Summary
En av de patologiska egenskaperna hos AD är bildandet av protein Amyloid β positiva neuritic plack. I detta protokoll beskriver vi två metoder för att upptäcka neuritic plack i transgena möss AD modell: immunhistokemisk detektion med hjälp av ABC-och DAB-metoden och fluorescerande upptäckt med hjälp av thioflavin S färgningsmetod.
Abstract
Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste neurodegenerativa sjukdom som leder till demens. Neuritic plack är en av de patologiska kännetecken för Alzheimers sjukdom. Den centrala komponenten i neuritic plack är en liten fintrådiga protein som kallas amyloid β protein (A-beta) 1, som härrör från sekventiell proteolytisk klyvning av beta-amyloid prekursor protein (APP) med β-sekretas och γ-sekretas. Den amyloid hypotesen innebär att Aγ innehåller plack som underliggande toxiska mekanismen i AD patologi 2. Den obduktion analys av förekomsten av neuritic plack bekräftar diagnosen AD. För att ytterligare vår förståelse av Aγ neurobiologi i AD patogenes har olika musstammar uttrycker AD-relaterade mutationer i mänskliga APP gener genereras. Beroende på svårighetsgraden av sjukdomen, kommer dessa möss utvecklar neuritic plack i olika åldrar. Dessa möss fungerar som ett ovärderligt verktyg för att studera patogenes och utveckling av läkemedel som kan påverka den vägen APP bearbetning och neuritic plackbildning. I detta protokoll använder vi en immunhistokemiska metod för detektering av neuritic plack hos möss AD modell. Vi kommer särskilt att diskutera utarbetandet från utvinna halv hjärna, paraformaldehyd fixering, cryosectioning och två metoder för att upptäcka neurotiska plack i AD transgena möss: immunhistokemisk detektion med hjälp av ABC-och DAB-metoden och fluorescerande upptäckt med hjälp av thiofalvin S färgningsmetod.
Protocol
1. Fixering av mus hjärnor och cryosectioning
- Transgena möss offras med gas koldioxid, följt av halshuggning och hjärna extraheras.
- Hjärnan är dissekerade längsled i centrum. Hälften av hjärnan kommer att blinka fryses på torris för biokemisk analys. Den andra kommer att översvämmas i 4% paraformaldehyd (PFA) under minst 48 timmar vid 4 ° C.
- Efter fixering i 4% PFA i minst 48 timmar är Hemi hjärnan överförs direkt till 30% sackaroslösning och placeras vid 4 ° C. Vid den punkt bör Hemi hjärnan vara flytande i det sackaroslösning. När Hemi hjärnan sjönk till botten, vanligtvis kräver ungefär 48 timmar är den redo att bäddas in i oktober för cryosectioning.
- Innan cryosectioning, montera ett tunt lager av oktober på ratten och låt frysa vid -20 ° C. Ta bort lillhjärnan från resten av Hemi hjärnan och placera på lagret av frysta oktober Omedelbart täcka Hemi hjärnan med oktober och låt sakta fryser vid -20 ° C. När oktober bädda hjärnan har blivit ogenomskinlig, är det klart att sektioneras.
- Ställ in tjockleken på varje avsnitt till 30 ìm. Samla varje bit i en behållare med D'Olomos lösning.
2. Immunohistokemi förfarande för neuritic plack (fritt flytande avsnitt)
- Behandla varje avsnitt i 88% myrsyra i 15 minuter. Efter myrsyra behandling kommer avsnittet vänder tillfälligt ogenomskinlig och det kan visas att krympa.
- Ta bort varje avsnitt i en tallrik och tvätta med Tx-PBS (0,3% Triton X-100 i PBS) i 5 min x 3 med försiktig skakning.
- Blockera Endogena Peroxid blockera 0,5% H 2 O 2 i Tx-PBS, RT 30 min med försiktig skakning.
- Tvätta sektion med Tx-PBS i 10 min x 3 med försiktig skakning.
- Blockera avsnitt med 5% fettfri lättmjölk löst i Tx-PBS i rumstemperatur i 1 timme under försiktig skakning.
- Inkubera avsnitt i primära antikroppen (biotinylerad 4G8, 1:500-1:2000, Signet) utspädd i Tx-PBS innehållande 5% mjölk vid 4 ° C över natten med varsam skakning.
- Tvätta sektion med Tx-PBS i 10 min x 3 med försiktig skakning.
- Förbered ABC lösning efter tillverkarens protokoll (Elit ABC, Vector Laboratories,). Inkubera avsnitt i ABC-blandningen i 30 min med försiktig skakning.
- Tvätta sektion med Tx-PBS i 10 min x 3 med försiktig skakning.
- Förbered 3,3 '-Diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB) (Vector Laboratories) efter tillverkarens protokoll. Inkubera avsnitt i DAB-blandningen i 5-10 min. Vid denna punkt kommer du att observera en brunaktig färg utvecklas på varje avsnitt.
- Tvätta sektion med Tx-PBS i 10 min x 3 med försiktig skakning.
- Fritt flytande hjärnan sektioner är monterade på gelatin belagda diabilder, att hjälpa till med vävnad vidhäftning. Avsnitten är sedan lufttorkas följt av clearing med en serie av xylen och monterade i Entellen.
- Plack visualiseras i ljusmikroskop vid 40X förstoring och kvantifieras genom att utvärdera den genomsnittliga plack räknas per skiva för varje mus.
3. Thioflavin S färgningsproceduren för detektion av neuritic plack
- Mus offer och hjärnan extraktionsförfarande är som anges i avsnitten 1.1 till 1,5.
- Montera 4 till 5 Hemi hjärnan sektioner på en glasskiva och låt helt lufttorka före färgning.
- Tvätta objektglasen med 70% etanol i 1 minut.
- Tvätta objektglasen med 80% etanol i 1 minut.
- Inkubera objektglasen i filtrerade (0,2 ìm filter) thioflavin S-lösning (1% i 80% etanol) i 15 minuter. (Thioflavin S-lösning måste filtreras före varje användning). Observera: att skydda thioflavin S från ljus och skyddar färgade diabilder från ljus.
- Tvätta objektglasen med 80% etanol i 1 minut.
- Tvätta objektglasen med 70% etanol 1 minut.
- Tvätta med destillerat vatten två gånger.
- Montera bilder i vattenlösning montering medier och låt objektglasen torka i mörker i minst 2 timmar, följt av tätning täckglas med tydliga nagellack. Färgade snitt bör förvaras i mörker vid 4 ° C.
- Den gröna fluorescensen färgade plattor kan visualiseras med fluorescerande microscropy. Analysera bilder i en vecka eftersom färgning kommer att blekna med tiden.
4. Representativa resultat
I vår senaste studie om effekten av det antiepileptiska läkemedlet och stämningsstabiliserande valproinsyra (VPA) för att hämma neuritic plackbildning använde vi de ovan beskrivna immunfärgning och thioflavin S färgning rutiner för att identifiera neuritic plack i möss AD-modellen (3). Figur 1 representerar ett typiskt 9 månader gammal APP23 transgen mus, färgade med anti-A-beta med biotinylerad 4G8 och upptäcks via ABC-metoden. Neuritic plack är tydligt märkta med antikroppen och anges med vita pilar. Använda thioflavin S färgning upptäckte vi neuritic plack nedfall 2 månader gammal APP23xPS transgenic möss (Figur 2). Thioflavin S bunden A-beta-innehållande neuritic plack visas i grönt i fluorescensmikroskopi (markerad med vita pilar). Vi visade att med VPA behandling är neuritic plackbildning högst väsentligt minskat (3). I en annan studie studerade vi de molekylära länken underliggande hypoxi och AD patogenes. Återigen, med både 4G8 anti-A-beta immunohistokemi färgning och thioflavin S färgning, fann vi att hypoxi underlättat bildandet av A-beta innehåller neuritic plack (4).
Figur 1. Immunhistokemiska analyser av neuritic plackbildning i AD transgena möss. APP23 möss vid en ålder av 9 månader offrades och var dissekeras, fast, och snittades. Neuritic plack i hippocampus upptäcktes med hjälp av en anti-A-beta-antikroppar 4G8 och har utvecklats med hjälp av ABC och DAB metoder. Den plack var visualiseras genom ljusmikroskop med 40X. Vita pilarna pekar på A-beta neuritic plack.
Figur 2. Thioflavin S färgning av neuritic plack i AD modellerade möss. APP23xPS45 dubbla transgena möss vid 8 veckor gamla offrades och var dissekeras, fast, och snittades. Neuritic plågor i hippocampus är bekräftades med hjälp av thioflavin S fluorescerande infärgning och visualiseras i mikroskop på 40X förstoring. Vita pilar indikerar thioflavin S färgade neuritic plack.
Discussion
Immunohistokemi använder biotinylerad märkt 4G8 antikropp fläckar neuritic plack i AD modellerad möss med specificitet. Färgningen Resultatet låter kvantifiering och jämförelse av plack belastning mellan olika behandlingsgrupperna. Det finns flera viktiga steg som skulle kunna påverka resultatet. Eftersom Hemi hjärnor inte är perfusion innan extraktionen från skallen ska försiktighet användas under extraheringen för att förhindra skador på Hemi hjärnan. Eftersom den Hemi hjärnan är passivt perfusion, rekommenderar vi inkubera den i 4% PFA i minst 48 timmar vid 4 ° C före sänka ned i 30% sackaroslösning. Alternativt kan transcardial perfusion göras innan utvinna hjärnan. Om hjärnan är korrekt monterad, bör den ha en gummiaktig konsistens. I de fall där hjärnan inte är fast på rätt sätt, kommer de avsnitt riva lätt i D'Olomos lösningen eller under färgning förfaranden.
Den 4G8 monoklonala antikroppen är reaktiv till aminosyrarester 17-24 av A-beta och erkände epitop på kärnan sekvens (VFFAE). Eftersom 4G8 kommer från mus arter, tenderar det att ge högre bakgrundsfärgning. Därför valde vi att inkubera sektionerna vid den angivna utspädning med hänsyn till att uppnå en verklig signal samtidigt minimera bakgrundsfärgning.
Förutom att immunfärgning för neuritic plack detektion med 4G8 antikropp, är ett thioflavin S färgningsmetod också användas för att identifiera plack. Thioflavin S är en homogen färg blandning som är resultatet av metylering av dehydrothiotoluidine med sulfonsyra. Thioflavin S icke-selektivt binds beta ark innehållet av proteiner, som de i amyloid oligomerer. Vid bindande, genomgår thioflavin en karaktäristiska blå förskjutning av dess emissionsspektrum. Omvänt thioflavin S bindning till Monomera former inte kommer att locka fram en blå skift och kunde inte detekteras med fluorescerande mikroskop. Thioflavin S färgning ger ett snabbt alternativ till skärmen för amyloid som fluorescensintensiteten ger bra visualisering av små mängder av amyloid insättningar. Men det är en nackdel om thioflavin S färgning bristen på specificitet. Många andra vävnader komponenter inklusive innehåller omfattande beta ark, som fibrinoids, hyaline, keratin, etc, har en ganska affinitet för denna färg.
Disclosures
Alla experiment utfördes i enlighet med University of British Columbia Djurvård och användning kommitté och riktlinjer CIHR.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR), den Townsend familjen, och Jack Brown och Familj Alzheimers Research Foundation (till WAS). WS är innehavaren av Kanada forskning ordförande i Alzheimers sjukdom. PTTL stöds av naturvetenskaplig och teknisk forskning biträde och Michael Smith Stiftelsen för hälsoforskning stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
