Summary
यहाँ हम में एक प्लाज्मिड overexpression स्क्रीन का वर्णन
Abstract
नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae, मानव रोग के लिए प्रत्यक्ष प्रासंगिकता के साथ उन सहित कई महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के बुनियादी तंत्र को परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है. अपनी छोटी पीढ़ी समय और अच्छी तरह से विशेषता जीनोम की वजह से, खमीर मॉडल प्रणाली के एक प्रमुख प्रयोगात्मक लाभ के लिए आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए जीन और मार्ग है कि किसी भी प्रक्रिया में शामिल हैं की पहचान करने की क्षमता है. पिछले तीस साल में इस तरह के आनुवंशिक स्क्रीन सेल चक्र, स्रावी मार्ग, और यूकेरियोटिक सेल 1-5 जीव विज्ञान के कई अधिक उच्च संरक्षित पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. पिछले कुछ वर्षों में, खमीर उपभेदों और plasmids के कई genomewide पुस्तकालयों 6-10 उत्पन्न किया गया है. इन संग्रहों में अब जीन समारोह के व्यवस्थित लाभ और हानि के समारोह 11-16 दृष्टिकोण का उपयोग कर पूछताछ के लिए अनुमति देते हैं . यहाँ हम एक तरल से निपटने रोबोट एक प्लाज्मिड overexpression स्क्रीन प्रदर्शन के साथ उच्च throughput एक खमीर परिवर्तन प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, 5500 खमीर plasmids के एक arrayed पुस्तकालय का उपयोग कर. हम इन स्क्रीन का उपयोग किया गया एकत्रीकरण प्रवण मानव neurodegenerative रोग प्रोटीन के संचय के साथ जुड़े विषाक्तता के आनुवंशिक संशोधक की पहचान. यहाँ प्रस्तुत तरीकों को आसानी से ब्याज की अन्य सेलुलर phenotypes के अध्ययन के लिए अनुकूलनीय रहे हैं.
Protocol
1. खमीर परिवर्तन के लिए तैयारी
इस प्रोटोकॉल दस 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है है तदनुसार. हमने पाया है कि इस प्रोटोकॉल अच्छी तरह से बीस से अधिक परिवर्तन के दौर प्रति 96 अच्छी तरह प्लेटें के लिए काम नहीं करता है है. संपूर्ण परिवर्तन प्रक्रिया (I.3 कदम से) लगभग आठ घंटे लगेंगे.
- खमीर FLEXGene ओआरएफ पुस्तकालय से प्लाज्मिड (100 / एनजी μl) एक दौर नीचे के प्रत्येक Biorobot RapidPlate तरल हैंडलर के साथ 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से डीएनए के 5 10μL विभाज्य. स्वच्छ बेंच धूआं सूखी रातोंरात हुड प्लेस में 96 अच्छी तरह प्लेटें खुला. हम CEN और 2μ खमीर plasmids के साथ इसी तरह के परिवर्तन क्षमता पाया है.
- एक 500ml चकित Erlenmeyer फ्लास्क में क्वेरी तनाव के साथ खमीर peptone dextrose (YPD) मीडिया (10g / एल खमीर निकालने, 20g / एल peptone, 20g / एल ग्लूकोज) के 200ml टीका लगाना. मिलाते हुए (200 rpm) के साथ 30 ° C पर रातोंरात सेते हैं. यदि आवश्यक, चयनात्मक मीडिया भी इन स्टार्टर संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- निम्नलिखित सुबह, YPD के 2L = 0.1 600 आयुध डिपो क्वेरी तनाव पतला. 30 ° (200 आरपीएम) सी जब तक संस्कृति 600 आयुध डिपो 0.8-1.0 = पहुँचता है पर 4-6 घंटे के लिए हिलाओ. इष्टतम विकास के लिए, दो अलग 2.8 एल चकित बोतल में 1L संस्कृतियों बढ़ने. यदि आवश्यक, चयनात्मक मीडिया भी YPD के बजाय कर सकते हैं इस्तेमाल किया जा.
2. खमीर परिवर्तन
- Centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं. खमीर संस्कृति और स्पिन के साथ चार डिस्पोजेबल 225mL शंक्वाकार ट्यूबों tabletop अपकेंद्रित्र में 5 मिनट (5810R Eppendorf) के लिए 3000rpm (~ 1800 XG) पर भरें. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और दोहराएँ जब तक सभी कक्षों harvested रहे हैं.
- Autoclaved आसुत एच ओ 2 के 200ml में कोशिकाओं को धो Resuspend सेल गोली मिलाते या vortexing द्वारा. एक 225mL शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं का मिश्रण. 3000rpm पर 5 मिनट के लिए स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- 0.1MLiOAc/1XTE समाधान (0.1M LiOAc, 10mm Tris, 1mm EDTA, autoclaved आसुत जल में 8 पीएच) तैयार है. 100ml 0.1MLiOAc/1XTE में कोशिकाओं को धो लें. 3000rpm पर 5 मिनट के लिए स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- 70mL 0.1M LiOAc/1xTE में Resuspend सेल गोली. शेक और / या भंवर सुनिश्चित करने के लिए गोली पूरी तरह resuspended है.
- 30 मिनट (200 आरपीएम) के लिए 30 ° C पर झटकों के साथ सेते हैं.
- 0.1M β-mercaptoethanol जोड़ें. 30 मिनट (200 आरपीएम) के लिए 30 ° C पर झटकों के साथ सेते हैं. नोट: यह कदम खमीर उपभेदों कि β-mercaptoethanol करने के लिए संवेदनशील हैं का उपयोग अगर छोड़े गए किया जा सकता है है. हमने पाया है कि इस कदम सफल परिवर्तन के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन यह परिवर्तन दक्षता में सुधार करता है.
- Sonicated सामन शुक्राणु डीएनए (10mg/mL) के 2ml 15 मिनट के लिए उबाल लें, और फिर बर्फ पर ठंड.
- सेल मिश्रण करने के लिए उबला हुआ सामन शुक्राणु डीएनए के 2ml जोड़ें. सावधानी: एक वेग सामन शुक्राणु सेल मिश्रण करने के लिए डीएनए के अलावा पर फार्म का हो सकता है. एक pipetman और 200 μl टिप का उपयोग करना, ध्यान से किसी भी वेग है कि रूपों है क्योंकि इस बहाव pipetting के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हटा दें.
- सेल मिश्रण के 96 अच्छी तरह BioRobot Rapidplate का उपयोग थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए विभाज्य 50μL (भी बहु चैनल पिपेट का उपयोग कर सकते हैं). मिश्रण मत करो.
- मिलाते हुए बिना 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 200ml 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160mL 50% खूंटी 3350, 20ml DMSO, 20ml 1M LiOAc) तैयार करें. उपयोग करने से पहले तुरंत समाधान तैयार करें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए खूंटी / / LioAc DMSO के समाधान के 125μL जोड़ें. Aspirating और वितरण RapidPlate सेल निलंबन के साथ आठ बार मिक्स.
- मिलाते हुए बिना 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- गर्मी झटका 42 कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस एक सूखी इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए. प्लेटें ढेर मत करो. नोट: हमने पाया है कि इस गर्मी झटका कदम सफल परिवर्तन के लिए आवश्यक नहीं है. कुछ खमीर उपभेदों के लिए (उदाहरण के लिए, तापमान संवेदनशील म्यूटेंट), गर्मी झटका हानिकारक है. हम पहले एक मिनट के लिए गर्मी झटका समय कम है और सफलतापूर्वक एक खमीर ypt1 तापमान संवेदनशील इस प्रोटोकॉल का उपयोग उत्परिवर्तन शरण तनाव को बदलने में सक्षम है.
- 2500rpm (~ 1100 XG) में 5 मिनट के लिए प्लेटें, स्पिन अपकेंद्रित्र adapters का उपयोग करने के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें समायोजित. अपशिष्ट बाल्टी पर inverting प्लेटों द्वारा खूंटी समाधान निकालें. कागज तौलिया पर औंधा थाली ब्लाट अवशिष्ट तरल निकालने (कोशिकाओं कुओं की तल पर रहेगा).
- कम से कम मीडिया के 200μL जोड़ने RapidPlate (जैसे ura / एसडी) के साथ एक अच्छी तरह से करने के लिए कोशिकाओं कुल्ला.
- 2500rpm पर प्लेटें 5 मिनट के लिए और स्पिन inverting से अधिक बर्बाद बाल्टी और कागज तौलिए पर सोख्ता से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- RapidPlate के साथ एक अच्छी तरह से कम से कम मीडिया के 200μL (जैसे एसडी ura /) जोड़ें.
- मिलाते हुए बिना 30 ° C पर 2 दिनों के लिए सेते हैं. 2 दिनों के बाद, कोशिकाओं के छोटे कालोनियों को सफलतापूर्वक अच्छी तरह से बदल प्रत्येक के तल पर फार्म शुरू करना चाहिए.
3. परख खोलना
- Raffinose आधारित न्यूनतम मीडिया (जैसे SRaf ura - /) में से प्रत्येक के कुएँ में 200μL बांटनाएक नए फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली.
- Aspirating और वितरण Rapidplate सेल निलंबन के साथ आठ बार परिवर्तन की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह मिक्स कर लें.
- सेल मिश्रण के परिवर्तन थाली से 5μL के साथ SRaf प्लेटों का टीका लगाना.
- एक दिन के लिए 30 ° C पर सेते हैं. लघु कालोनियों प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे मौजूद एक दिन बाद किया जाना चाहिए.
- एसडी / ura और SGal हुड में / ura प्लेटों पर स्पॉट कालोनियों. ज्वलंत द्वारा 96 बोल्ट replicator (Frogger) जीवाणुरहित. Frogger के साथ चयनात्मक मीडिया प्लेटों पर खोलना से पहले कालोनियों का मिक्स. खोलना के बाद, प्लेटें हुड में 5-10 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति.
- 30 ° C पर 2-3 दिनों के लिए सेते हैं.
डिजिटल कैमरा के साथ तस्वीर प्लेटें, और नेत्रहीन SGal ura - / प्लेटों पर कालोनियों के विकास की तुलना कालोनियों में जो क्वेरी तनाव विषाक्तता बढ़ाया है (धीमी वृद्धि / कम घने कालोनियों) या दबा (तेजी से विकास / अधिक घने कालोनियों) को खोजने के.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा खमीर 1. प्लाज्मिड overexpression स्क्रीन तेदेपा 43 विषाक्तता के दमन और enhancers की पहचान . 43 तेदेपा एक मानव प्रोटीन है कि amyotrophic पार्श्व काठिन्य (Lou Gehrig के रोग) के रोगजनन में फंसा दिया गया है. तेदेपा-43 cytoplasmic समुच्चय ए एल एस 17 रोगियों के मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स में जमा है . खमीर कोशिकाओं परिणामों में एकत्रीकरण और cytotoxicity 18 में तेदेपा-43 जताते. हम इस मॉडल प्रणाली का इस्तेमाल किया है तेदेपा -43 19,20 विषाक्तता के तंत्र को परिभाषित . दिखाया गया है हमारे खमीर तेदेपा-43 विषाक्तता आपरिवर्तक स्क्रीन से प्लेटों के repesentative उदाहरण हैं. इन प्लेटों के साथ एक एकीकृत galactose-inducible तेदेपा-43 प्लाज्मिड और FLEXGene ओआरएफ अभिव्यक्ति पुस्तकालय से plasmids के साथ भी बदल कालोनियों प्रदर्शित करते हैं. बाईं तरफ थाली ग्लूकोज, जो तेदेपा-43 या FLEXGene plasmids की अभिव्यक्ति represses शामिल हैं. दाईं तरफ थाली galactose, जो तेदेपा-43 की अभिव्यक्ति और FLEXGene plasmids में ORFs लाती हैं. हरी arrowhead एक प्लाज्मिड कि तेदेपा-43 की विषाक्तता को दबा के साथ बदल कॉलोनी इंगित करता है. लाल arrowhead एक प्लाज्मिड कि तेदेपा-43 की विषाक्तता को बढ़ाता है के साथ बदल कॉलोनी इंगित करता है.
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Discussion
यहाँ हम एक प्रोटोकॉल करने के लिए खमीर में एक उच्च throughput प्लाज्मिड overexpression स्क्रीन प्रदर्शन मौजूद है. इस दृष्टिकोण तेजी से और निष्पक्ष जांच के लिए कई अलग अलग सेलुलर phenotypes की आनुवंशिक संशोधक के लिए अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, एक शोधकर्ता हफ्तों के एक मामले में खमीर जीनोम का एक महत्वपूर्ण भाग स्क्रीन कर सकते हैं. यह निष्पक्ष दृष्टिकोण भी संशोधक की पहचान, जो पिछले निष्कर्षों के आधार पर भविष्यवाणी नहीं हो सकता है के लिए अनुमति देता है. हम इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है मानव neurodegenerative रोग प्रोटीन 19,21-23 के एकत्रीकरण के साथ जुड़े विषाक्तता के संशोधक की पहचान. हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन की अनुकूलनशीलता कारण, इस प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण जैविक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा. उदाहरण के लिए, हम भी इस स्क्रीनिंग दृष्टिकोण भारी धातुओं और oxidative तनाव सहित पर्यावरण तनाव, के लिए अनुकूलन में शामिल जीन और रास्ते की पहचान के लिए उपयोगी पाया है. यहाँ हम एक प्लाज्मिड पुस्तकालय, खमीर FLEXGene 9 पुस्तकालय पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, वहाँ कई अन्य खमीर प्लाज्मिड उपलब्ध पुस्तकालयों, जो भी इन 6,8 स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम जॉन्स हॉपकिन्स पर पैकार्ड ए एल एस अनुसंधान के लिए केंद्र (एडीजी), एक NIH निदेशक का नया अन्वेषक पुरस्कार 1DP2OD004417 01 - (एडीजी), एनआईएच R01 NS065317 (एडीजी), रीता एलन फाउंडेशन विद्वान पुरस्कार से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. एडीजी बायोमेडिकल साइंसेज में एक बेंच विद्वान, बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
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