Summary
AD patolojik özelliklerinden biri Amiloid β proteini pozitif nöritik plakların oluşumu. Immünohistokimyasal algılama thioflavin G boyama yöntemi kullanılarak ABC ve DAB yöntem ve floresan tespiti: Bu protokolde, transgenik AD modeli fareler nöritik plaklar tespit etmek için iki yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Alzheimer hastalığı (AH), demansa neden olan en yaygın nörodejeneratif bir hastalıktır. Nöritik plak oluşumu, Alzheimer hastalığının patolojik işaretlerinden biridir. Nöritik plaklar merkezi bileşeni β-secretase ve γ-secretase beta-amiloid prekürsör protein (APP) sıralı proteolitik bölünme türetilmiş bir küçük ipliksi protein olarak adlandırılan amiloid β proteini (Aβ) 1,. Amiloid hipotezi AD patoloji 2, altta yatan toksik mekanizma olarak plaklar Aγ içeren gerektirir . Nöritik plak varlığı postmortem analiz AD tanısını doğrular. AD patogenezinde Aγ nörobiyoloji anlayışımızı ilerletmek için, AD-ilgili, insan APP genlerindeki mutasyonlar ifade çeşitli fare suşlarının üretildi. Hastalığın şiddetine bağlı olarak, bu farelerde farklı yaşlarda nöritik plaklar gelişecektir. Bu fareler APP işleme yolu ve nöritik plak oluşumunu etkileyebilecek patogenezi ve ilaç geliştirme eğitimi için paha biçilmez bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu protokol, AD modeli farelerde nöritik plaklar belirli tespiti için bir immünohistokimyasal yöntem kullanırlar. ABC ve DAB yöntem ve floresan algılama kullanarak thiofalvin G boyama yöntemi kullanılarak immünohistokimyasal algılama: Biz özellikle yarım beyin, paraformaldehid fiksasyon, cryosectioning, ve AD transgenik farelerin nevrotik plaklar tespit etmek için iki yöntem açılan hazırlık tartışacağız.
Protocol
1. Fare beyinleri fiksasyonu ve cryosectioning
- Transgenik farelerin dekapitasyon ve çıkarılan beyin tarafından takip karbondioksit gazı kullanarak kurban.
- Beynin merkezinde boydan boya disseke edilir. Beynin yarısı, biyokimyasal analiz için kuru buz dondurulmuş flaş olacaktır. Diğer 4% 4 paraformaldehid (PFA) en az 48 saat süreyle sular altında olacak ° C
- En az 48 saat% 4 PFA fiksasyonu sonra% 30 sakaroz çözeltisini, hemi beyin direkt olarak aktarılabiliyor ve 4 ° C Noktada, hemi beyin sakaroz çözeltisini yüzen olmalıdır. Hemi beyin genellikle 48 saat gerektiren dibe battığı zaman, cryosectioning OCT gömülü olması için hazırdır.
- Cryosectioning önce, OCT topuzu üzerinde ince bir tabaka montaj ve -20 ° C'de dondurmak için izin Hemi beyin ve yerin geri kalanından beyincik dondurulmuş OCT katman üzerine çıkarın. OCT ile hemi beyin hemen kapağı ve yavaş yavaş -20 ° C'de dondurmak için izin Beyin opak dönüşmüştür OCT gömme sonra kesitli olmak için hazırdır.
- Her bölümün kalınlığı 30 mikron ayarlayın. D'Olomos çözümü ile bir kabın içine her dilim toplayın.
2. Nöritik plaklar İmmünohistokimya prosedürü (ücretsiz kayan bölümleri)
- 15 dakika boyunca% 88 formik asit her bölüm davranın. Formik asit tedavisinden sonra, bölüm geçici olarak opak dönecek ve büzüşmeli görünebilir.
- Tx-PBS (% 0.3 PBS içinde Triton X-100) ile 5 dakika X 3 nazik sallayarak bir tabak ve yıkama her bir bölümü çıkarın.
- Blok Endojen Peroksit% 0,5 Tx-PBS, RT H 2 O 2 ile 30 dakika nazik sallayarak engelliyor.
- Tx-PBS bölümü ile 10 dakika X 3 nazik sallayarak yıkayın.
- Nazik sallayarak ile 1 saat oda sıcaklığında Tx-PBS içinde çözünmüş% 5 yağsız yağsız süt Blok bölümü.
- Tx-PBS 4% 5 süt içeren seyreltilmiş primer antikor bölümler (4G8 biotinlenmiş, 1:500-1:2000, Signet) ° C, nazik sallayarak bir gecede. Inkübe
- Tx-PBS bölümü ile 10 dakika X 3 nazik sallayarak yıkayın.
- ABC çözüm üretici protokolü (Elit ABC, vektör Laboratuvarları,) hazırlayın. ABC karışımı bölümleri nazik sallayarak 30 dakika inkübe edin.
- Tx-PBS bölümü ile 10 dakika X 3 nazik sallayarak yıkayın.
- 3,3 '-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB) (Vektör Laboratories) aşağıdaki üretici protokol hazırlayın. Bölümleri DAB karışımı için 5-10 dakika inkübe edin. Bu noktada, kahverengimsi bir renk, her bölüm geliştirmek gözlemlemek olacaktır.
- Tx-PBS bölümü ile 10 dakika X 3 nazik sallayarak yıkayın.
- Serbest yüzen beyin bölümleri doku yapışması ile yardımcı olmak için, jelatin kaplı slaytlar üzerine monte edilir. Bölüm sonra hava, ksilen bir dizi ile takas takip ve Entellen içinde monte edilmiş kurutulmuş.
- Plaklar, 40X büyütmeli ışık mikroskobu altında görüntülendi ve dilim her fare için başına ortalama plak sayımı değerlendirerek sayısal.
3. Thioflavin S nöritik plaklar tespit prosedürü boyama
- Fare fedakarlık ve beyin ekstraksiyon prosedürü gibi bölümlerde 1.1 1.5 gösterilir.
- Mount 4 5 hemi beyin bir cam slayt üzerine bölümler ve tamamen boyamadan önce kurumaya izin verin.
- 1 dakika boyunca% 70 Etanol slaytlar yıkayın.
- 1 dakika boyunca% 80 Etanol slaytlar yıkayın.
- Filtrelenmiş (0.2 mikron filtre) thioflavin S solüsyonu (% 80 Etanol% 1) slayt 15 dakika boyunca inkübe edin. (Thioflavin G çözüm, her kullanımdan önce filtre olması gerekir). Not: thioflavin S ışıktan korumak ve lekeli slaytlar ışıktan korumak.
- 1 dakika boyunca% 80 Etanol slaytlar yıkayın.
- Slaytlar% 70 Etanol 1 dakika ile yıkayın.
- Iki kez distile su ile yıkayın.
- Sulu montaj medya ve slaytlar açık bir oje ile sızdırmazlık lamel tarafından en az 2 saat, karanlıkta kurumasını bekleyin Mount slaytlar. Boyanan kesitler 4 karanlıkta saklanmalıdır ° C
- Yeşil floresan lekeli plaklar floresan microscropy ile görüntülendi. Boyama zamanla kaybolacak, çünkü bir hafta içinde slaytlar analiz edin.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Anti-epileptik ilaç ve nöritik plak oluşumunu engellediğini duygudurum valproik asit (VPA) etkinliğini son çalışmada, yukarıda açıklanan immün kullanılan ve thioflavin G, AD model teşkil eden farelere (3) nöritik plaklar tanımlamak için prosedürler boyama. Şekil 1 anti-Aβ kullanarak biotinlenmiş 4G8 ile boyandı ve ABC yöntemi ile tespit edilen 9 aylık tipik bir eski APP23 transgenik fare, temsil eder. Nöritik plaklar antikor ile açıkça etiketlenir ve beyaz oklarla gösterilir. Thioflavin G boyama kullanarak, 2 aylık APP23xPS tra nöritik plak birikimi tespitnsgenic fareler (Şekil 2). Thioflavin G bağlı Aβ içeren nöritik plaklar floresan mikroskopi (beyaz oklar ile gösterilir) altında yeşil görünür. VPA tedavisi nöritik plak oluşumunu önemli derecede (3) azalır olduğunu gösterdi. Bir başka çalışmada, moleküler bağlantı altta yatan hipoksi ve AD patogenezinde okudu. Yine, hem de anti-Aβ 4G8 immünhistokimya boyama ve thioflavin G boyama kullanarak, biz o hipoksi nöritik plaklar (4) içeren Aβ oluşumunu kolaylaştırmıştır bulundu.
Şekil 1. AD transgenik farelerin nöritik plak oluşumu immünohistokimyasal analizi, 9 ay yaşta APP23 fareler sakrifiye edildi ve diseke edildi, sabit ve kesitli. Hipokampal nöritik plaklar Aβ bir anti-antikor 4G8 kullanılarak tespit edildi ve ABC ve DAB yöntemler kullanılarak geliştirilmiştir. Plaklar 40X ile ışık mikroskobu ile görüntülendi. Beyaz oklar Aβ nöritik plaklar işaret.
Şekil 2. AD modellenen fareler nöritik plaklar Thioflavin G boyama eski 8 hafta APP23xPS45 çift transgenik fareler sakrifiye edildi ve diseke edildi, sabit ve kesitli. Hipokampal nöritik veba thioflavin S floresan boyama kullanılarak doğrulandı ve 40X büyütmede mikroskobu ile görüntülendi. Beyaz oklar thioflavin G lekeli nöritik plaklar göstermektedir.
Discussion
Biotinlenmiş etiketli 4G8 antikor lekeleri AD nöritik plaklar kullanan İmmünohistokimya özgüllük ile modellenen fareler. Boyanması sonucu kantifikasyon ve farklı tedavi grupları arasında plak yükü karşılaştırılması sağlar. Sonucunu etkileyebilecek bazı önemli adımlar vardır. Hemi beyinleri kafatası çıkarma öncesinde perfüze olmadığından, bakım hemi beyin hasarları önlemek amacıyla çıkarma işlemi sırasında kullanılan olmalıdır. Dahası, hemi beyin pasif perfüze olduğundan, biz 4 en az 48 saat% 4 PFA kuluçka tavsiye ° C% 30 sakaroz çözeltisini dalarken önce. Alternatif olarak, transcardial perfüzyon beyin ayıklanması önce yapılması olabilir. Beyin düzgün sabit ise, bir lastik dokusu olmalıdır. Durumda beynin düzgün sabit değildir, bölümler kolayca D'Olomos çözümü veya boyama işlemleri sırasında yırtılabilir.
4G8 monoklonal antikor reaktif amino asit artıkları Aβ, 17-24 ve çekirdek dizisi (VFFAE) epitop tanıdı. 4G8 fare türlerinin türetilmiş olduğundan, daha yüksek bir arka plan boyama vermek eğilimindedir. Bu nedenle, biz, arka plan boyama en aza indirerek hususlar ulaşmak için gerçek bir sinyal ile belirtilen seyreltme bölümleri inkübe seçti.
4G8 antikor kullanarak nöritik plaklar tespiti için immün yanı sıra, bir thioflavin S boyama yöntemi de plaklar tanımlamak için kullanılır. Thioflavin S homojen bir boya karışımı dehydrothiotoluidine metilasyonu sülfonik asit ile elde edilen sonuçlar. Thioflavin G-seçici olmayan beta amiloid oligomerler gibi protein sayfalık içeriği, bağlar. Bağlayıcı üzerine, thioflavin emisyon spektrum karakteristik bir mavi vardiya uğrar. Thioflavin G monomerik formları bağlanma Tersine mavi bir değişimi ortaya çıkarmak ve floresan mikroskop ile tespit edilememiştir. Floresan yoğunluğu amiloid mevduat küçük miktarlarda iyi bir görüntüleme sağlar Thioflavin G boyama amiloid için ekran hızlı bir alternatif sunuyor. Ancak, bir dezavantajı thioflavin G boyama hakkında özgüllük eksikliğidir. Fibrinoids, hiyalin, keratin, vb gibi içeren kapsamlı beta yaprak, dahil olmak üzere birçok diğer doku parçaları, bu boya için oldukça yakınlık var.
Disclosures
Tüm deneyler, British Columbia Hayvan Bakım ve Kullanım komitesi ve CIHR kurallar Üniversitesi ile uygun olarak yapılmıştır.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR) Townsend, Aile, ve Jack Brown ve Aile Alzheimer Araştırma Vakfı (WAS) tarafından desteklenmiştir. WS Kanada Araştırma Başkanı Alzheimer Hastalığı sahibi. PTTL Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Danışma ve Sağlık Araştırma Bursu için Michael Smith Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
