Gezielte Schulung von Ultraschall Vocalizations in Aged und Parkinson-Ratten

Summary

Stimmstörungen sind in Alterungs-und Parkinson-Krankheit eine Schwächung. Die Ultraschall-Laute von Ratten, die ebenfalls von diesen Bedingungen betroffen sind, können verwendet werden, um diese Stimmstörungen, ihre neuronalen Substrate und die Art der funktionellen Erholung mit Verhaltenstherapie zu untersuchen.

Abstract

Voice-Defizite sind eine häufige Komplikation von Morbus Parkinson (PD) und des Alterns, sie können erheblich verringern die Lebensqualität durch den Aufprall Kommunikationsfähigkeit ^{1, 2} Gezieltes Training (Sprache / Stimme Therapie) können spezifische ^{Sprach-Defizite, 3, 4} zu verbessern, obwohl die. zugrunde liegenden Mechanismen von Verhaltens-Interventionen sind nicht gut verstanden. Systematische Untersuchung von Sprach-Defizite und Therapie sollten viele Faktoren, die schwer beim Menschen, wie Alter, häusliche Umgebung, Alter Post-Ausbruch der Krankheit, der Schwere der Erkrankung und Medikamente zu kontrollieren. Die hier vorgestellte Methode verwendet ein Tiermodell der Stimmgebung, die für systematische Untersuchung, wie zugrundeliegenden sensomotorischen Mechanismen ändern gezielte Stimmbildung ermöglicht. Die Ultraschall-Aufzeichnungs-und Analyseverfahren in diesem Protokoll beschrieben werden, die für eine Untersuchung von Nagetieren Ultraschall Lautäußerungen.

Die Ultraschall-Laute von Nagetieren sind als ein wertvolles Modell auftauchen, um die neuronalen Substrate Verhalten zu untersuchen. ^5-8 Beide Nagetier und menschlichen Lautäußerungen tragen semiotischen Wert und sind durch Modifizierung eines egressiv Luftstrom mit einer Kehlkopf-Verengung erzeugt. ^{9, 10} So, Nagetier vocalizations kann ein nützliches Modell für Sprach-Defizite in einem sensomotorischen Kontext zu studieren. Darüber hinaus ermöglichen Rattenmodellen uns auf die neurobiologischen Grundlagen der Erholung von Defiziten durch gezielte Schulungen zu studieren.

Zur Modellierung PD verwenden wir Long-Evans-Ratten (Charles River Laboratories International, Inc.) und induzieren Parkinson durch eine einseitige Infusion von 7 pg 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) in den medialen Vorderhirn bündeln, die mittelschwere bis schwere Degeneration der präsynaptischen Ursachen striatalen Neuronen (für Details siehe Ciucci, 2010). ^{11, 12} für die alternde Modell verwenden wir die Fischer 344/Brown Norwegen F1 (National Institute on Aging).

Unsere primäre Methode zur Auslösung Lautäußerungen ist, sexuell erfahrenen männlichen Ratten zu sexuell empfänglich weiblichen Ratten auszusetzen. Wenn das Männchen interessieren sich für die weibliche wird, ist das weibliche entfernt und der männliche weiterhin vocalize. Durch die Belohnung komplexe Laute mit der Nahrung oder Wasser, sowohl die Anzahl der komplexen Lautäußerungen und die Rate der Laute kann erhöht werden (Abbildung 1).

Ein Ultraschall-Mikrofon oberhalb des Mannes nach Hause Käfig montiert zeichnet die Laute. Die Aufzeichnung beginnt nach der weiblichen Ratte wird entfernt, um die männlichen Anrufe zu isolieren. Vocalizations können in Echtzeit für die Ausbildung oder erfasst und analysiert offline betrachtet werden. Durch die Aufzeichnung und akustisch analysiert Laute vor und nach der Stimmbildung, können die Auswirkungen der Krankheit und die Wiederherstellung der normalen Funktion mit der Ausbildung geprüft werden. Dieses Modell erlaubt uns auch, die beobachteten Verhaltensänderungen (Gesang) Verbesserungen an Veränderungen im Gehirn und das neuromuskuläre System beziehen.

Protocol

1. Pre / Post-Ausbildung Recordings

1. Begin Ultraschall-Überwachung mit Avisoft Recorder mit der Konfiguration in Abbildung 2 dargestellt.
2. Ultraschall-Laute kann entweder visuell durch die Beobachtung der real-time Spektrogramm überwacht, oder akustisch über Kopfhörer eingesteckt in den Ultraschall-Recording-Interface.
3. Legen Sie eine sexuell empfänglich (in Östrus) weibliche Ratte in das Haus Käfig des Themas männlichen Ratte. Signs of Rosse sind Lordose, Ohr wackeln und schnellen Sausen. Weibchen in der Brunst zu entlocken mehr Laute von Männern als nicht-sexuell empfänglich Frauen.
4. Nach dem männlichen Interesse an der weiblichen (zB Schnupfen, jagen, und / oder Montage) gezeigt hat, entfernen Sie die weibliche und notieren Sie die männlichen Lautäußerungen für 1-2 Minuten.
5. Wenn der Mann nicht sofort vocalize kurz Rückkehr der weiblichen Ratten die männliche Hause Käfig Stimmgebung zu stimulieren.

2. Stimmbildung

1. Begin Ultraschall-Überwachung mit Avisoft Recorder mit der gleichen Konfiguration in Abbildung 2 dargestellt.
2. Setzen Sie den männlichen Ratten in seinem eigenen Käfig unter dem Mikrofon.
3. Legen Sie eine weibliche Ratte in der männlichen Hause Käfig. Wie bereits erwähnt, sollte die weibliche Ratte in Brunst werden, um die Vokalisierung Antwort von den männlichen zu maximieren.
4. Sobald das Männchen hat Interesse an der weiblichen gezeigt entfernen das Weibchen.
5. Unmittelbar nach dem männlichen das Ziel Vokalisierung produziert, gleichzeitig Belohnung mit einem Stift klicken und eine kurze Darstellung der Wasserflasche oder Nahrung zu behandeln. Zunächst wird eine 50-kHz-Frequenz moduliert (Abbildung 5B) nennen belohnt. Als Ausbildung fortschreitet nur immer komplexer Saiten von Anrufen, z. B. Zeichenfolgen von 5 bis 10 Anrufe in rascher Folge, verstärkt werden.
6. Fahren Sie mit der Trainingseinheit, bis Sie 30 Verstärkungen gegeben haben. Dies dauert in der Regel zwischen 5 bis 10 Minuten.

3. Vorbereitungen für die akustische Analyse

1. Immer Archiv der ursprünglichen Sound-Dateien und Änderungen vornehmen und Messungen an einer Arbeitskopie, wie die Analyse erfordern Filterung und Löschung von Lärm von jeder Datei.
2. Mit dem Batch-Modus von Avisoft SASLab Pro, Filter Hochpass alle Sound-Dateien, um bei 25 kHz analysiert werden, um unerwünschte Geräusche unterhalb der Ultraschall-Laute zu entfernen.
3. Um die automatische Funktion zur Erkennung von SASLab Pro verwenden, muss der Lärm-Schwelle erstmals bestimmt werden. Um dies zu tun, öffnen Sie eine Sound-Datei und erstellen Sie ein Spektrogramm mit den Einstellungen in Abbildung 3 dargestellt.
4. Der automatische Parameter-Messungen Display sollte Setup entsprechend den Einstellungen in Abbildung 4 dargestellt werden.
5. Finden Sie einen Bereich des Spektrogramm, wo es keine Gespräche oder Geräusche, das ist die Geräuschkulisse.
6. Mit dem "automatischen (single-Schwelle)"-Option, die Schwelle in die Element Trennung Abschnitt der automatischen Parameter-Messungen Dialogfeld, um knapp über dem Hintergrundrauschen durch Anpassung der schwarzen Linie in das Leistungsspektrum Fenster über dem Spektrogramm. In Abbildung 4 ist die Schwelle auf -55 dB eingestellt.
7. Am unteren Rand des Dialogfelds, stellen Sie die "Ablehnen, wenn Spitzenamplitude weniger als" Wert auf 1 dB unterhalb der Schwelle der im vorherigen Schritt gefunden. Diese beiden Werte sollten nun für alle Sound-Dateien analysiert, vorausgesetzt, alle Aufnahme-Einstellungen waren dieselben verwendet werden.

4. Vokalisation Identification

1. Um die Beschriftung der Laute mit Hilfe der automatischen Schwellenwert festgelegt oben, erstellen Sie zuerst ein Spektrogramm mit den obigen Einstellungen.
2. Manuell löschen Sie alle Geräusche, die die folgenden Kriterien erfüllt: 1) wurde fälschlicherweise als Stimmgebung, 2) identifiziert, die die Diskriminierung der Anfang und / oder Ende der Stimmgebung und / oder 3) wurde zu Unrecht als das höchste oder identifiziert niedrigste Frequenz in der Stimmgebung (angedeutet durch die obere und untere rote Linien). Alternativ kann die Start / Stopp-Zeiten der Stimmgebung Etiketten manuell nach Schaffung dauerhafter Etiketten in Schritt 4.5 unten angepasst werden. Lärm beeinträchtigt die hoch-und niederfrequenten Messungen müssen aber manuell gelöscht werden.
3. In einigen Fällen ist eine Vokalisierung nicht in der Lage, aus den umliegenden Geräusche, wie der Klang der Betten bei der Fortbewegung zu trennen. In diesen Fällen kann der Anruf nicht genau analysiert werden und sollten gelöscht werden.
4. Sobald alle Laute identifiziert worden sind, endgültig zu löschen die gelöschten Abschnitte des Spektrogramm aus der Sound-Datei, indem Sie "Remove gelöscht Spektrogramm Abschnitte aus Wellenform ..." aus dem Tools-Drop-Down-Menü. Wenn dieser Befehl nicht ausgeführt wird, bevor das Spektrogramm geschlossen ist, werden alle Löschen Arbeit verloren.
5. Erstellen von dauerhaft Etiketten in der Sound-Datei, indem Sie auf "Bearbeiten"-Button in der Element Separation Bereich der automatischen Parameter-Messungen Setup-Fenster.
6. Optisch und akustisch überprüfen jedes beschriftet Vokalisierung seiner Kategorie zu bestimmen: einfach, frequenzmodulierten (FM) oder harmonisch. Arschign das entsprechende Etikett mit den vordefinierten Text-Module. Beispiele für jede Vokalisation Kategorie sind in Abbildung 5 dargestellt.
7. Schließen Sie das Spektrogramm, speichern Sie die Audio-Datei, und fahren Sie mit dem nächsten Sound-Datei zu analysieren.

5. Akustische Messungen

1. Nach Lautäußerungen in allen Sound-Dateien identifiziert worden sind, verwenden Sie die Batch-Verarbeitung-Tool (Tools: Batch Processing) zur automatischen Messung der akustischen Parameter von allen Dateien.
2. In der Batch-Verarbeitung Dialog, wählen Sie "Automatische Parameter-Messungen" aus dem Drop-Down-Menü.
3. Wählen Sie den "Prozess alle Dateien im ausgewählten Ordner aktivieren" klicken Sie auf "Ordner"-Button und wählen Sie den Ordner, in dem die Audiodateien gespeichert sind.
4. Klicken Sie auf "Start" und jede Datei wird automatisch entsprechend den Einstellungen in den letzten Automatic Parameter Messaufbau Dialog verwendet analysiert werden.
5. Die Messungen werden in eine Textdatei, die definiert, unter Verwendung der DDE Parameter / Log-Datei einstellen Befehl kann eingespart werden. Diese Textdatei kann dann in ein Programm zur statistischen Analyse importiert werden.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Ultraschall-Laute von Ratten werden durch physiologische Veränderungen mit dem Altern und 6-OHDA Parkinson-Modellen verbunden betroffenen ¹³ typischerweise, sehen wir eine Reduktion der Qualität der Ultraschall-Laute durch eine Verminderung der folgenden quantitativen akustischen Parameter charakterisiert:. Bandbreite, Peak-Frequenz, Dauer und Intensität. Abbildung 6 zeigt die frequenzmodulierte Laute einer Ratte in der PD-Modell in drei verschiedenen Zeitpunkten: baseline, nach Induktion der PD und nach Vokalisierung Ausbildung. In der PD Zustand, zeigt den Aufruf einer Verringerung der Bandbreite, Dauer und Intensität. Darüber hinaus hat die Frequenzmodulation unregelmäßig.

Neben dem Abbau von spezifischen akustischen Parameter, beobachten wir auch insgesamt weniger Komplexität in der Art der Laute in der Alters-und Parkinson-Ratten hergestellt. Zum Beispiel nach Induktion der PD eine Ratte produziert eine größere Anzahl von einfachen Aufrufen und weniger frequenzmodulierten Anrufe. Nach Vokalisierung Ausbildung, viele akustische Parameter wie Dauer und Intensität, Ansatz Ausgangswerte und die Anzahl der komplexen Anrufe erhöht (Abbildung 6). Aged Ratten manifestieren ähnliche Verschlechterung der akustischen Parameter in ihre Ultraschall-Laute. Wir untersuchen derzeit die Auswirkungen der Stimmbildung in alten Ratten.

Abbildung 1. Anzahl der Laute pro Sitzung (Ziel von allen Ratten trat jede Woche) und Vokalisierung (Mittelwert und Standardabweichung dargestellt) sowohl Anstieg über einen 6-wöchigen Praktikums in einer Gruppe von Jung (9 Monate) und alten (32 mo) Fischer 344/Brown Norwegen F1 Ratten.

Abbildung 2 Vertreter Lautäußerungen von jeder der drei Kategorien von 50 kHz Vokalisationen;. (A) einfach, (B) frequenzmodulierten und (C) harmonisch.

Abbildung 3. Representative frequenzmodulierte Laute aus einer Ratte an (A) Baseline, (B) Post-PD Induktion und (C) nach Vokalisierung Ausbildung.

Discussion

Ultraschall-Laute bei Ratten zu sein scheinen anfällig für Alterung und Krankheit Prozesse, wie Parkinson-Krankheit. Diese Ultraschall-Laute eine Verhaltens-Modell der Stimmfunktion, darunter Defizite, die physiologischen Veränderungen aufgrund von Krankheit und Altern zu begleiten. Darüber hinaus sind akustische Veränderungen in der Ultraschall-Laute leicht gemessen und quantifiziert. Darüber hinaus können Ultraschall-Laute durch verhaltenstherapeutische Maßnahmen geändert werden. Deshalb bieten Ratte Ultraschall vocalizations ein nützliches Modell, um die Auswirkungen der Krankheit zu untersuchen, Altern und therapeutische Interventionen sowohl auf das Verhalten und die zugrunde liegenden neurobiologischen Mechanismen.

Unsere Methode der Stimmbildung nutzt einen konditionierten Reiz (ein Klick) mit einer positiven Verstärkung (ein Wasser-oder Leckerchen belohnen) assoziiert. Der Klick durch die Belohnung folgte dient zur Laute der zunehmenden Komplexität zu verstärken. Wir definieren komplexe Laute als solche mit einem "Triller" (frequenzmoduliert) Komponente (Abbildung 5B) im Vergleich zu denen, die "flat" sind und Aufrechterhaltung einer einzigen Frequenz (Abbildung 5A). Diese Frequenz moduliert Komponente ist leicht an ihrer sinusförmigen Aussehen identifiziert. Während 50-kHz Vokalisationen kann vollständig sinusförmige (Abbildung 5B) ist es üblich, bis hin zu komplexeren 50-kHz Vokalisationen, die teilweise von dieser Frequenz moduliert Komponente sowie entweder große Sprünge in der Frequenz oder eine kurze flache Komponente bestehen zu begegnen. Diese komplexeren Lautäußerungen können kurze Pausen von weniger als 10 ms zwischen den einzelnen Komponenten, sondern als eine einzige Vokalisation. Obwohl weitere detaillierte Sub-Klassifizierung dieser Laute ist möglich, offline, ¹⁴ klassifizieren wir alle 50-kHz Vokalisationen mit einer Frequenz moduliert Komponente als komplex, um die Notwendigkeit von Online-subjektive Klassifizierung verringern und Verstärkung Variabilität. In Ihrem eigenen Labor ist es wichtig, zu entscheiden, wie Daten klassifiziert und nach einer Studie Design, die für den Zweck der Studie wird analysiert.

Es gibt viele Faktoren zu berücksichtigen, wenn dieses Protokoll verwenden. Vor allem, trotz genetische Homogenität und verfahrensrechtlichen Konsistenz, haben Ratten eine variable Reaktion auf Training. Einige Ratten natürlich vocalize mehr als andere, ⁵ oder durch Bestrahlung mit einer weiblichen mehr als ein Nahrungsmittel oder Wasser Belohnung motiviert. Ein Weg, wir Rechnung für diese Variabilität ist durch die Untersuchung der Veränderung der akustischen Parameter von einzelnen Ratten 'baseline Lautäußerungen ihrer post-Läsion und nach dem Training Lautäußerungen. Obwohl nicht in dieses Protokoll diskutiert, haben wir auch Verhaltensänderungen Assays, das Interesse an den weiblichen wie Latenz zu montieren quantifizieren. Darüber hinaus je nach Alter und Aktivität eines einzelnen Ratte, kann ein Draht oben auf der Homepage Käfig während des Trainings, um eine Flucht zu verhindern benötigt werden. Trotz individueller Unterschiede ist es uns gelungen dieses Protokoll auf eine Vielzahl von Stämmen und Alter, um Laute bezogen auf jedes einzelne Ratte Grundlinie zu verbessern.

Ratten sind empfindlich auf scheinbar kleine Veränderungen in der Umwelt, wie Düften, Temperatur und Personal. Es sollten Anstrengungen unternommen, um duftende Körperpflegemittel, wie Lotionen, Haarpflegemittel und Düfte zu vermeiden. Bevor Sie versuchen, Ausbildung, muss eine Person sein komfortablen Interaktion mit und Handhabung Ratten. Darüber hinaus können etwaige Unstimmigkeiten in Personal oder Umwelt in Mitleidenschaft ziehen die Ratten "Vokalisierung Antwort.

Da Ratten nachtaktiv sind, sollten sie auf eine umgekehrte Lichtzyklus gehalten werden, um für die Ausbildung, um während der dunklen Teil ihres Zyklus zu nehmen, wenn sie am aktivsten sind erlaubt. Wir beleuchten unserem Schulungsraum mit roten Lichtern. Außerdem, wenn ein Wasser Belohnung beim Training verwendet wird, sollte Ratten haben eingeschränkten Zugang zu Wasser. Unsere Ratten sind Wasser für 21 Stunden vor dem Training beschränkt. Drei Stunden Einwirkung von Wasser wurde von unserem Institutional Animal Care ermittelt und Verwenden Ausschuss für die am wenigsten restriktive Zeit, dass das Wasser nützlich zu sein als Verstärkung in unserer Verhaltensstudien ohne ein substanzielles Kompromiss für die Tiergesundheit oder das Wohlbefinden zugelassen werden. Ratten sind der Zugang zu Wasser zu zufälligen Zeiten (10 bis 30 Minuten) nach dem Training gegeben und anschließend haben freien Zugang zu Wasser für drei Stunden während der dunklen Teil ihrer Licht-Zyklus. Ratten sollten inspiziert täglich auf Anzeichen von Austrocknung und gewogen werden jeden zweiten Tag, um sicherzustellen, gibt es keine signifikanten (größer als 10%) Gewichtsverlust. Ein Lebensmittel-Einschränkung ist nicht erforderlich, wenn mit einem Leckerchen als Belohnung. Behandelt speziell für Ratten sind im Handel erhältlich, aber wir haben ein kleines Stück eines zuckerhaltigen Getreide gefunden, um eine wirksame Belohnung.

Wie bereits erwähnt, zu entlocken weiblichen Ratten in Östrus eine höhere Vokalisierung Antwort von Männern als nicht-sexuell empfänglich Frauen. Durch die Aufrechterhaltung einer großen Anzahl von Frauen in der Kolonie, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass beimindestens ein Weibchen in der Brunst an einem bestimmten Tag sein. Allerdings kann Östrus auch pharmakologisch bei weiblichen Ratten werden durch subkutane Injektion von 10 ug β-Estradiol in 0,1 ccm sterile Sesamöl 48 Stunden vor dem Training von 500 ug von Progesteron in 0,1 ccm sterile Sesamöl 4 Stunden vor dem Training, gefolgt induziert. Darüber hinaus muß die männliche Ratten, die naiv zu weiblichen Ratten sind sexuell erfahrene vor Stimmbildung werden. Dies geschieht, indem eine weibliche Ratte, die Anzeichen von Paarungsbereitschaft (Stechen, Lordose, Ohr wackeln) wird in den männlichen Heimkäfig bis der männliche Halterungen und ejakuliert erreicht. Männer können nicht während der ersten Sitzungen montieren und das Weibchen nach dem Männchen zeigt Interesse an der weiblichen durch Schnüffeln und / oder der Jagd nach dem weiblichen um den Käfig entfernt werden. Sexuell erfahren wird einmal täglich für zwei Wochen getan. Diese Zeit bietet auch die Gelegenheit für Ratten an den Experimentator (s) und die Aufnahme Raum zu gewöhnen.

Eine Einschränkung dieser Methode ist die subjektive Bestimmung der Vokalisation Typ. Darüber hinaus begrenzt dieser Faktor die Geschwindigkeit der Datenerfassung, da jeder Anruf unabhängig geprüft werden müssen und manuell klassifiziert. In diesem Zusammenhang ist die Bedeutung der mit erfahrenen Bewertern, die regelmäßig in Vokalisierung Identifikation geschult. Sowohl Intra-und Inter-Reliabilität sollte in Ihrem eigenen Labor geprüft werden.

Zusammenfassend sind Ultraschall-Laute bei Nagern in vielen verschiedenen Modellen verwendet werden, um Gehirn-Verhalten Beziehungen, einschließlich emotionaler Zustände, Belohnung und Sucht und Krankheit Staaten, wie zB Autismus-Studie. ^6,14-16 Diese neuartige Methode ist ein Weg, um das Studium Mechanismen, die gezielte Stimmbildung für die Behandlung von Sprach-Defizite in Altern und Parkinson-Krankheit. Diese Methode hat das Potenzial, auf andere Krankheitsmodelle, die Kommunikation und Stimme beeinflussen angewendet werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA	Avisoft BioAcoustics	40011
UltraSoundGate 116Hb	Avisoft BioAcoustics	41161
Avisoft-RECORDER	Avisoft BioAcoustics	10201
Avisoft-SASLab Pro	Avisoft BioAcoustics	10101