Summary
Una de las características patológicas de la EA es la formación de placas de proteína amiloide β neuríticas positivo. En este protocolo se describen dos métodos de detección de placas neuríticas en ratones transgénicos modelo de AD: la detección inmunohistoquímica utilizando el método ABC y DAB y detección fluorescente utilizando el método de tinción thioflavin S.
Abstract
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común que lleva a la demencia. La formación de placas neuríticas es una de las características patológicas de la enfermedad de Alzheimer. El componente central de las placas neuríticas es una pequeña proteína llamada proteína filamentosa β-amiloide (Aß) 1, que se deriva de la escisión proteolítica secuencial de la proteína precursora beta-amiloide (APP) por β-secretasa y γ-secretasa. La hipótesis amiloide implica que Aγ que contienen las placas como el mecanismo subyacente a la patología tóxica en el año 2. El análisis post-mortem de la presencia de placas neuríticas confirma el diagnóstico de la EA. Para avanzar en nuestra comprensión de la neurobiología Aγ en la patogénesis de AD, las distintas cepas de ratón que expresan AD relacionados con mutaciones en los genes APP humana se generaron. Dependiendo de la severidad de la enfermedad, estos ratones desarrollan placas neuríticas en las diferentes edades. Estos ratones herramientas muy valiosas para el estudio de la patogénesis y desarrollo de medicamentos que puedan afectar a la vía de procesamiento de APP y la formación de placas neuríticas. En este protocolo, que emplean un método inmunohistoquímico para la detección específica de las placas neuríticas en ratones modelo de AD. En especial, analizará la preparación de la extracción del cerebro medio, la fijación de paraformaldehído, muestras criostáticas, y dos métodos para detectar las placas de neuróticos en el año ratones transgénicos: la detección inmunohistoquímica utilizando el método ABC y DAB y detección fluorescente utilizando el método de tinción thiofalvin S.
Protocol
1. La fijación de los cerebros de ratón y muestras criostáticas
- Los ratones transgénicos son sacrificados con gas de dióxido de carbono, seguido por decapitación y el cerebro extrae.
- El cerebro se disecciona longitudinalmente en el centro. La mitad del cerebro se flash congelado en hielo seco para el análisis bioquímico. El otro se sumergirá en el 4% de paraformaldehído (PFA) durante al menos 48 horas a 4 ° C.
- Después de la fijación en el 4% PFA durante al menos 48 horas, el cerebro hemi se transfiere directamente a una solución de sacarosa al 30% y se coloca a 4 ° C. En el punto, el cerebro hemisferio debe estar flotando en la solución de sacarosa. Cuando el cerebro hemi hundió en el fondo, que normalmente requiere unas 48 horas, que está listo para ser incorporado en octubre de muestras criostáticas.
- Antes de muestras criostáticas, montaje de una fina capa de octubre en el pomo y deje que se congele a -20 º C. Quitar el cerebelo desde el resto del cerebro hemi y el lugar en la capa congelada de octubre Cubrir inmediatamente el cerebro con hemi octubre y permita que se congele lentamente a -20 ° C. Una vez que la incorporación de octubre del cerebro se ha vuelto opaco, está listo para ser cortado.
- Establecer el grosor de cada sección de 30 micras. Recoger cada rebanada en un recipiente con solución de D'Olomos.
2. Procedimiento de inmunohistoquímica para placas neuríticas (libre flotación secciones)
- El tratamiento de cada sección en el 88% de ácido fórmico durante 15 minutos. Después del tratamiento con ácido fórmico, la sección de forma temporal a su vez, opaca y puede aparecer a marchitarse.
- Eliminar todas las secciones en una placa y lavar con PBS-Tx (0,3% Triton X-100 en PBS) durante 5 min x 3 con agitación suave.
- Peróxido de bloque bloqueo endógeno 0,5% H 2 O 2 en PBS-Tx, RT 30 min con agitación suave.
- Lave sección con Tx-PBS durante 10 min X 3 con agitación suave.
- Bloque de sección con descremada 5% de leche descremada disuelta en Tx-PBS a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave.
- Incubar las secciones de primaria de anticuerpos (Biotina 4G8, 1:500-1:2000, Sello) diluido en PBS-Tx con 5% de leche a 4 ° C durante la noche con agitación suave.
- Lave sección con Tx-PBS durante 10 min X 3 con agitación suave.
- Preparar el protocolo del fabricante ABC solución siguiente (Elite ABC, Vector Laboratories,). Incubar las secciones en la mezcla de ABC durante 30 minutos con agitación suave.
- Lave sección con Tx-PBS durante 10 min X 3 con agitación suave.
- Prepare 3,3 '-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) (Vector Laboratories) el protocolo del fabricante siguiente. Incubar las secciones en la mezcla de DAB durante 5-10 minutos. En este punto, se observará un color pardo se desarrollan en cada sección.
- Lave sección con Tx-PBS durante 10 min X 3 con agitación suave.
- Libre flotación secciones del cerebro se montan en portaobjetos recubiertos de gelatina, para ayudar con la adhesión de tejidos. Secciones se seca al aire seguido de limpieza con una serie de xileno y se montaron en Entellen.
- Las placas se visualizaron bajo microscopio de luz con un aumento de 40X y se cuantifica mediante la evaluación de la cuenta de la placa media por parte de cada ratón.
3. Thioflavin S tinción procedimiento para la detección de placas neuríticas
- Sacrificio del ratón y el procedimiento de extracción del cerebro son las indicadas en los apartados 1.1 a 1.5.
- Monte 4-5 secciones del cerebro hemi en un portaobjetos de vidrio y deje que se seque completamente antes de la tinción.
- Lavar los portaobjetos con etanol 70% durante 1 minuto.
- Lavar los portaobjetos con etanol al 80% durante 1 minuto.
- Incubar los portaobjetos en una solución de filtrado (filtro de 0,2 micras) thioflavin S (1% en el 80% de etanol) durante 15 minutos. (Solución thioflavin S necesita ser filtrado antes de cada uso). Nota: proteger thioflavin S de la luz y la protección de tinción de la luz.
- Lavar los portaobjetos con etanol al 80% durante 1 minuto.
- Lavar los portaobjetos con etanol al 70% de 1 minuto.
- Lavar con agua destilada dos veces.
- Diapositivas de montaje en los medios acuosos de montaje y permitir que se sequen en la oscuridad, por lo menos durante 2 horas, seguido de cubreobjetos de sellado con esmalte transparente. Secciones teñidas se deben almacenar en la oscuridad a 4 ° C.
- El verde placas teñidas de fluorescencia puede ser visualizado con microscropy fluorescentes. Analizar las diapositivas dentro de una semana debido a las manchas se desvanecen con el tiempo.
4. Resultados representante
En nuestro reciente estudio sobre la eficacia de los medicamentos anti-epilépticos y ácido humor estabilizador valproico (VPA) para inhibir la formación de placas neuríticas, se utilizó la tinción descrito anteriormente y thioflavin S procedimientos de tinción para identificar placas neuríticas en ratones modelo AD (3). La figura 1 representa un típico bebé de 9 meses APP23 ratón transgénico, teñidas con anti-Aß con 4G8 con biotina y detectado a través del método ABC. Placas neuríticas están claramente identificados con el anticuerpo y se indican con las flechas blancas. Mediante la tinción de thioflavin S, se han detectado depósitos de placa neuríticas 2 meses de edad tra APP23xPSnsgenic ratones (Figura 2). Obligado thioflavin S Aß que contienen las placas neuríticas aparece verde bajo microscopía de fluorescencia (indicado por las flechas blancas). Hemos demostrado que el tratamiento con VPA, la formación de placas neuríticas se reduce significativamente (3). En otro estudio, se estudió la hipoxia enlace molecular subyacente y patogénesis de la EA. Una vez más, utilizando 4G8 anti-Aß tinción inmunohistoquímica y tinción thioflavin S, se encontró que la hipoxia ha facilitado la formación de Aß que contienen las placas neuríticas (4).
Figura 1. El análisis inmunohistoquímico de la formación de placas neuríticas en ratones transgénicos AD. APP23 ratones a la edad de 9 meses se sacrificaron y fueron disecados, fijo, y en gajos. Placas neuríticas en el hipocampo fueron detectados utilizando un anticuerpo anti-4G8 Aß y fueron desarrollados usando los métodos ABC y DAB. Las placas se visualizaron por microscopía de luz con 40X. Las flechas blancas señalan las placas neuríticas Aß.
Figura 2. Tinción thioflavin S de placas neuríticas en ratones modelo AD. APP23xPS45 ratones transgénicos dobles a las 8 semanas de edad fueron sacrificados y se fueron disecados, fijo, y en gajos. Plagas neuríticas en el hipocampo se fueron confirmados mediante la tinción fluorescente thioflavin S y se visualizan por microscopía de 40 aumentos. Las flechas blancas indican las placas teñidas thioflavin S neuríticas.
Discussion
Inmunohistoquímica utilizando la biotina etiquetados manchas anticuerpo 4G8 placas neuríticas en el año modelo ratones con especificidad. El resultado de tinción permite la cuantificación y la comparación de la carga de placa entre los diferentes grupos de tratamiento. Hay varios pasos cruciales que podrían afectar el resultado. Debido a que el cerebro hemisferio no son perfundidos antes de la extracción del cráneo, se debe tener cuidado durante el proceso de extracción con el fin de evitar daños en el cerebro hemisferio. Por otra parte, ya que el cerebro es hemi pasivamente perfusión, se recomienda la incubación en PFA al 4% durante al menos 48 horas a 4 ° C antes de sumergirse en la solución de sacarosa al 30%. Por otra parte, la perfusión transcardial se podía hacer antes de la extracción del cerebro. Si el cerebro se fija correctamente, debe tener una textura gomosa. En el caso de que el cerebro no está correctamente instalada, las secciones fácilmente desgarro en la solución de D'Olomos o durante los procedimientos de tinción.
El anticuerpo monoclonal 4G8 es reactiva a los residuos de aminoácidos 17-24 de la Aß y reconoció el epítopo en la secuencia principal (VFFAE). Desde 4G8 se deriva de las especies del ratón, se tiende a dar una mayor tinción de fondo. Por lo tanto, se optó por incubar las secciones a la dilución indicada con consideraciones para lograr una verdadera señal de reducir al mínimo la tinción de fondo.
Además de la inmunotinción para la detección de placas neuríticas el uso del anticuerpo 4G8, un método de tinción thioflavin S también se utiliza para identificar las placas. Thioflavin S es una mezcla de tinte homogéneo que resulta de la metilación del dehydrothiotoluidine con ácido sulfónico. Thioflavin S no se une selectivamente a los contenidos beta hoja de proteínas, como los oligómeros de amiloide. Tras la unión, thioflavin sufre un cambio azul característico de su espectro de emisión. Por el contrario vinculante thioflavin S a las formas monoméricas no provocará un cambio de color azul y no podía ser detectado con microscopio de fluorescencia. Tinción thioflavin S ofrece una alternativa rápida para la detección de amiloide como la intensidad de la fluorescencia permite una buena visualización de pequeñas cantidades de depósitos de amiloide. Sin embargo, un inconveniente de manchar thioflavin S es la falta de especificidad. Muchos componentes de otros tejidos como las hojas que contienen beta extenso, como fibrinoids, hialino, queratina, etc, tienen una afinidad más bien por medio de contraste.
Disclosures
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Universidad británica de Atención Animal de Columbia y el empleo y las directrices CIHR.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), la familia Townsend, y Brown y Jack Investigación de la Familia Alzheimer de la Fundación (a WAS). WS es el titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en la enfermedad de Alzheimer. PTTL con el apoyo de las Ciencias Naturales y Asesor de Investigación en Ingeniería y la Fundación Michael Smith de Becas de Investigación en Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
