Summary
Een van de pathologische kenmerken van AD is de vorming van amyloïde eiwit β positief neuritische plaques. In dit protocol beschrijven we twee methoden om seniele plaques op te sporen in transgene muizen die model AD: immunohistochemische detectie met behulp van de ABC-en DAB-methode en fluorescerende detectie met behulp van thioflavin S kleuringsmethode.
Abstract
De ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening die leidt tot dementie. Neuritische de vorming van tandplak is een van de pathologische kenmerken van de ziekte van Alzheimer. De centrale component van neuritische plaques is een kleine draadvormige eiwit amyloid β-eiwit (Aß) 1, die is afgeleid van een sequentiële proteolytische splitsing van het beta-amyloid precursor proteïne (APP) door β-secretase en γ-secretase. De hypothese houdt in dat amyloïde plaques als de onderliggende giftig mechanisme in AD pathologie 2 Aγ bevatten. De post-mortem analyse van de aanwezigheid van plaque neuritische bevestigt de diagnose van AD. Om verdere onze kennis van Aγ neurobiologie in AD pathogenese, werden verschillende muizenstammen uitdrukken AD-gerelateerde mutaties in het menselijk APP genen gegenereerd. Afhankelijk van de ernst van de ziekte, zullen deze muizen ontwikkelen neuritische plaques op verschillende leeftijden. Deze muizen fungeren als handige tools voor het bestuderen van de pathogenese en de ontwikkeling van geneesmiddelen die de APP verwerking route en neuritische plaquevorming zou kunnen beïnvloeden. In dit protocol, we hanteren een immunohistochemische methode voor specifieke detectie van neuritische plaques in AD model muizen. We zullen specifiek ingaan op de voorbereiding van de extractie van de half hersenen, paraformaldehyde fixatie, cryosectioning, en twee methoden om de neurotische plaques op te sporen in AD transgene muizen: immunohistochemische detectie met behulp van de ABC-en DAB-methode en fluorescerende detectie met behulp van thiofalvin S kleuringsmethode.
Protocol
1. Fixatie van de muis hersenen en cryosectioning
- Transgene muizen worden opgeofferd met behulp van koolstof-dioxide gas, gevolgd door onthoofding en haalde de hersenen.
- De hersenen is in de lengterichting ontleed in het centrum. De helft van de hersenen zal knipperen bevroren op droog ijs voor de biochemische analyse. De andere zal worden ondergedompeld in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende ten minste 48 uur bij 4 ° C.
- Na fixatie in 4% PFA voor ten minste 48 uur, is de hemi hersenen direct omgezet in 30% sucrose-oplossing en geplaatst bij 4 ° C. Op het punt, moet de hemi hersenen zweven in de sucrose-oplossing. Wanneer de hemi hersenen zonk naar de bodem, meestal die ongeveer 48 uur is het klaar om te worden ingebed in oktober voor cryosectioning.
- Voordat cryosectioning, monteren een dun laagje van LGO op de knop en laat bevriezen bij -20 ° C. Verwijder de kleine hersenen van de rest van de hemi hersenen en plaatsen op de laag van bevroren oktober Direct betrekking hebben op de hemi hersenen met oktober en laat langzaam bevriezen bij -20 ° C. Zodra de LGO inbedding van de hersenen is geworden ondoorzichtig, het is klaar om te worden coupes.
- Stel de dikte van elke sectie om 30 pm. Verzamel elk sneetje in een container met D'Olomos oplossing.
2. Immunohistochemie procedure voor seniele plaques (vrij zwevend secties)
- Behandel elke sectie in 88% mierenzuur gedurende 15 minuten. Na de mierenzuur behandeling, zal de sectie tijdelijk uit te ondoorzichtig en lijkt te verschrompelen.
- Verwijder elke sectie in een bord en wassen met Tx-PBS (0,3% Triton X-100 in PBS) gedurende 5 minuten x 3 met zacht schudden.
- Block Endogene Peroxide het blokkeren van 0,5% H 2 O 2 in de Tx-PBS, RT 30 minuten onder zacht schudden.
- Was de sectie met Tx-PBS gedurende 10 min x 3 met zacht schudden.
- Blok sectie met 5% niet-vette afgeroomde melk opgelost in Tx-PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht schudden.
- Incubeer secties in het primaire antilichaam (Biotinylated 4G8, 1:500-1:2000, Signet) verdund in Tx-PBS met 5% melk bij 4 ° C gedurende de nacht onder zacht schudden.
- Was de sectie met Tx-PBS gedurende 10 min x 3 met zacht schudden.
- Bereid ABC oplossing na fabrikant protocol (Elite ABC, Vector Laboratories,). Incubeer secties in ABC mengsel gedurende 30 minuten onder zacht schudden.
- Was de sectie met Tx-PBS gedurende 10 min x 3 met zacht schudden.
- Bereid 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (Vector Laboratories) volgende de fabrikant protocol. Incubeer secties in DAB mengsel gedurende 5-10 minuten. Op dit punt, zal u zich aan een bruinachtige kleur te ontwikkelen op elke sectie.
- Was de sectie met Tx-PBS gedurende 10 min x 3 met zacht schudden.
- Free-floating hersenen secties zijn gemonteerd op gelatine gecoate glaasjes, om te helpen met weefsel hechting. Secties worden vervolgens aan de lucht gedroogd, gevolgd door clearing met een reeks van xyleen en gemonteerd in Entellen.
- Plaques zijn zichtbaar onder een lichtmicroscoop bij 40x vergroting en worden gekwantificeerd door het beoordelen van de gemiddelde plaque tellen per stuk voor elke muis.
3. Thioflavin S kleuringsprocedure voor de detectie van neuritische plaques
- De muis te offeren en hersenen extractie procedure zijn zoals aangegeven in de punten 1.1 tot 1,5.
- Mount 4-5 hemi hersenen secties op een glasplaatje en volledig laten drogen alvorens de kleuring.
- Was de dia's met 70% ethanol gedurende 1 minuut.
- Was de dia's met 80% ethanol gedurende 1 minuut.
- Broed dia's in oplossing gefiltreerd (0,2 um filter) thioflavin S (1% in 80% ethanol) voor 15 minuten. (Thioflavin S oplossing moet worden gefilterd voor elk gebruik). Let op: beschermen thioflavin S tegen licht en beschermen gekleurde dia's uit het licht.
- Was de dia's met 80% ethanol gedurende 1 minuut.
- Was de dia's met 70% ethanol 1 minuut.
- Wassen met gedestilleerd water twee keer.
- Mount dia's in waterige media montage en laat dia's in het donker drogen gedurende minstens 2 uur, gevolgd door een afdichting dekglaasje met duidelijke nagellak. Gekleurde coupes moeten worden opgeslagen in het donker bij 4 ° C.
- De groene fluorescentie gekleurde plaques kan worden gevisualiseerd met fluorescerende microscropy. Analyseren van dia's binnen een week, omdat de kleuring zal vervagen met de tijd.
4. Representatieve resultaten
In onze recente studie over de effectiviteit van het anti-epileptische geneesmiddel en stemmingsstabilisator valproïnezuur (VPA) om neuritische plaquevorming te remmen, gebruikten we de hierboven beschreven immunokleuring en thioflavin S kleuringen aan seniele plaques in AD model muizen (3) te identificeren. Figuur 1 geeft een typische 9 maanden oude APP23 transgene muis, gekleurd met anti-Aß met behulp van gebiotinyleerd 4G8 en gedetecteerd via de ABC-methode. Neuritische plaques zijn duidelijk gemarkeerd met het antilichaam en zijn aangegeven met de witte pijlen. Met behulp van thioflavin S kleuring, we ontdekt neuritische plaque depositie 2 maanden oud APP23xPS transgenic muizen (figuur 2). Gebonden Aß-bevattende thioflavin S neuritische plaques verschijnt groen onder fluorescentie microscopie (aangegeven met witte pijlen). We hebben laten zien dat met VPA behandeling, neuritische plaquevorming aanzienlijk wordt verminderd (3). In een andere studie bestudeerden we de moleculaire verbinding die ten grondslag liggen hypoxie en AD pathogenese. Nogmaals, met behulp van zowel 4G8 anti-Aß immunohistochemie kleuring en thioflavin S kleuring, vonden we dat hypoxie vergemakkelijkt de vorming van Aß met neuritische plaques (4).
Figuur 1. Immunohistochemische analyse van neuritische plaquevorming in AD transgene muizen. APP23 muizen op de leeftijd van 9 maanden werden opgeofferd en werden ontleed, vaste en coupes. Neuritische plaques in de hippocampus werden gedetecteerd met behulp van een anti-Aß antilichaam 4G8 en zijn ontwikkeld met behulp van de ABC-en DAB-methoden. De plaques werden gevisualiseerd door lichtmicroscopie met 40X. Witte pijlen wijzen naar Aß neuritische plaques.
Figuur 2. Thioflavin S kleuring van neuritische plaques in AD gemodelleerd muizen. APP23xPS45 dubbel transgene muizen na 8 weken oud werden gedood en werden ontleed, vaste en coupes. Seniele plagen in de hippocampus zijn werden bevestigd met behulp van fluorescerende kleuren thioflavin S en gevisualiseerd door microscopie bij 40x vergroting. Witte pijlen geven in lood neuritische thioflavin S plaques.
Discussion
Immunohistochemie met behulp van de gebiotinyleerde gelabeld antilichaam 4G8 vlekken seniele plaques in AD gemodelleerd muizen met specificiteit. De kleuring uitkomst kunnen kwantificeren en vergelijken van plaque belasting tussen de verschillende behandelingsgroepen. Er zijn een aantal cruciale stappen die het resultaat kunnen beïnvloeden. Omdat de hemi hersenen zijn niet vóór doorbloed de extractie van de schedel moet erop worden gebruikt tijdens de extractie proces om schade te voorkomen aan de Hemi hersenen. Aangezien de hemi hersenen is passief doorbloed, raden wij incuberen in 4% PFA gedurende ten minste 48 uur bij 4 ° C vóór het onderdompelen in de 30% sucrose oplossing. Als alternatief zou transcardial perfusie voordat zij worden op het verkrijgen van de hersenen. Als de hersenen correct is bevestigd, moet het een rubberachtige textuur. In het geval dat de hersenen niet goed is bevestigd, zal de secties gemakkelijk scheur in de D'Olomos oplossing of tijdens de kleuringen.
De 4G8 monoklonaal antilichaam is reactief naar aminozuur residuen 17-24 van Aß en herkende de epitoop in de kernsequentie (VFFAE). Omdat 4G8 is afgeleid van muizensoorten, heeft het de neiging om een hogere achtergrondkleuring. Zo hebben we ervoor gekozen om de secties in de aangegeven verdunning incubeer met overwegingen om tot een echt signaal terwijl het minimaliseren van achtergrondkleuring.
In aanvulling op immunokleuring voor neuritische plaques opsporen met behulp van de 4G8 antilichaam, is een thioflavin S kleuringsmethode ook gebruikt om plaques te identificeren. Thioflavin S is een homogeen mengsel kleurstof die het gevolg is van methylatie van dehydrothiotoluidine met sulfonzuur. Thioflavin S niet-selectief bindt bèta-sheet inhoud van eiwitten, zoals die in amyloid oligomeren. Na binding, thioflavin ondergaat een karakteristieke blauwe verschuiving van de emissie-spectrum. Omgekeerd thioflavin S binding aan de monomere formulieren worden niet ontlokken een blauwe shift en kon niet worden gedetecteerd met fluorescerende microscoop. Thioflavin S vlekken biedt een snel alternatief voor het screenen op amyloid als de intensiteit van de fluorescentie maakt een goede visualisatie van kleine hoeveelheden amyloïde afzettingen. Echter, een nadeel over vlekken thioflavin S is het gebrek aan specificiteit. Veel andere weefsels componenten, waaronder met uitgebreide bèta-sheets, zoals fibrinoids, hyaline, keratine, etc, hebben een nogal affiniteit voor deze kleurstof.
Disclosures
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Universiteit van British Columbia Dierverzorging en gebruik commissie en CIHR richtlijnen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR), de familie Townsend, en Jack Brown en familie de ziekte van Alzheimer Research Foundation (naar WAS). WS is de houder van de Canada Research Chair bij de ziekte van Alzheimer. PTTL wordt ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Counsel en de Michael Smith Foundation for Health Research Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
