Summary
Una delle caratteristiche patologiche di Alzheimer è la formazione di placche di amiloide β neuritiche proteina positivo. In questo protocollo si descrivono due metodi per rilevare placche neuritiche in topi transgenici modello AD: rilevazione immunoistochimica utilizzando il metodo ABC e DAB e la rilevazione con metodo di colorazione fluorescente thioflavin S.
Abstract
Malattia di Alzheimer (AD) è il disturbo più comune neurodegenerativa che porta alla demenza. La formazione di placche neuritiche è una delle caratteristiche patologiche della malattia di Alzheimer. Il componente centrale di placche neuritiche è una piccola proteina chiamata proteina filamentosa β amiloide (Aβ) 1, che è derivata da sequenziale taglio proteolitico della proteina beta-amiloide precursore (APP) da β-secretasi e γ-secretasi. L'ipotesi amiloide comporta che Aγ contenenti placche come il meccanismo sottostante tossici in AD patologia 2. L'analisi post-mortem della presenza di placca neuritiche conferma la diagnosi di Alzheimer. Per ulteriormente la nostra comprensione della neurobiologia Aγ nella patogenesi dell'Alzheimer, vari ceppi di topi che esprimono AD-correlati mutazioni nei geni APP umani sono stati generati. A seconda della gravità della malattia, questi topi si svilupperà placche neuritiche in età diverse. Questi topi servire come preziosi strumenti per lo studio della patogenesi e sviluppo di droghe che potrebbero influenzare il percorso di elaborazione APP e la formazione della placca neuritiche. In questo protocollo, utilizziamo un metodo di immunoistochimica per l'individuazione specifica delle placche neuritiche nei topi modello dC. Noi specificamente discutere della preparazione di estrarre il cervello e mezzo, la fissazione paraformaldeide, criosezionamento, e due metodi per rilevare placche nevrotico nel AD topi transgenici: rilevazione immunoistochimica utilizzando il metodo ABC e DAB e la rilevazione con metodo di colorazione fluorescente thiofalvin S.
Protocol
1. Fissazione dei cervelli del mouse e criosezionamento
- Topi transgenici sono sacrificati con anidride carbonica, seguita dalla decapitazione e il cervello estratto.
- Il cervello è sezionato longitudinalmente al centro. La metà del cervello saranno istantaneamente congelati in ghiaccio secco per l'analisi biochimica. L'altro sarà sommersa nel 4% paraformaldeide (PFA) per almeno 48 ore a 4 ° C.
- Dopo la fissazione in PFA 4% per almeno 48 ore, il cervello emi sono trasferiti direttamente nella soluzione di saccarosio al 30% e posto a 4 ° C. Al punto, il cervello dovrebbe essere emi galleggiante nella soluzione di saccarosio. Quando il cervello Hemi affondò sul fondo, di solito richiede circa 48 ore, è pronto per essere incorporato in ottobre per criosezionamento.
- Prima criosezionamento, montare un sottile strato di ottobre sulla manopola e far congelare a -20 ° C. Rimuovere il cervelletto dal resto del cervello e emi posto sullo strato di gelato ottobre Coprire immediatamente il cervello emi con OCT e permettono di congelare lentamente a -20 ° C. Una volta che l'embedding ottobre il cervello si è trasformato opaco, è pronto per essere sezionato.
- Impostare lo spessore di ogni sezione a 30 micron. Raccogliere ogni fetta in un contenitore con la soluzione D'Olomos.
2. Procedura di immunoistochimica per placche neuritiche (gratuito sezioni flottante)
- Trattare ogni sezione in 88% di acido formico per 15 minuti. Dopo il trattamento con acido formico, la sezione sarà temporaneamente volta opaco e può apparire avvizzire.
- Rimuovere ogni sezione in un piatto e lavare con Tx-PBS (0,3% Triton X-100 in PBS) per 5 min x 3 agitando delicatamente.
- Perossido di blocco endogeno blocco dello 0,5% H 2 O 2 in Tx-PBS, RT 30 minuti agitando delicatamente.
- Lavare con Tx-PBS per 10 min x 3 agitando delicatamente.
- Sezione di blocco con 5% senza grassi del latte scremato sciolto in Tx-PBS a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente.
- Incubare le sezioni in anticorpo primario (biotinilato 4g8, 1:500-1:2000, Sigillo) diluito in Tx-PBS contenente 5% del latte a 4 ° C per una notte agitando delicatamente.
- Lavare con Tx-PBS per 10 min x 3 agitando delicatamente.
- Preparare protocollo del produttore soluzione ABC successivo (Elite ABC, Vector Laboratories). Incubare le sezioni in miscela ABC per 30 minuti agitando delicatamente.
- Lavare con Tx-PBS per 10 min x 3 agitando delicatamente.
- Preparare 3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) (Vector Laboratories) protocollo del produttore successivo. Incubare le sezioni in miscela DAB per 5-10 min. A questo punto, si potrà osservare un colore brunastro svilupparsi su ogni sezione.
- Lavare con Tx-PBS per 10 min x 3 agitando delicatamente.
- Free-floating sezioni cervello sono montate su vetrini rivestiti di gelatina, per aiutare con l'adesione dei tessuti. Le sezioni sono poi essiccate all'aria seguita da compensazione con una serie di xilene e montati in Entellen.
- Placche sono visualizzati al microscopio ottico con ingrandimento 40X e sono quantificati valutando la media della conta targa per fetta per ogni mouse.
3. Thioflavin S colorazione procedura per l'individuazione delle placche neuritiche
- Sacrificio del mouse e procedure di estrazione del cervello sono quelli indicati in punti da 1.1 a 1.5.
- Montare 4-5 sezioni del cervello emi su un vetrino e lasciare asciugare completamente prima della colorazione.
- Lavare i vetrini con etanolo al 70% per 1 minuto.
- Lavare i vetrini con 80% etanolo per 1 minuto.
- Incubare i vetrini in soluzione filtrata (0,2 micron filtro) thioflavin S (1% a 80% di etanolo) per 15 minuti. (Soluzione Thioflavin S deve essere filtrata prima di ogni utilizzo). Nota: thioflavin S proteggere dalla luce e proteggere i vetrini colorati dalla luce.
- Lavare i vetrini con 80% etanolo per 1 minuto.
- Lavare i vetrini con il 70% etanolo 1 minuto.
- Lavare con acqua distillata due volte.
- Diapositive montare in acquosi di montaggio e permettere che i vetrini ad asciugare al buio per almeno 2 ore, seguita da coprioggetto tenuta con smalto trasparente. Sezioni colorate devono essere conservati al buio a 4 ° C.
- La fluorescenza verde placche colorate possono essere visualizzate con microscropy fluorescenti. Analizzare le diapositive entro una settimana, perché la colorazione svanirà con il tempo.
4. Rappresentante Risultati
Nel nostro recente studio sulla efficacia del farmaco anti-epilettico e stabilizzatore dell'umore acido valproico (VPA) per inibire la formazione di placche neuritiche, abbiamo usato il immunocolorazione sopra descritto e thioflavin S colorazione procedure per identificare le placche neuritiche nei topi modello dC (3). La figura 1 rappresenta un tipico 9 mesi APP23 topo transgenico, colorate con 4g8 con anti-Aβ biotinilato e rilevati con il metodo ABC. Placche neuritiche sono chiaramente etichettati con l'anticorpo e sono indicati dalle frecce bianche. Mediante colorazione thioflavin S, abbiamo rilevato deposizione neuritiche targa 2 mesi vecchia APP23xPS traditopi nsgenic (Figura 2). Thioflavin S legato Aβ contenenti placche neuritiche appare verde al microscopio a fluorescenza (indicato da frecce bianche). Abbiamo dimostrato che il trattamento con VPA, la formazione di placche neuritiche è significativamente ridotto (3). In un altro studio, abbiamo studiato l'ipossia molecolare collegamento sottostante e patogenesi dell'Alzheimer. Ancora una volta, utilizzando sia 4g8 anti-Aβ colorazione immunoistochimica e colorazione thioflavin S, abbiamo scoperto che l'ipossia favorito la formazione di placche contenenti Aβ neuritiche (4).
Figura 1. Analisi immunoistochimica della formazione di placche neuritiche in topi transgenici dC. APP23 topi all'età di 9 mesi sono stati sacrificati e sono stati sezionati, fissa e sezionato. Placche neuritiche nel dell'ippocampo sono state rilevate con un anti-Aβ 4g8 anticorpo e sono stati sviluppati utilizzando i metodi ABC e DAB. Le placche sono state visualizzate mediante microscopia ottica con 40X. Frecce bianche indicano placche neuritiche Aβ.
Figura 2. Colorazione Thioflavin S di placche neuritiche nei topi dC modellato. APP23xPS45 doppio topi transgenici a 8 settimane di vita sono stati sacrificati e sono stati sezionati, fissa e sezionato. Piaghe neuritiche nel dell'ippocampo sono state confermate mediante colorazione fluorescente thioflavin S e visualizzati al microscopio con ingrandimento 40x. Frecce bianche indicano thioflavin S placche neuritiche macchiato.
Discussion
Immunoistochimica utilizzando il biotinilato macchie anticorpo marcato 4g8 placche neuritiche nel AD modellato topi con specificità. Il risultato colorazione consente la quantificazione e il confronto del carico di placca tra i diversi gruppi di trattamento. Ci sono diversi passi cruciali che potrebbero influenzare l'esito. Poiché il cervello emi non sono perfusi prima dell'estrazione dal cranio, la cura deve essere usato durante il processo di estrazione al fine di prevenire danni al cervello emi. Inoltre, poiché il cervello emi è passivamente perfuso, si consiglia di incubazione in 4% PFA per almeno 48 ore a 4 ° C prima immersione nella soluzione di saccarosio al 30%. In alternativa, la perfusione transcardial poteva essere fatto prima di estrarre il cervello. Se il cervello è fissata correttamente, dovrebbe avere una consistenza gommosa. Nel caso in cui il cervello non è fissato bene, le sezioni sarà facile strappare nella soluzione D'Olomos o durante le procedure di colorazione.
L'anticorpo monoclonale 4g8 è reattivo ai residui di aminoacidi 17-24 di Aβ e ha riconosciuto l'epitopo nella sequenza core (VFFAE). Dal momento che 4g8 è derivato da specie del mouse, si tende a dare una colorazione di fondo più alto. Così, abbiamo scelto di incubare le sezioni alla diluizione indicata con considerazioni a raggiungere un vero segnale, minimizzando la colorazione di fondo.
Oltre a immunocolorazione per neuritiche rilevamento targhe con l'anticorpo 4g8, metodo di colorazione uno thioflavin S è anche utilizzato per identificare le placche. Thioflavin S è una miscela omogenea colorante che risulta dalla metilazione di dehydrothiotoluidine con acido solfonico. Thioflavin S non si lega selettivamente i contenuti foglietto beta di proteine, come quelle in oligomeri amiloide. Su vincolante, thioflavin subisce un cambiamento caratteristico blu del suo spettro di emissione. Al contrario vincolante thioflavin S alle forme monomeriche non suscitare un spostamento verso il blu e non poteva essere rilevata con il microscopio a fluorescenza. Colorazione Thioflavin S offre una valida alternativa per lo screening rapido per amiloide come l'intensità della fluorescenza permette una buona visualizzazione di piccole quantità di depositi di amiloide. Tuttavia, uno svantaggio di colorazione thioflavin S è la mancanza di specificità. Molti altri componenti del tessuto tra cui fogli contenenti beta estese, quali fibrinoids, ialina, cheratina, ecc, hanno un po affinità con questo colorante.
Disclosures
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con l'Università di cura degli animali Columbia britannica e il comitato Usa e le linee guida CIHR.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR), la Famiglia Townsend, e Jack Brown e Famiglia Alzheimer Research Foundation (a WAS). WS è titolare del Canada Research Chair nella malattia di Alzheimer. PTTL è supportato dal Scienze Naturali e Direttore di Ricerca di Ingegneria e del Michael Smith Fondazione per la borsa di studio Health Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
