Summary
Disturbi vocali sono debilitanti in invecchiamento e la malattia di Parkinson. Le vocalizzazioni ultrasoniche dei ratti, anche affetti da queste condizioni, può essere utilizzato per studiare questi disturbi vocali, i loro substrati neurali, e la natura di recupero funzionale con l'intervento comportamentale.
Abstract
Deficit vocali sono una complicazione comune delle due morbo di Parkinson (PD) e l'invecchiamento, possono diminuire in modo significativo la qualità della vita di impatto capacità di comunicazione 1, 2 di formazione mirata (voce / terapia voce) può migliorare deficit voce specifica, 3, 4, anche se l'. meccanismi alla base di interventi comportamentali non sono ben compresi. Indagine sistematica del deficit voce e la terapia dovrebbero prendere in considerazione molti fattori che sono difficili da controllare negli esseri umani, quali l'età, ambiente familiare, età dopo la comparsa della malattia, gravità della malattia, e farmaci. Il metodo qui presentato utilizza un modello animale di vocalizzazione che permette lo studio sistematico di come cambiare i meccanismi alla base sensomotoria con la formazione vocale mirata. Le procedure di registrazione ad ultrasuoni ed analisi di cui al presente protocollo sono applicabili a qualsiasi indagine di vocalizzazioni roditori a ultrasuoni.
Le vocalizzazioni ultrasoniche di roditori stanno emergendo come un modello valido per indagare i substrati neurali del comportamento. 5-8 Sia roditori e vocalizzazioni umani portano valore semiotico e sono prodotte da un flusso d'aria modificando egressive con una costrizione della laringe. 9, 10 Così, vocalizzazioni roditore può essere un utile modello per lo studio deficit voce in un contesto sensomotorio. Inoltre, i modelli di topo ci permettono di studiare le basi neurobiologiche di recupero da deficit di formazione mirata.
Per modellare PD usiamo lungo Evans ratti (Charles River Laboratories International, Inc.) e indurre parkinsonismo da un'infusione unilaterale di 7 mg di 6-idrossidopamina (6-OHDA) nel fascio mediale del proencefalo che provoca la degenerazione da moderata a grave presinaptico neuroni dello striato (per dettagli vedere Ciucci, 2010). 11, 12 Per il nostro modello di invecchiamento usiamo il Fischer 344/Brown Norvegia F1 (National Institute on Aging).
Il nostro metodo principale per suscitare vocalizzazioni è quello di esporre ratti maschi sessualmente esperti a ratti femmina sessualmente recettiva. Quando il maschio si interessa nella femmina, la femmina viene rimosso e il maschio continua a vocalizzare. Ricompensando vocalizzazioni complesse con cibo o acqua, sia il numero di vocalizzazioni complesse e il tasso di vocalizzazioni può essere aumentata (Figura 1).
Un microfono ad ultrasuoni montato sopra gabbia a casa del maschio registra le vocalizzazioni. La registrazione inizia dopo il ratto femmina viene rimosso per isolare le chiamate maschile. Vocalizzazioni possono essere visualizzati in tempo reale per la formazione o registrate e analizzate in linea. Con la registrazione e analisi acustica vocalizzazioni prima e dopo l'allenamento vocale, gli effetti della malattia e il ripristino della funzione normale con l'allenamento può essere valutata. Questo modello ci permette anche di mettere in relazione il comportamento osservato (vocal), miglioramenti ai cambiamenti nel cervello e nel sistema neuromuscolare.
Protocol
1. Pre / Post-formazione Recordings
- Iniziare il monitoraggio ad ultrasuoni con Avisoft Recorder utilizzando la configurazione mostrata in Figura 2.
- Vocalizzazioni ultrasoniche possono essere monitorati sia visivamente osservando in tempo reale spettrogramma, o foneticamente con le cuffie collegato alla interfaccia di registrazione ultrasuoni.
- Inserire una sessualmente ricettiva (in estro) ratto femmina nella gabbia casa del topo soggetto maschile. I segni di estro comprendono lordosi, orecchio dimenando, e rapida guizzanti. Le femmine in estro suscitare più vocalizzi da maschi che le femmine non sessualmente ricettiva.
- Dopo che il maschio ha mostrato interesse per il sesso femminile (ad esempio, sniffing, inseguire, e / o montaggio), togliere la femmina e registrare vocalizzazioni del maschio per 1-2 minuti.
- Se il maschio non vocalizzare immediatamente, brevemente riportare il ratto femmina a casa gabbia del maschio per stimolare la vocalizzazione.
2. Formazione vocale
- Iniziare il monitoraggio ad ultrasuoni con Avisoft Recorder usando la stessa configurazione mostrata in Figura 2.
- Posizionare il topo maschio nella sua gabbia casa sotto il microfono.
- Metti un topo femmina nella gabbia del maschio a casa. Come affermato in precedenza, il ratto femmina dovrebbe essere in estro per massimizzare la risposta vocalizzazione dal maschio.
- Una volta che il maschio ha mostrato interesse per la femmina rimuovere la femmina.
- Subito dopo il maschio produce la vocalizzazione bersaglio, premiare contemporaneamente con un solo clic penna e una breve presentazione della bottiglia di acqua o di trattare cibo. Inizialmente, ogni 50-kHz a modulazione di frequenza (Figura 5B) chiamata viene premiato. La formazione progredisce solo le stringhe sempre più complesse delle chiamate, come le stringhe da 5 a 10 chiamate in rapida successione, sono rafforzate.
- Continuare la sessione di allenamento prima di aver dato 30 rinforzi. Ciò richiede in genere tra i 5 - 10 minuti.
3. Preparazione per l'analisi acustica
- Sempre archiviare i file audio originali e apportare le modifiche e le misure su una copia di lavoro, come l'analisi necessarie operazioni di filtro e la cancellazione del rumore da ciascun file.
- Utilizzando la modalità batch di Avisoft SASLab Pro, filtro passa-alto di tutti i file audio da analizzare a 25 kHz per eliminare il rumore indesiderato sotto le vocalizzazioni ultrasoniche.
- Per poter utilizzare la funzione di rilevamento automatico di SASLab Pro, la soglia di rumore deve prima essere determinato. Per fare questo, aprire un file audio e creare un spettrogramma utilizzando le impostazioni mostrate nella figura 3.
- La visualizzazione automatica dei parametri misurazioni devono essere impostati in base alle impostazioni mostrato nella Figura 4.
- Trova una zona del spettrogramma dove non ci sono chiamate o rumori, questo è il rumore di fondo.
- Utilizzando il "automatico (soglia unica)" opzione, impostare la soglia nella sezione Elemento separazione dei box automatico dei parametri di configurazione di dialogo Misure a poco sopra il rumore di fondo regolando la linea nera nella finestra dello spettro di potenza al di sopra del spettrogramma. Nella Figura 4, la soglia è stata fissata a -55 dB.
- Nella parte inferiore della finestra di dialogo, impostare il "Rifiuta se ampiezza di picco è inferiore al" valore di 1 dB sotto la soglia trovato nel passaggio precedente. Questi due valori devono ora essere utilizzato per tutti i file audio analizzati, assumendo tutte le impostazioni di registrazione erano gli stessi.
4. Vocalizzazione di identificazione
- Per etichettare le vocalizzazioni utilizzando la soglia automatica cui sopra, prima creare un spettrogramma con le impostazioni di cui sopra.
- Cancellare manualmente qualsiasi rumore che soddisfi i seguenti criteri: 1) è stato erroneamente identificato come una vocalizzazione, 2) sta influenzando la discriminazione di inizio e / o alla fine del vocalizzazione, e / o 3) è stato erroneamente identificato come il più alto o frequenza più bassa nella vocalizzazione (indicato dalle linee superiore e inferiore rosso, rispettivamente). In alternativa, la start / stop volte delle etichette vocalizzazione può essere regolata manualmente dopo la creazione di etichette permanenti al punto 4.5. Influiscano sulle misurazioni del rumore di alta e bassa frequenza, tuttavia, deve essere cancellata manualmente.
- In alcuni casi una vocalizzazione non sarà in grado di essere separata dai rumori circostanti, come il suono di biancheria da letto durante la locomozione. In questi casi, la chiamata non può essere accuratamente analizzati e dovrebbero essere cancellate.
- Una volta che tutte le vocalizzazioni sono stati identificati, cancellare definitivamente cancellato le sezioni del spettrogramma del file audio, selezionando "Rimuovi sezioni spettrogramma cancellato dalla forma d'onda ..." dal menu a discesa Strumenti. Se questo comando non viene eseguito prima del spettrogramma è chiuso, cancellando tutto il lavoro sarà perso.
- Creare etichette permanente nel file audio cliccando sul tasto 'modifica' nella sezione Elemento separazione della finestra di configurazione automatica dei parametri misure.
- Visivamente ed acusticamente rivedere ogni vocalizzazione etichettati in modo da determinare la sua categoria: semplice, frequenza modulata (FM), o armonica. Culoign l'etichetta appropriata utilizzando il testo predefinito-moduli. Esempi di ogni categoria vocalizzazione sono mostrati in figura 5.
- Chiudere il spettrogramma, salvare il file audio, e continuare con il file audio successivo da analizzare.
5. Misure acustiche
- Dopo vocalizzazioni in tutti i file audio sono stati identificati, utilizzare lo strumento di elaborazione batch (Strumenti: Batch Processing) per misurare automaticamente i parametri acustici di tutti i file.
- Nella finestra di dialogo di elaborazione batch, selezionare "Misure parametri Automatico" dal menu a discesa.
- Selezionare il "processo di tutti i file nella cartella selezionata" checkbox quindi fare clic sul pulsante "cartella" e selezionare la cartella dove sono salvati i file audio.
- Fare clic su "Start" e ogni file verrà automaticamente analizzati secondo le ultime impostazioni utilizzate nella casella di misurazione automatica di dialogo dei parametri di configurazione.
- Le misure saranno salvati in un file di testo che può essere definita utilizzando i parametri DDE / comando File log Setting. Questo file di testo può essere importato in un programma per l'analisi statistica.
6. Rappresentante dei risultati:
Vocalizzazioni ultrasoniche dei ratti sono influenzati dalle variazioni fisiologiche legate all'invecchiamento e 6-OHDA modelli di malattia di Parkinson 13 Di solito, noi vediamo una riduzione della qualità delle vocalizzazioni ad ultrasuoni caratterizzato da una riduzione dei seguenti parametri acustici quantitativi:. Larghezza di banda, frequenza di picco, durata , e l'intensità. La Figura 6 mostra le vocalizzazioni modulazione di frequenza di un topo nel modello PD in tre momenti diversi: basale, dopo l'induzione della malattia di Parkinson, e dopo l'allenamento vocalizzazione. Nella condizione di PD, la chiamata mostra una riduzione della larghezza di banda, durata e intensità. Inoltre, la modulazione di frequenza è diventata irregolare.
Oltre alla degradazione di specifici parametri acustici, anche noi osserviamo la complessità generale meno nei tipi di vocalizzazioni prodotte in ratti anziani e parkinsonismo. Ad esempio, dopo l'induzione della malattia di Parkinson un ratto produce un maggior numero di chiamate semplice e richiede un minor numero di frequenza modulata. Formazione vocalizzazione seguenti, molti parametri acustici, come la durata e l'intensità, i livelli basali approccio e il numero di chiamate aumenta complesso (Figura 6). Ratti anziani manifestano degrado simile di parametri acustici nella loro vocalizzazioni ultrasoniche. Attualmente stiamo studiando gli effetti della formazione vocale in ratti anziani.
Figura 1. Numero di vocalizzazioni per sessione (target soddisfatti da tutti i topi ogni settimana) e tasso di vocalizzazione (errore di media e standard in figura) sia aumentare nel corso di un periodo di 6 settimane di formazione in un gruppo di due giovani (9 mesi) e vecchi (32 mo) Fischer 344/Brown Norvegia topi F1.
Figura 2 vocalizzazioni rappresentante di ciascuna delle tre categorie di 50 kHz vocalizzazioni;. (A) semplice, (B) a modulazione di frequenza, e (C) armonica.
Figura 3. Rappresentante a modulazione di frequenza vocalizzi da un singolo ratto (A) al basale, (B) post-PD induzione, e (C) formazione dopo vocalizzazione.
Discussion
Vocalizzazioni ultrasoniche nei ratti sembrano essere vulnerabili a processi di invecchiamento e le malattie, come il morbo di Parkinson. Queste vocalizzazioni ultrasoniche forniscono un modello di comportamento della funzione vocale, inclusi i deficit che accompagnano i cambiamenti fisiologici a causa di malattie e invecchiamento. Inoltre, i cambiamenti acustici ad ultrasuoni in vocalizzazioni sono facilmente misurabili e quantificati. Inoltre, vocalizzazioni ultrasoniche possono essere modificati attraverso interventi comportamentali. Pertanto, vocalizzazioni topo ad ultrasuoni forniscono un utile modello per studiare l'impatto della malattia, l'invecchiamento, e gli interventi terapeutici su entrambi i comportamenti e alla base dei meccanismi neurobiologici.
Il nostro metodo di addestramento vocale utilizza uno stimolo condizionato (un clic), associato ad un rinforzo positivo (un trattamento acqua o cibo ricompensa). Il click seguita dalla ricompensa è usato per rinforzare vocalizzazioni di complessità crescente. Definiamo vocalizzazioni complesse, come quelle che contengono un "trillo" (a modulazione di frequenza) componente (Figura 5B) rispetto a quelli che sono "piatti" e mantenere una singola frequenza (Figura 5A). Questo componente a modulazione di frequenza è facilmente identificabile per il suo aspetto sinusoidale. Mentre il 50-kHz vocalizzazioni possono essere completamente sinusoidale (Figura 5B), è comune incontrare più complesse 50-kHz vocalizzazioni che consistono in parte di questa componente a modulazione di frequenza, nonché di un salto di grandi dimensioni in frequenza o di un componente breve piana. Queste vocalizzazioni più complesse possono avere pause brevi, inferiori a 10 ms tra i componenti, ma sono considerati una vocalizzazione singolo. Anche se più dettagliate sotto-classificazione di queste vocalizzazioni è possibile in linea, 14 classifichiamo tutti i 50-kHz vocalizzazioni che contiene un componente di frequenza modulata così complesso per ridurre la necessità di linea classificazione soggettiva e ridurre la variabilità di rinforzo. In laboratorio proprio, è importante scegliere come i dati vengono classificati e analizzati secondo un disegno di studio appropriato per lo scopo dello studio.
Ci sono molti fattori da considerare quando si utilizza questo protocollo. Prima di tutto, nonostante l'omogeneità genetica e coerenza procedurale, i ratti hanno una risposta variabile alla formazione. Alcuni ratti naturalmente vocalizzare più di altri, 5 o sono motivati da esposizione ad una più femminile che da una ricompensa in cibo o acqua. Un modo per tenere conto di questa variabilità è esaminando la variazione di parametri acustici da vocalizzazioni base ratti individuali 'ai loro post-lesione e post-formazione vocalizzazioni. Anche se non discussi in questo protocollo, abbiamo anche test comportamentali per quantificare interesse per il sesso femminile, come la latenza per il montaggio. Inoltre, a seconda dell'età e del livello di attività di un singolo ratto, un alto filo può essere necessario sulla gabbia a casa durante l'allenamento per evitare la fuga. Nonostante la variabilità individuale, abbiamo utilizzato con successo questo protocollo su una varietà di ceppi e di età per migliorare vocalizzazioni rispetto al basale di ogni ratto individuo.
I ratti sono sensibili ai cambiamenti apparentemente piccoli nell'ambiente, come profumi, la temperatura e il personale. Uno sforzo dovrebbe essere fatto per evitare profumati per la cura personale, quali lozioni, prodotti per capelli e profumi. Prima di tentare di formazione, un individuo deve essere confortevole e interagire con la gestione ratti. Inoltre, tutte le incongruenze del personale o ambiente possono influenzare la risposta vocalizzazione dei topi '.
Poiché i topi sono animali notturni, dovrebbero essere tenuti al ciclo di luce invertito per consentire la formazione si svolgono durante la porzione scura del loro ciclo, quando sono più attivi. Noi illuminare la nostra sala corsi con luci rosse. Inoltre, se una ricompensa acqua viene utilizzata durante l'addestramento, i ratti dovrebbero avere accesso limitato all'acqua. I nostri topi sono acqua limitato per 21 ore prima della sessione di allenamento. Tre ore di esposizione acqua è stata determinata dalla nostra Animal Care Comitato Istituzionale e Usa di essere il meno restrittivo periodo di tempo che ha permesso all'acqua di essere utile come rinforzo nei nostri studi comportamentali senza presentare un compromesso sostanziale alla salute degli animali o il benessere. I ratti hanno accesso ad acqua in momenti casuali (10 minuti a 30 minuti) dopo l'allenamento e, successivamente, hanno libero accesso ad acqua per tre ore durante la porzione scura del loro ciclo di luce. I ratti devono essere ispezionati ogni giorno per i segni di disidratazione e pesava ogni due giorni per assicurare non c'è una significativa (superiore al 10%), perdita di peso. Una restrizione alimentare non è necessaria se si utilizza un piacere il cibo come ricompensa. Tratta, specifici del ratto sono disponibili in commercio, ma abbiamo trovato un piccolo pezzo di un cereale zuccherino di essere una ricompensa efficace.
Come accennato in precedenza, ratti femmine in estro ottenere una risposta vocalizzazione superiore di maschi rispetto alle donne non sessualmente ricettiva. Mantenendo un elevato numero di femmine nella colonia, c'è un'alta probabilità che aalmeno una femmina sarà in estro in un dato giorno. Tuttavia, estro può anche essere indotta farmacologicamente nelle femmine di ratto da iniettare per via sottocutanea 10 mg di β-estradiolo a 0,1 cc di olio di sesamo sterile 48 ore prima della formazione seguita da 500 mg di progesterone in olio di sesamo 0,1 cc sterile 4 ore prima formazione. Inoltre, i ratti maschi che sono ingenui a ratti femmina deve essere sessualmente sperimentato prima formazione vocale. Ciò si ottiene inserendo un topo femmina che si mostrano segni di recettività sessuale (guizzanti, lordosi, dimenando orecchio) nella gabbia del maschio a casa fino a quando i monti maschile e eiacula. I maschi non possono montare durante le prime sessioni e la femmina può essere rimosso dopo l'interesse maschile mostra nella femmina da sniffare e / o inseguire la femmina intorno alla gabbia. Sessualmente vivendo è fatto una volta al giorno per due settimane. Questo periodo di tempo offre anche l'opportunità per i ratti di abituarsi allo sperimentatore (s) e sala di registrazione.
Una limitazione di questo metodo è la determinazione soggettiva del tipo di vocalizzazione. Inoltre, questo fattore limita la velocità di raccolta dei dati, come ogni chiamata deve essere esaminata in maniera indipendente e classificati manualmente. A questo si collega l'importanza di avere valutatori esperti che sono stati costantemente addestrati nell'identificazione vocalizzazione. Sia l'affidabilità intra ed inter-rater dovrebbero essere valutati nel vostro laboratorio.
In sintesi, vocalizzazioni ultrasoniche nei roditori sono utilizzati in diversi modelli per lo studio del cervello-comportamento rapporti, compresi gli stati emotivi, ricompensa e dipendenza, e stati patologici, come l'autismo. 6,14-16 Questo nuovo metodo è un modo per studiare la meccanismi alla base mirata formazione vocale per il trattamento del deficit voce in invecchiamento e malattia di Parkinson. Questo metodo ha il potenziale per essere applicate a modelli di altre malattie che colpiscono la comunicazione e la voce.
Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alle linee guida e regolamenti stabiliti dalla Politica Public Health Service on umanitaria Care ed uso di animali da laboratorio, la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e l'atto benessere degli animali. Il protocollo di impiego di animali è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) della University of Wisconsin-Madison School of Medicine e Sanità Pubblica.
Acknowledgments
Sostenuto dal National Institutes of Health (dell'NIDCD, P30-DC010754, T32-DC009401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft BioAcoustics | 40011 | |
| UltraSoundGate 116Hb | Avisoft BioAcoustics | 41161 | |
| Avisoft-RECORDER | Avisoft BioAcoustics | 10201 | |
| Avisoft-SASLab Pro | Avisoft BioAcoustics | 10101 |
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