Summary
نحن هنا وصف شاشة overexpression في البلازميد
Abstract
الخميرة في مهدها ، السكيراء البيرة ، هو نموذج النظام قوية لتحديد الآليات الأساسية لكثير من العمليات الخلوية الهامة ، بما فيها تلك التي لها صلة مباشرة الأمراض التي تصيب البشر. لأن من وقته قصير والجيل جيدا اتسم الجينوم ، ميزة كبيرة التجريبية لنظام الخميرة النموذج هو القدرة على أداء شاشات الجينية لتحديد الجينات والمسارات التي تشارك في عملية معينة. على مدى السنوات الثلاثين الماضية قد استخدمت مثل هذه الشاشات الجينية لاستجلاء دورة الخلية ، ومسار إفرازية ، والعديد من الجوانب الأكثر حفظا للغاية من بيولوجيا الخلايا حقيقية النواة 1-5. في السنوات القليلة الماضية ، تم إنشاء العديد من المكتبات genomewide سلالات الخميرة والبلازميدات 6-10. هذه المجموعات تسمح الآن للاستجواب المنهجي للحصول على وظائف الجينات باستخدام والخسارة من وظيفة نهج 11-16. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لاستخدام بروتوكول خميرة التحول عالية الإنتاجية مع الروبوت مناولة السائل لأداء شاشة overexpression البلازميد ، وذلك باستخدام مكتبة المحتشدة من الخميرة البلازميدات 5500. لقد تم استخدام هذه الشاشات لتحديد معدلات السمية الوراثية المرتبطة تراكم تجميع البروتينات البشرية المعرضة للمرض الاعصاب. الأساليب المقدمة هنا هي قابلة للتكيف بسهولة لدراسة الظواهر الخلوية الأخرى ذات الاهتمام.
Protocol
1. الاستعدادات للتحول الخميرة
ويهدف هذا البروتوكول لمدة عشر لوحات 96 - جيدا ولكن يمكن تحجيمها صعودا أو هبوطا وفقا لذلك. لقد وجدنا أن هذا البروتوكول لا تعمل بشكل جيد لوحات 96 - جيدا أكثر من عشرين في جولة من التحول. فإن التحول الداخلي بأكمله (من الخطوة I.3) اتخاذ ما يقرب من ثماني ساعات.
- قسامة 5 - 10μL من الحمض النووي البلازميد (100 نانوغرام / ميكرولتر) من مكتبة الخميرة ORF FLEXGene في كل بئر قاع الجولة - 96 - جيدا لوحة مع معالج RapidPlate Biorobot السائل. وكشف مكان لوحات 96 - جيدا في غطاء مقاعد البدلاء النظيفة الدخان حتى يجف بين عشية وضحاها. لقد تم العثور على كفاءات مماثلة مع التحول CEN والبلازميدات 2μ الخميرة.
- تلقيح 200mL من ببتون الخميرة وسائل الاعلام (YPD) سكر العنب (10G / L خلاصة الخميرة ، ببتون 20G / L ، 20G / L الجلوكوز) مع سلالة الاستعلام في دورق مخروطي 500mL حيرة. يحضن بين عشية وضحاها على 30 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة). إذا لزم الأمر ، يمكن أيضا وسائل الإعلام الانتقائي تستعمل لهذه الثقافات بداية.
- في صباح اليوم التالي ، يخفف من توتر الاستعلام لOD 600 = 0.1 في 2L من YPD. يهز لمدة 4-6 ساعات عند 30 درجة مئوية (200 دورة في الدقيقة) حتى تصل إلى ثقافة OD 600 = 0،8-1،0. لتحقيق النمو الأمثل ، ويكبر ثقافتين 1L منفصلة في قوارير L 2.8 حيرة. إذا لزم الأمر ، يمكن أيضا وسائل الإعلام الانتقائي استخدامها بدلا من YPD.
2. خميرة التحول
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي. ملء أربع أنابيب القابل للتصرف المخروطية 225mL مع الثقافة الخميرة وتدور في 3000rpm (~ 1800 x ج) لمدة 5 دقائق في جهاز الطرد المركزي منضدية (إيبندورف 5810R). تخلصي طاف وكرر حتى يتم حصاد جميع الخلايا.
- غسل الخلايا في 200mL من تعقيمها المقطر O. 2 H Resuspend الخلية بيليه عن طريق هز أو vortexing. الجمع بين الخلايا المخروطية في أنبوب one 225mL. تدور في 3000rpm لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
- يعد حل 0.1MLiOAc/1XTE (0.1M LiOAc ، 10MM تريس ، 1MM EDTA ، ودرجة الحموضة في الماء المقطر 8 تعقيمها). غسل الخلايا في 0.1MLiOAc/1XTE 100ML. تدور في 3000rpm لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
- Resuspend الخلية بيليه في 70mL 0.1M LiOAc/1xTE. هزة و / أو دوامة لضمان معلق تماما بيليه.
- احتضان مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (200 دورة في الدقيقة).
- إضافة إلى β - المركابتويثانول 0.1M. احتضان مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (200 دورة في الدقيقة). ملاحظة : يمكن تجاهل هذه الخطوة إذا باستخدام سلالات الخميرة التي تعتبر حساسة لالمركابتويثانول - β. لقد وجدنا أن هذه الخطوة غير ضرورية لعملية التحول بنجاح ، بيد أن ذلك لا تحسين كفاءة التحويل.
- تغلي 2mL من الحمض النووي sonicated السلمون الحيوانات المنوية (10mg/mL) لمدة 15 دقيقة ، ثم البرد على الجليد.
- إضافة 2mL السلمون المسلوق من الحمض النووي الحيوانات المنوية إلى خليط الخلية. الحذر : قد تترسب على شكل إضافة السلمون الحمض النووي الحيوانات المنوية إلى خليط الخلية. استخدام غيض pipetman و 200 ميكرولتر ، إزالة بعناية أي يعجل أن الأشكال لأن ذلك قد تتداخل مع pipetting المصب.
- 50μL قسامة من خليط الخلية إلى كل بئر من لوحة 96 - جيدا باستخدام Rapidplate BioRobot (يمكن أيضا استخدام متعدد القنوات ماصة). لا يختلطان.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة دون أن تهتز.
- إعداد 200mL 40 ٪ PEG-3350/10 DMSO/0.1M LiOAc ٪ (50 ٪ 160mL PEG - 3350 ، DMSO 20mL ، LiOAc 20mL 1M). يعد حل مباشرة قبل الاستعمال.
- إضافة 125μL من PEG / LioAc / DMSO حل كل بئر. مزيج من قبل الشفط والاستغناء تعليق خلية ثماني مرات مع RapidPlate.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة دون أن تهتز.
- الصدمة الحرارية والخلايا في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة الجافة. لا مكدس لوحات. ملاحظة : لقد وجدنا أن هذه الخطوة الصدمة الحرارية ليست ضرورية لتحقيق التحول الناجح. لسلالات الخميرة معينة (على سبيل المثال ، درجة الحرارة المسوخ الحساسة) ، الصدمة الحرارية هي ضارة. خفضنا سابقا الوقت صدمة الحرارة لمدة دقيقة واحدة وتمكنت من تحويل بنجاح سلالة الخميرة بايواء طفرة الحرارة ypt1 الحساسة باستخدام هذا البروتوكول.
- لوحات تدور في 2500rpm (~ 1100 x ج) لمدة 5 دقائق ، وذلك باستخدام محولات أجهزة الطرد المركزي لاستيعاب 96 - جيدا لوحات. إزالة حل عن طريق الربط على عكس لوحات دلو النفايات. وصمة عار على طبق مقلوب منشفة ورقية لإزالة السائل المتبقية (الخلايا ستبقى على الجزء السفلي من الآبار).
- شطف الخلايا من خلال إضافة الحد الأدنى من وسائل الإعلام 200μL (مثل SD / - أورا) إلى كل جيدا مع RapidPlate.
- لوحات تدور في 2500rpm لمدة 5 دقائق وإزالة طاف بواسطة دلو النفايات على عكس والنشاف على مناشف ورقية.
- إضافة 200μL الحد الأدنى من وسائل الإعلام (مثل SD / - أورا) إلى كل جيدا مع RapidPlate.
- في احتضان 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام دون أن تهتز. 2 بعد يوم ، وينبغي أن مستعمرات صغيرة من الخلايا تبدأ في النموذج في أسفل كل حولت بنجاح أيضا.
3. اكتشاف مقايسة
- الاستغناء عن وسائل الإعلام 200μL رافينوز أدنى القائمة (مثل SRaf / - أورا) في كل بئرجديد مسطحة القاع لوحة 96 - جيدا.
- مزيج من كل جانب لوحة التحول بواسطة الشفط والاستغناء تعليق خلية ثماني مرات مع Rapidplate.
- تطعيم لوحات SRaf 5μL مع مزيج من خلية لوحة التحول.
- في احتضان 30 درجة مئوية ليوم واحد. وينبغي أن يكون حاضرا مستعمرات صغيرة في الجزء السفلي من كل بئر بعد يوم واحد.
- المستعمرات بقعة على أورا / - SD وSGal / - أورا لوحات في غطاء محرك السيارة. تعقيم 96 - الترباس المكرر (عبة Frogger) بواسطة المشتعلة. مزيج مع المستعمرات عبة Frogger قبل اكتشاف وسائل الاعلام على لوحات انتقائية. بعد اكتشاف ، والسماح لوحات ليجف في غطاء محرك السيارة لمدة 5-10 دقائق.
- في احتضان 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
لوحات فوتوغرافية مع كاميرا رقمية ، وقارن بين بصريا نمو المستعمرات في SGal / - أورا لوحات لإيجاد مستعمرات في الاستعلام الذي تم تحسين السلالة سمية (أبطأ نمو / المستعمرات أقل كثافة) أو قمعها (أسرع نمو / المستعمرات أكثر كثافة).
4. ممثل النتائج :
الشكل 1. الشاشة الخميرة overexpression البلازميد لتحديد المكثفات ومحسنات من TDP 43 السمية. TDP - 43 هو بروتين الإنسان التي تورطت في التسبب في التصلب الوحشي الضموري (داء لو جيهريج). مجاميع من هيولي TDP - 43 تتراكم في الدماغ والخلايا العصبية في النخاع الشوكي لمرضى ALS 17. معربا عن TDP - 43 في نتائج التجميع في خلايا الخميرة والسمسة 18. وقد استخدمنا هذا النظام النموذجي لتحديد آليات سمية 19،20 TDP - 43. أظهرت أمثلة repesentative لوحات من الخميرة لدينا TDP - 43 معدل سمية الشاشة. هذه اللوحات تعرض المستعمرات مع البلازميد متكاملة TDP - 43 - الغالاكتوز محرض وحولت أيضا مع البلازميدات من التعبير FLEXGene مكتبة ORF. لوحة على اليسار يحتوي على الجلوكوز ، والتي تقمع التعبير عن TDP - 43 أو البلازميدات FLEXGene. لوحة على اليمين يحتوي على سكر اللبن ، والذي يحرض على التعبير عن TDP - 43 وORFs في البلازميدات FLEXGene. رأس السهم الأخضر يشير إلى وجود مستعمرة تحولت مع البلازميد الكابت للسمية TDP - 43. رأس السهم الأحمر يشير إلى وجود مستعمرة تحولت مع البلازميد يعزز سمية TDP - 43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نطرح على بروتوكول لتنفيذ عالية الإنتاجية الشاشة overexpression البلازميد في الخميرة. هذا النهج يسمح للفحص السريع وغير منحازة عن المعدلات الوراثية للكثير من الظواهر الخلوية المختلفة. باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحث الشاشة جزء كبير من الجينوم الخميرة في غضون أسابيع. هذا النهج غير متحيزة كما يسمح لتحديد المعدلات ، والتي ربما لم يكن متوقعا على أساس النتائج السابقة. وقد استخدمنا هذا الأسلوب في تحديد معدلات السمية المرتبطة تجميع البروتينات البشرية مرض الاعصاب 19،21-23. ومع ذلك ، نظرا لقدرته على التكيف هذا البروتوكول لدراسة العمليات الخلوية الأخرى ، فإن هذا البروتوكول تكون مفيدة للباحثين لمعالجة طائفة واسعة من المسائل البيولوجية الهامة. على سبيل المثال ، لقد تم العثور على هذا النهج أيضا فحص مفيدة لتحديد الجينات والمسارات التي ينطوي عليها التكيف مع الضغوط البيئية ، بما فيها المعادن الثقيلة والاكسدة. هنا ركزنا على مكتبة واحدة البلازميد ، مكتبة FLEXGene الخميرة 9. ومع ذلك ، هناك العديد من المكتبات الخميرة البلازميد الأخرى المتاحة ، التي يمكن أن تستخدم أيضا لهذه الشاشات 6،8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من مركز للبحوث باكارد ALS في جامعة جونز هوبكنز (المدير العام المساعد) ، وجائزة من مدير المعاهد الوطنية للصحة ومبتكر جديد 1DP2OD004417 - 01 (المدير العام المساعد) ، NIH R01 NS065317 (المدير العام المساعد) ، وجائزة الباحث ألن ريتا المؤسسة. مساعد المدير العام لمركز بيو باحثة في العلوم الطبية الحيوية ، وبدعم من صناديق بيو الخيرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease? Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
