Summary
Trastornos de la voz se debilita en el envejecimiento y la enfermedad de Parkinson. Las vocalizaciones de ultrasonidos de ratas, también se ven afectados por estas condiciones, puede ser usado para estudiar los trastornos de la voz, sus sustratos neurales, y la naturaleza de la recuperación funcional, con intervención de la conducta.
Abstract
Déficit de voz son una complicación común de ambos enfermedad de Parkinson (PD) y el envejecimiento, que pueden disminuir significativamente la calidad de vida por el impacto de las habilidades de comunicación 1, 2 de formación específica (voz / terapia de la voz) puede mejorar los déficits específicos de voz, 3, 4, aunque el. mecanismos subyacentes de las intervenciones conductuales no son bien entendidos. La investigación sistemática de los déficit de la voz y el tratamiento debe considerar muchos factores que son difíciles de controlar en los seres humanos, como la edad, ambiente familiar, la edad post-aparición de la enfermedad, la severidad de la enfermedad y los medicamentos. El método que aquí se presenta utiliza un modelo animal de vocalización que permite el estudio sistemático de cómo los mecanismos subyacentes sensoriomotora cambiar con el entrenamiento de voz de destino. Los procedimientos de registro y análisis de ultrasonido indica en este protocolo son aplicables a cualquier investigación de las vocalizaciones de los roedores por ultrasonidos.
Las vocalizaciones ultrasónicas de los roedores se están convirtiendo en un modelo útil para investigar los sustratos neurales de la conducta. 8.5 Tanto los roedores y las vocalizaciones humanas tienen valor semiótico y se producen mediante la modificación de un flujo de aire egressive con una constricción laríngea. 9, 10 Por lo tanto, las vocalizaciones de roedores puede ser un modelo útil para estudiar el déficit de voz en un contexto sensorio. Además, los modelos de rata nos permiten estudiar las bases neurobiológicas de la recuperación de los déficits de formación específica.
Para el modelo PD utilizamos ratas Long-Evans (Charles River Laboratories International, Inc.) e inducir parkinsonismo unilateral de una infusión de 7 g de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en el haz medial del cerebro anterior que causa la degeneración de moderada a grave de la pre-sináptica las neuronas del cuerpo estriado (para más detalles ver Ciucci, 2010). 11, 12 para el modelo de envejecimiento se utiliza el Fischer 344/Brown Noruega F1 (National Institute on Aging).
Nuestro principal método para provocar vocalizaciones es exponer a ratas machos sexualmente experimentados a ratas hembras sexualmente receptivas. Cuando el hombre se interesa por la hembra, la hembra se retira y el hombre sigue a vocalizar. Al recompensar vocalizaciones complejas con los alimentos o el agua, tanto en el número de vocalizaciones complejas y la tasa de vocalización puede ser aumentada (Figura 1).
Un micrófono de ultrasonidos montado sobre jaula del macho registra las vocalizaciones. La grabación se inicia después de la rata hembra se retira a aislar las llamadas masculinas. Vocalizaciones se pueden ver en tiempo real para la formación o registrados y analizados fuera de línea. Al registrar y analizar acústicamente vocalizaciones antes y después del entrenamiento vocal, los efectos de la enfermedad y la restauración de la función normal de entrenamiento puede ser evaluado. Este modelo también nos permite relacionar el comportamiento observado (vocal) mejoras a los cambios en el cerebro y el sistema neuromuscular.
Protocol
1. Pre / post-entrenamiento Grabaciones
- Comenzar el monitoreo por ultrasonido con Avisoft grabadora mediante la configuración que se muestra en la Figura 2.
- Vocalizaciones ultrasónicas se puede controlar visualmente observando el espectrograma en tiempo real, o auditivamente con auriculares conectados a la interfaz de grabación de ultrasonido.
- Coloque una sexualmente receptiva (en celo) de ratas hembra en la jaula de la rata macho tema. Signos de estro incluyen lordosis, moviendo la oreja y lanzando rápidos. Las hembras en celo obtener más vocalizaciones de los hombres que no son sexualmente hembras receptivas.
- Después de que el hombre ha mostrado interés en la mujer (por ejemplo, inhalación, perseguir y / o montaje), retirar la hembra y el registro de vocalizaciones del macho durante 1-2 minutos.
- Si el macho no vocalizar inmediatamente, volver brevemente la rata hembra a la jaula de la casa del hombre para estimular la vocalización.
2. Entrenamiento vocal
- Comenzar el monitoreo por ultrasonido con Avisoft grabadora utilizando la misma configuración que se muestra en la Figura 2.
- Coloque la rata macho en su jaula en el micrófono.
- Poner una rata hembra en la jaula de la casa del macho. Como se indicó anteriormente, la rata hembra debe estar en celo para maximizar la respuesta de la vocalización de los hombres.
- Una vez que el hombre ha mostrado interés en la mujer retire la mujer.
- Inmediatamente después el macho produce la vocalización de destino, la recompensa al mismo tiempo con un lápiz y haga clic en una breve presentación de la botella de agua o el tratamiento de los alimentos. Inicialmente, los 50 kHz de frecuencia modulada (Figura 5) llamada es recompensado. Como el entrenamiento progresa sólo cadenas cada vez más complejo de las llamadas, como las cadenas de 5 a 10 llamadas en una rápida sucesión, se refuerzan.
- Continuar con la sesión de entrenamiento hasta que haya un plazo de 30 refuerzos. Esto suele tardar entre 5 - 10 minutos.
3. Preparación para el análisis acústico
- Siempre archivar los archivos de sonido original y realizar los cambios y las mediciones en una copia de trabajo, ya que el análisis será necesario filtrar y borrar el ruido de cada archivo.
- Utilizando el modo por lotes de Avisoft SASLab Pro, filtro de paso alto de todos los archivos de sonido para ser analizado a 25 kHz para eliminar el ruido no deseado por debajo de la vocalización ultrasónica.
- Para utilizar la función de detección automática de SASLab Pro, el umbral de ruido debe ser determinada. Para ello, abra un archivo de sonido y crear un espectrograma con la configuración que se muestra en la Figura 3.
- El parámetro de visualización automática de mediciones debe ser configurado de acuerdo con la configuración que se muestra en la Figura 4.
- Busque un área del espectrograma, donde no hay llamadas o los ruidos, lo que es el ruido de fondo.
- Utilizando el "automático (único umbral)" opción, establezca el umbral de la sección de separación de elementos del parámetro automático cuadro de diálogo de configuración para las mediciones justo por encima del ruido de fondo mediante el ajuste de la línea de negro en la ventana del espectro de energía por encima del espectrograma. En la Figura 4, el umbral se ha establecido en -55 dB.
- En la parte inferior del cuadro de diálogo, establecer el "Rechazar si la amplitud de pico es inferior al" valor de 1 dB por debajo del umbral en el paso anterior. Estos dos valores ahora se debe utilizar para todos los archivos de sonido analizado, asumiendo que todos los ajustes de grabación eran los mismos.
4. Vocalización identificación
- Para etiquetar las vocalizaciones con la regulación automática indicados anteriormente, primero debe crear un espectrograma con la configuración anterior.
- Manualmente borrar cualquier ruido que cumple con los siguientes criterios: 1) ha sido identificado erróneamente como una vocalización, 2) está afectando a la discriminación de los principios y / o al final de la vocalización, y / o 3) ha sido identificado erróneamente como el más alto o frecuencia más baja en la vocalización (indicado por las líneas rojas superior e inferior, respectivamente). Por otra parte, las horas de inicio / parada de las etiquetas de vocalización se puede ajustar manualmente después de la creación de etiquetas permanentes en el paso 4.5. Ruido que afectan las mediciones de frecuencia alta y baja, sin embargo, debe ser borrado manualmente.
- En algunos casos, una vocalización no podrán ser separados de los ruidos circundantes, tales como el sonido de la ropa de cama durante la locomoción. En estos casos, la llamada no puede ser analizado y precisión debe ser borrado.
- Una vez que todas las vocalizaciones han sido identificados, borrar permanentemente las secciones eliminadas del espectrograma del archivo de sonido, seleccione "Eliminar borra secciones espectrograma de forma de onda ..." de las herramientas en el menú desplegable. Si este comando no se ejecuta antes de que el espectrograma se cierra, todo el trabajo de borrado se perderá.
- Crear etiquetas permanentes en el archivo de sonido haciendo clic en el botón 'Editar' en la sección de los elementos de separación de la ventana de configuración de parámetros de medidas automáticas.
- Visual y auditivamente revisar cada vocalización etiqueta para determinar su categoría: Frecuencia simple, modulada (FM), o armónico. Culoign la etiqueta apropiada con el pre-texto definido por módulos. Ejemplos de cada categoría de vocalización se muestran en la Figura 5.
- Cerrar el espectrograma, guarde el archivo de sonido, y continuar con el archivo de sonido junto a analizar.
5. Las mediciones acústicas
- Después de vocalizaciones en todos los archivos de sonido han sido identificados, utilice la herramienta de procesamiento por lotes (Herramientas: Batch Processing) para medir automáticamente los parámetros acústicos de todos los archivos.
- En el cuadro de diálogo de procesamiento por lotes, seleccione "Las mediciones de parámetros automático" en el menú desplegable.
- Seleccione el "proceso de todos los archivos de la carpeta seleccionada" casilla de verificación haga clic en la "carpeta" y seleccione la carpeta donde los archivos de sonido se guardan.
- Haga clic en "Inicio" y cada archivo se analiza automáticamente de acuerdo con la última configuración utilizada en el cuadro de parámetros de medición automática de diálogo de configuración.
- Las mediciones se guardarán en un archivo de texto que se puede definir mediante los parámetros de DDE / comandos del archivo de registro de configuración. Este archivo de texto se puede importar en un programa para el análisis estadístico.
6. Los resultados representativos:
Vocalizaciones ultrasónicas de las ratas se ven afectados por los cambios fisiológicos asociados con el envejecimiento y la 6-OHDA modelos de la enfermedad de Parkinson 13 Por lo general, se observa una reducción en la calidad de las vocalizaciones ultrasónicas se caracteriza por una reducción de los parámetros acústicos cuantitativos:. Ancho de banda, frecuencia máxima, la duración , y la intensidad. La Figura 6 muestra las vocalizaciones de frecuencia modulada de una rata en el modelo PD en tres momentos diferentes: inicial, después de la inducción de la EP, y después del entrenamiento de vocalización. En el estado de la EP, la llamada muestra una reducción en el ancho de banda, duración e intensidad. Además, la modulación de frecuencia se ha convertido en irregulares.
Además de la degradación de determinados parámetros acústicos, también se observa una menor complejidad global de los tipos de vocalizaciones producidas en las ratas seniles y parkinsonismo. Por ejemplo, después de la inducción de la EP una rata produce un mayor número de llamadas simple y menos llamadas de frecuencia modulada. Formación vocalización siguientes, muchos parámetros acústicos, tales como la duración e intensidad, los niveles de aproximación de referencia y aumenta el número de llamadas complejas (Figura 6). Ratas de edad manifiesta la degradación similar de los parámetros acústicos en sus vocalizaciones ultrasónicas. Actualmente estamos investigando los efectos del entrenamiento vocal en ratas de edad.
Figura 1. El número de vocalizaciones por sesión (objetivo cumplido por todas las ratas a la semana) y la tasa de vocalización (media y error estándar de muestra) se incrementan en un período de 6 semanas en un grupo de los jóvenes (9 meses) y adultos (32 mo) Fischer 344/Brown Noruega ratas F1.
Figura 2 vocalizaciones representante de cada una de las tres categorías de 50 vocalizaciones kHz;. (A) simple, (B) de frecuencia modulada, y la armónica (C).
Figura 3. Representante de frecuencia modulada vocalizaciones de una sola rata en (A) de referencia, (B) después de la inducción-PD, y (C) la formación después de la vocalización.
Discussion
Vocalizaciones ultrasónicas en ratas parecen ser vulnerables a los procesos de envejecimiento y la enfermedad, tales como la enfermedad de Parkinson. Estas vocalizaciones ultrasónicas proporcionar un modelo de comportamiento de la función vocal, incluidas las deficiencias que acompañan a los cambios fisiológicos debido a la enfermedad y el envejecimiento. Además, los cambios acústicos en las vocalizaciones ultrasónicas son fáciles de medir y cuantificar. Además, la vocalización ultrasónica puede ser modificado a través de las intervenciones conductuales. Por lo tanto, la vocalización ultrasónica rata un modelo útil para estudiar el impacto de la enfermedad, el envejecimiento y las intervenciones terapéuticas sobre el comportamiento y los mecanismos subyacentes de la neurobiología.
Nuestro método de entrenamiento vocal utiliza un estímulo condicionado (un clic) asociada a un refuerzo positivo (una recompensa de tratar el agua o los alimentos). El clic seguido de la recompensa se utiliza para reforzar las vocalizaciones de complejidad creciente. Definimos las vocalizaciones complejas como las que contienen un "trino" (frecuencia modulada) componente (Figura 5) frente a aquellos que son "planos" y mantener una sola frecuencia (Figura 5). Este componente de frecuencia modulada, se identifica fácilmente por su apariencia sinusoidal. Mientras que el 50-kHz vocalizaciones pueden ser totalmente sinusoidal (Figura 5), es común encontrar más complejo de 50 kHz vocalizaciones que consisten en parte de este componente de frecuencia modulada, así como tampoco grandes saltos de frecuencia o un componente de planos breves. Estas vocalizaciones más complejas pueden tener estancias cortas de menos de 10 ms entre los componentes, pero se consideran una vocalización única. Aunque con mayor detalle sub-clasificación de estas vocalizaciones es posible fuera de línea, 14 se clasifican todas las vocalizaciones de 50 kHz que contiene un componente de frecuencia modulada, tan complejo para reducir la necesidad de una clasificación subjetiva en línea y reducir la variabilidad de refuerzo. En su propio laboratorio, es importante elegir cómo se clasifican los datos y se analizaron según un diseño de estudio apropiado para el propósito del estudio.
Hay muchos factores a considerar cuando se utiliza este protocolo. En primer lugar, a pesar de la homogeneidad genética y la coherencia del procedimiento, las ratas tienen una respuesta variable a la formación. Algunas ratas, naturalmente, vocalizan más que otros, 5 o están motivados por la exposición a una mujer más que por un premio de comida o agua. Una manera de explicar esta variabilidad es examinar el cambio en los parámetros acústicos de las vocalizaciones de referencia ratas individuales para su post-lesión y vocalizaciones después de la formación. Aunque no se trata en este protocolo, también tenemos pruebas de comportamiento para cuantificar el interés en la hembra, como la latencia de montar. Además, dependiendo de la edad y nivel de actividad de una rata individual, una tapa de alambre puede ser necesaria en la jaula de alojamiento durante el entrenamiento para evitar fugas. A pesar de la variabilidad individual, hemos utilizado con éxito este protocolo en una variedad de cepas y las edades a mejorar las vocalizaciones respecto al valor basal cada rata individual.
Las ratas son sensibles a los cambios aparentemente pequeños en el medio ambiente, como los olores, la temperatura, y el personal. Un esfuerzo se debe hacer para evitar olor a productos para el cuidado personal, tales como lociones, productos para el cabello y perfumes. Antes de intentar la formación, la persona debe ser cómodo interactuando con el manejo y las ratas. Por otra parte, las inconsistencias en el personal o el medio ambiente pueden afectar la respuesta de las ratas vocalización.
Porque las ratas son animales nocturnos, que se debe mantener en un ciclo de luz invertida para permitir la formación que tendrán lugar durante la parte oscura de su ciclo, cuando están más activos. Iluminamos nuestra sala de entrenamiento con las luces rojas. Además, si un premio se utiliza el agua durante el entrenamiento, las ratas que tienen un acceso limitado al agua. Nuestras ratas son las aguas restringidas durante 21 horas antes de la sesión de entrenamiento. Tres horas de exposición al agua fue determinada por nuestro Servicio de Atención Institucional para la Comisión para el período de tiempo por lo menos restrictiva que permitió que el agua que es útil como refuerzo en nuestros estudios de comportamiento sin que ello suponga un compromiso sustancial con la sanidad animal o el bienestar. Las ratas se les da el acceso al agua, a veces al azar (10 a 30 minutos) después del entrenamiento y, posteriormente, tienen acceso libre al agua durante tres horas durante la parte oscura de su ciclo de luz. Las ratas deben ser inspeccionados cada día en busca de signos de deshidratación y pesaba cada dos días para asegurarse de que no significativa (superior al 10%) la pérdida de peso. Una restricción de alimentos no es necesario si se usa una golosina como premio. Se usa para tratar a ratas específicos están disponibles comercialmente, pero no hemos encontrado una pequeña pieza de un cereal azucarado que una recompensa efectiva.
Como se mencionó anteriormente, las ratas hembra en celo provocan una respuesta de vocalización más alto de hombres que no son sexualmente hembras receptivas. Al mantener un gran número de mujeres en la colonia, hay una alta probabilidad de que enpor lo menos una hembra en celo será en cualquier día dado. Sin embargo, el estro puede ser inducido farmacológicamente en ratas hembras, por inyección subcutánea de 10 mg de β-estradiol en 0,1 cc de aceite de sésamo estéril 48 horas antes de la formación seguida de 500 mg de progesterona en 0,1 cc de aceite de sésamo estéril 4 horas antes del entrenamiento. Además, las ratas macho que son ingenuos a ratas hembras que tengan experiencia sexual antes de la formación vocal. Esto se logra mediante la colocación de una rata hembra que está mostrando señales de receptividad sexual (dardos, lordosis, moviendo el oído) en jaula del macho hasta los montes masculino y eyaculación. Los varones no pueden montar en las primeras sesiones y la hembra puede ser removido después de que el interés masculino muestra en la mujer por inhalación y / o persiguiendo a la hembra en la jaula. Sexual que experimentan se realiza una vez al día durante dos semanas. Este período de tiempo también proporciona una oportunidad para que las ratas a habituarse a la experimentador (s) y sala de grabación.
Una limitación de este método es la determinación subjetiva del tipo de vocalización. Además, este factor limita la velocidad de recogida de datos, ya que cada llamada debe ser examinado de forma independiente y se clasifican manualmente. Relacionado con esto está la importancia de contar con evaluadores experimentados que han sido sistemáticamente entrenados en la identificación de vocalización. Tanto la fiabilidad intra e inter-calificadores deben ser evaluados dentro de su propio laboratorio.
En resumen, la vocalización ultrasónica en los roedores se utilizan en muchos modelos diferentes para estudiar el comportamiento del cerebro, las relaciones, incluyendo los estados emocionales, recompensa y la adicción y los estados de enfermedad, tales como el autismo. 6,14-16 Este nuevo método es una manera de estudiar la mecanismos que subyacen a la formación dirigida vocal para el tratamiento del déficit de voz en el envejecimiento y la enfermedad de Parkinson. Este método tiene el potencial de ser aplicado a los modelos de otras enfermedades que afectan a la comunicación y la voz.
Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Política de Servicios de Salud Pública en Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio, la guía de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y la Ley de bienestar animal. El protocolo de uso de los animales fue aprobado por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Wisconsin-Madison Escuela de Medicina y Salud Pública.
Acknowledgments
Apoyada por los Institutos Nacionales de Salud (NIDCD, P30-DC010754, T32-DC009401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft BioAcoustics | 40011 | |
| UltraSoundGate 116Hb | Avisoft BioAcoustics | 41161 | |
| Avisoft-RECORDER | Avisoft BioAcoustics | 10201 | |
| Avisoft-SASLab Pro | Avisoft BioAcoustics | 10101 |
References
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