שיקולים להשגת אות נכון, תוך מזעור מכתים רקע.
בנוסף immunostaining לאיתור פלאק מדלקת עצבים באמצעות נוגדן 4G8, שיטה מכתים S thioflavin משמש גם כדי לזהות את הפלאק. Thioflavin S הוא תערובת הומוגנית לצבוע הנובעת מתילציה של dehydrothiotoluidine עם חומצה sulfonic. Thioflavin S הלא סלקטיבי נקשר תוכן גיליון בטא של חלבונים, כגון אלה oligomers עמילואיד. לאחר מחייב, thioflavin עובר שינוי כחול אופייני של ספקטרום הפליטה שלו. לעומת זאת מחייב S thioflavin לצורות monomeric לא לעורר שינוי כחול ולא ניתן היה לזהות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מכתים S Thioflavin מספק אלטרנטיבה מהירה המסך עמילואיד כמו עוצמת הקרינה מאפשר ראיה טובה של כמויות קטנות של משקעים עמילואידיים. עם זאת, חיסרון אחד על מכתים S thioflavin היא חוסר ייחוד. רבים מרכיבים רקמות אחרות המכילות כולל הסדינים בטא נרחב, כגון fibrinoids, hyaline, קרטין, וכו ', יש זיקה ולא עבור צבע זה.
Disclosures
כל הניסויים נערכו בהתאם מאוניברסיטת קולומביה Animal Care הבריטית ועדה השימוש והנחיות CIHR.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הקנדי מחקר (CIHR), משפחת טאונסנד, וג'ק בראון מחקר משפחה אלצהיימר קרן (אליו היה). הוא היה בעל הקתדרה למחקר בקנדה מחלת אלצהיימר. PTTL נתמך על ידי למדעי הטבע יועצת הנדסה מחקר סמית מיכאל קרן מלגות מחקר בריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
