Summary
ई. के रोग विशेषताओं में से एक Amyloid β प्रोटीन सकारात्मक neuritic सजीले टुकड़े के गठन है. Immunohistochemical एबीसी और थपका विधि और फ्लोरोसेंट का पता लगाने का पता लगाने का उपयोग कर एस thioflavin धुंधला विधि का उपयोग: इस प्रोटोकॉल में हम के लिए ट्रांसजेनिक ई. मॉडल चूहों में neuritic सजीले टुकड़े का पता लगाने के लिए दो विधियों का वर्णन करती है.
Abstract
अल्जाइमर रोग (ई.) सबसे आम neurodegenerative विकार मनोभ्रंश के लिए अग्रणी है. Neuritic पट्टिका गठन एक अल्जाइमर रोग के रोग पहचान की है. neuritic सजीले टुकड़े के केंद्रीय घटक है एक छोटे filamentous नामक प्रोटीन amyloid β प्रोटीन (Aβ) 1, जो बीटा amyloid प्रोटीन अग्रदूत β-secretase और γ-secretase द्वारा (एपीपी) के अनुक्रमिक proteolytic दरार से व्युत्पन्न है. amyloid परिकल्पना जरूरत पर जोर देता है कि ई. विकृति में 2 अंतर्निहित विषाक्त तंत्र के रूप में सजीले टुकड़े Aγ युक्त . neuritic पट्टिका की उपस्थिति के शवपरीक्षा विश्लेषण ई. के निदान की पुष्टि करता है. ई. रोगजनन में Aγ तंत्रिका जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे करने के लिए, विभिन्न माउस उपभेदों ई. से संबंधित मानव एपीपी जीन में म्यूटेशन व्यक्त उत्पन्न किया गया. रोग की गंभीरता पर निर्भर करता है, इन चूहों को अलग - अलग उम्र में neuritic सजीले टुकड़े का विकास होगा. इन चूहों रोगजनन और नशीली दवाओं के विकास कि एपीपी प्रसंस्करण मार्ग और neuritic पट्टिका गठन को प्रभावित कर सकता है के अध्ययन के लिए अमूल्य उपकरण के रूप में सेवा करते हैं. इस प्रोटोकॉल में, हम ई. मॉडल चूहों में neuritic सजीले टुकड़े के विशिष्ट पता लगाने के लिए एक immunohistochemical विधि रोजगार. Immunohistochemical एबीसी और थपका विधि और फ्लोरोसेंट का पता लगाने का उपयोग कर एस thiofalvin धुंधला विधि का उपयोग कर पता लगाने: हम विशेष रूप से आधा दिमाग, paraformaldehyde निर्धारण, cryosectioning, और दो ई. ट्रांसजेनिक चूहों में विक्षिप्त सजीले टुकड़े का पता लगाने के तरीकों निकालने से तैयारी पर चर्चा करेंगे.
Protocol
1. माउस दिमाग के फिक्सेशन और cryosectioning
- ट्रांसजेनिक चूहों कार्बन डाइऑक्साइड गैस, कत्ल और निकाले मस्तिष्क द्वारा बाद का उपयोग करने के लिए बलिदान कर रहे हैं.
- मस्तिष्क longitudinally केंद्र में dissected है. मस्तिष्क के आधा जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए सूखी बर्फ पर जमी फ़्लैश जाएगा. अन्य 4% paraformaldehyde (पीएफए) में कम से कम 48 घंटे के लिए जलमग्न हो जाएगा 4 में डिग्री सेल्सियस
- पीएफए में 4% कम से कम 48 घंटे के लिए निर्धारण के बाद, Hemi मस्तिष्क 30% sucrose के समाधान में सीधे स्थानांतरित कर रहा है और 4 में रखा डिग्री सेल्सियस बिंदु पर, Hemi मस्तिष्क sucrose के समाधान में तैर जाना चाहिए. जब HEMI मस्तिष्क के नीचे डूब गया है, आमतौर पर 48 घंटे के बारे में की आवश्यकता होती है, यह करने के लिए तैयार है cryosectioning के लिए अक्टूबर में एम्बेडेड हो.
- Cryosectioning इससे पहले, घुंडी पर अक्टूबर की एक पतली परत माउंट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर की अनुमति Hemi मस्तिष्क और जगह के आराम से की परत जमी अक्टूबर पर सेरिबैलम निकालें. तुरंत अक्टूबर साथ HEMI मस्तिष्क को कवर और धीरे से -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर अनुमति अक्टूबर एम्बेडिंग एक बार मस्तिष्क अपारदर्शी कर दिया है, यह sectioned बनने के लिए तैयार है.
- 30 सुक्ष्ममापी के लिए प्रत्येक अनुभाग की मोटाई को सेट करें. डी 'Olomos समाधान के साथ एक कंटेनर में प्रत्येक टुकड़ा ले लीजिए.
2. Neuritic सजीले टुकड़े के लिए immunohistochemistry प्रक्रिया (मुक्त फ्लोटिंग वर्गों)
- 15 मिनट के लिए 88% चींटी एसिड में प्रत्येक अनुभाग समझो. चींटी एसिड उपचार के बाद, अनुभाग अस्थायी रूप से अपारदर्शी बारी और सूखना करने के लिए प्रकट हो सकता है.
- एक थाली और कोमल झटकों के साथ 5 मिनट 3 एक्स के लिए टीएक्स पीबीएस (0.3% ट्राइटन पीबीएस में X-100) के साथ धोने में प्रत्येक अनुभाग निकालें.
- ब्लॉक अंतर्जात पेरोक्साइड 0.5% टीएक्स Pbs, आरटी में एच 2 2 हे कोमल झटकों के साथ 30 मिनट अवरुद्ध.
- कोमल झटकों के साथ 10 मिनट 3 एक्स के लिए TX-पीबीएस के साथ अनुभाग धो लें.
- 5% गैर कोमल झटकों के साथ एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर टीएक्स - पीबीएस में भंग वसा मलाई निकाला दूध के साथ ब्लॉक अनुभाग.
- प्राथमिक एंटीबॉडी में अनुभागों (Biotinylated 4G8, 1:500-1:2000, सिगनेट) TX-पीबीएस 4 5% दूध युक्त में पतला ° कोमल झटकों के साथ रातोंरात सी सेते
- कोमल झटकों के साथ 10 मिनट 3 एक्स के लिए TX-पीबीएस के साथ अनुभाग धो लें.
- एबीसी समाधान निम्नलिखित निर्माता (कुलीन एबीसी, वेक्टर प्रयोगशालाओं,) प्रोटोकॉल तैयार है. एबीसी मिश्रण में कोमल झटकों के साथ 30 मिनट के लिए वर्गों सेते हैं.
- कोमल झटकों के साथ 10 मिनट 3 एक्स के लिए TX-पीबीएस के साथ अनुभाग धो लें.
- 3,3 'diaminobenzidine (थपका) tetrahydrochloride (वेक्टर प्रयोगशालाओं) निम्नलिखित निर्माता प्रोटोकॉल तैयार है. 5-10 मिनट के लिए थपका मिश्रण में वर्गों सेते हैं. इस बिंदु पर, आप का पालन करेंगे एक भूरे रंग के प्रत्येक अनुभाग पर विकसित है.
- कोमल झटकों के साथ 10 मिनट 3 एक्स के लिए TX-पीबीएस के साथ अनुभाग धो लें.
- फ्री अस्थायी मस्तिष्क वर्गों जिलेटिन लेपित स्लाइड्स पर बढ़ रहे हैं, ऊतक आसंजन के साथ मदद. अनुभाग हैं तो हवा xylene की एक श्रृंखला के साथ समाशोधन द्वारा पीछा सूखे और Entellen में मुहिम शुरू की है.
- सजीले टुकड़े 40x बढ़ाई पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत कल्पना कर रहे हैं और प्रत्येक माउस के लिए टुकड़ा प्रति मतलब पट्टिका गिनती का आकलन करके मात्रा निर्धारित है.
3. Thioflavin एस neuritic सजीले टुकड़े का पता लगाने के लिए प्रक्रिया धुंधला हो जाना
- माउस बलिदान और मस्तिष्क निष्कर्षण प्रक्रिया के रूप में 1.1 वर्गों 1.5 में संकेत कर रहे हैं.
- माउंट एक गिलास स्लाइड पर 4 से 5 HEMI मस्तिष्क वर्गों और पूरी तरह से सूखे धुंधला करने से पहले हवा की अनुमति देते हैं.
- 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ स्लाइड्स धो लें.
- 1 मिनट के लिए 80% इथेनॉल के साथ स्लाइड्स धो लें.
- फ़िल्टर्ड (0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर) एस thioflavin समाधान (इथेनॉल के 80% में 1%) में 15 मिनट के लिए स्लाइड्स सेते हैं. (एस Thioflavin समाधान के लिए प्रत्येक का उपयोग करने से पहले फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए). नोट: प्रकाश से thioflavin एस की रक्षा और प्रकाश से सना हुआ स्लाइड्स की रक्षा.
- 1 मिनट के लिए 80% इथेनॉल के साथ स्लाइड्स धो लें.
- 70% इथेनॉल 1 मिनट के साथ स्लाइड्स धो लें.
- आसुत जल के साथ दो बार धोएं.
- जलीय बढ़ते मीडिया में और स्लाइड्स के अंधेरे में कम से कम 2 घंटे, स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील coverslip द्वारा पीछा के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं माउंट स्लाइड्स. सना हुआ अनुभाग 4 में अंधेरे में संग्रहित किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस
- हरी प्रतिदीप्ति दाग सजीले टुकड़े फ्लोरोसेंट microscropy के साथ कल्पना की जा सकता है. एक सप्ताह के भीतर स्लाइड्स का विश्लेषण क्योंकि धुंधला समय के साथ फीका करना होगा.
4. प्रतिनिधि परिणाम
हमारे विरोधी मिरगी दवा और मूड स्टेबलाइजर valproic एसिड (Vpa) neuritic पट्टिका गठन को बाधित की प्रभावकारिता पर हाल ही के अध्ययन में, हम ऊपर वर्णित immunostaining इस्तेमाल किया और thioflavin एस ई. मॉडल चूहों (3) में neuritic सजीले टुकड़े की पहचान प्रक्रियाओं धुंधला हो जाना. चित्रा 1 एक ठेठ 9 महीने पुरानी APP23 ट्रांसजेनिक माउस, विरोधी - Aβ का उपयोग biotinylated 4G8 के साथ दाग और एबीसी विधि के माध्यम से पता लगाया का प्रतिनिधित्व करता है. Neuritic सजीले टुकड़े एंटीबॉडी के साथ स्पष्ट रूप से चिह्नित कर रहे हैं और सफेद तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. एस thioflavin धुंधला का प्रयोग, हम 2 महीने पुरानी APP23xPS टीआरए बयान neuritic पट्टिका का पता चलाnsgenic चूहों (चित्रा 2). Thioflavin एस बाध्य Aβ युक्त neuritic सजीले टुकड़े प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (सफेद तीर द्वारा संकेत) के तहत हरी प्रकट होता है. हम पता चला कि Vpa उपचार के साथ, neuritic पट्टिका गठन काफी (3) कम है. एक अन्य अध्ययन में, हम आणविक लिंक अंतर्निहित hypoxia और ई. रोगजनन का अध्ययन किया. फिर, दोनों 4G8 immunohistochemistry विरोधी Aβ धुंधला हो जाना और thioflavin एस धुंधला का उपयोग करते हुए, हमने पाया है कि hypoxia neuritic सजीले टुकड़े (4) युक्त Aβ के गठन में मदद.
चित्रा 1. ई. ट्रांसजेनिक चूहों में neuritic पट्टिका गठन के immunohistochemical विश्लेषण 9 महीने की उम्र में APP23 चूहों का बलिदान थे और थे dissected, तय है, और sectioned. Hippocampal में Neuritic सजीले टुकड़े एक विरोधी Aβ एंटीबॉडी 4G8 का उपयोग पाया गया और एबीसी और थपका तरीकों का उपयोग कर विकसित. सजीले टुकड़े प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा 40x के साथ कल्पना थे. व्हाइट तीर Aβ neuritic सजीले टुकड़े करने के लिए बिंदु.
चित्रा 2. ई. मॉडलिंग की चूहों में neuritic सजीले टुकड़े के Thioflavin एस धुंधला APP23xPS45 8 पुराने सप्ताह में डबल ट्रांसजेनिक चूहों. थे और बलिदान थे dissected, तय है, और sectioned. Hippocampal में Neuritic विपत्तियां एस thioflavin फ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग कर रहे थे पुष्टि कर रहे हैं और 40x बढ़ाई माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized. व्हाइट तीर thioflavin एस दाग neuritic सजीले टुकड़े से संकेत मिलता है.
Discussion
लेबल biotinylated 4G8 एंटीबॉडी दाग ई. में neuritic सजीले टुकड़े का उपयोग immunohistochemistry विशिष्टता के साथ चूहों मॉडलिंग की. धुंधला परिणाम विभिन्न उपचार समूहों के बीच पट्टिका लोड की मात्रा का ठहराव और तुलना की अनुमति देता है. वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम है कि परिणाम को प्रभावित कर सकता हैं. क्योंकि HEMI दिमाग खोपड़ी से निकासी के लिए पहले perfused नहीं कर रहे हैं, देखभाल निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए क्रम में HEMI मस्तिष्क को नुकसान को रोकने. इसके अलावा, के बाद से HEMI मस्तिष्क निष्क्रिय perfused है, हम यह पीएफए में 4% 4 में कम से कम 48 घंटे के लिए incubating की सिफारिश डिग्री सेल्सियस से पहले 30% sucrose के समाधान में submerging. वैकल्पिक रूप से, transcardial छिड़काव मस्तिष्क निकालने के लिए पहले किया जा सकता है. यदि मस्तिष्क ठीक से तय हो गई है, यह एक रबड़ बनावट होना चाहिए. मामले में जहां मस्तिष्क ठीक से तय नहीं है, अनुभागों को आसानी से डी 'Olomos समाधान में या धुंधला हो जाना प्रक्रिया के दौरान आंसू जाएगा.
4G8 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एमिनो एसिड 17-24 Aβ के अवशेषों को प्रतिक्रियाशील है और कोर अनुक्रम (VFFAE) में मिलान को मान्यता दी. चूंकि 4G8 माउस प्रजातियों से प्राप्त होती है, यह एक उच्च पृष्ठभूमि धुंधला दे जाता है. इस प्रकार, हम विचार एक सच्चे संकेत प्राप्त करने के लिए, जबकि पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना कम से कम के साथ संकेत कमजोर पड़ने पर वर्गों सेते चुना.
Neuritic सजीले टुकड़े 4G8 एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाने के लिए immunostaining के अलावा, एक एस thioflavin धुंधला विधि भी सजीले टुकड़े की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है. Thioflavin एस एक समरूप डाई मिश्रण है dehydrothiotoluidine के sulfonic एसिड के साथ मेथिलिकरण से परिणाम है कि. Thioflavin एस गैर चुनिंदा प्रोटीन का बीटा शीट amyloid oligomers में उन के रूप में, सामग्री बांध. बंधन पर, thioflavin अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रम की एक विशेषता नीले बदलाव आए. इसके विपरीत एस thioflavin monomeric रूपों के लिए बाध्य एक नीले बदलाव नहीं बटोर और फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ पता चला नहीं सकता. एस Thioflavin धुंधला amyloid के लिए स्क्रीन के लिए एक त्वरित विकल्प प्रदान करता है के रूप में प्रतिदीप्ति की तीव्रता amyloid जमा की छोटी मात्रा के अच्छा दृश्य की अनुमति देता है. हालांकि, एस thioflavin धुंधला के बारे में एक दोष विशिष्टता की कमी है. कई युक्त fibrinoids, Hyaline, केरातिन, आदि जैसे व्यापक बीटा शीट, सहित अन्य ऊतक घटकों, इस डाई के लिए एक नहीं बल्कि आकर्षण है.
Disclosures
सभी प्रयोगों के ब्रिटिश कोलंबिया पशु की देखभाल और उपयोग समिति और CIHR दिशानिर्देशों के विश्वविद्यालय के अनुसार में आयोजित की गई.
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (CIHR), टाउनसेंड परिवार, और जैक ब्राउन और परिवार अल्जाइमर रिसर्च फाउंडेशन (करने के लिए किया गया था) द्वारा समर्थित किया गया. अल्जाइमर रोग में कनाडा अनुसंधान चेयर की धारक है. PTTL प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसल और स्वास्थ्य अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
