Summary
Qui si descrive uno schermo plasmide sovraespressione in
Abstract
Il lievito, Saccharomyces cerevisiae, è un sistema potente modello per la definizione di meccanismi fondamentali di molti importanti processi cellulari, tra cui quelle con rilevanza diretta per la malattia umana. A causa della sua breve tempo di generazione e ben caratterizzati genoma, uno dei principali vantaggi sperimentale del sistema modello lievito è la capacità di eseguire schermi genetico per identificare i geni e le vie che sono coinvolti in un dato processo. Nel corso degli ultimi 30 anni tale schermi genetici sono stati utilizzati per spiegare il ciclo cellulare, via secretoria, e molti altri aspetti altamente conservato della biologia delle cellule eucariotiche 1-5. Negli ultimi anni, diverse biblioteche genoma dei ceppi di lievito e plasmidi sono stati generati 6-10. Queste raccolte permettono ora per l'interrogatorio sistematico della funzione del gene utilizzando guadagno e la perdita di funzione approcci 11-16. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un high-throughput protocollo di lievito di trasformazione con un robot di gestione dei liquidi per eseguire uno schermo plasmide iperespressione, utilizzando una libreria di 5.500 schierati plasmidi lievito. Abbiamo utilizzato questi schermi per identificare i modificatori genetici di tossicità associata con l'accumulo di proteine umane di aggregazione a rischio di malattie neurodegenerative. I metodi presentati qui sono facilmente adattabili allo studio di altri fenotipi cellulari di interesse.
Protocol
1. I preparativi per la trasformazione del lievito
Questo protocollo è progettato per una decina di piastre a 96 pozzetti, ma può essere scalato verso l'alto o verso il basso di conseguenza. Abbiamo scoperto che questo protocollo non funziona bene per più di venti piastre a 96 pozzetti per ogni turno di trasformazione. La procedura di trasformazione intera (dal punto I.3) dura circa otto ore.
- Aliquota 5-10μL di DNA plasmidico (100 ng / mL) dalla libreria lievito FLEXGene ORF in ciascun pozzetto di un fondo rotondo a 96 pozzetti con il gestore RapidPlate Biorobot liquido. Luogo scoperto piastre a 96 pozzetti in cappa aspirante da banco pulito durante la notte ad asciugare. Abbiamo trovato efficienze trasformazione simile con il CEN e plasmidi di lievito 2μ.
- Inoculare lievito 200 ml di peptone destrosio (YPD) media (10 g / l estratto di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di glucosio) con ceppo query in un pallone di Erlenmeyer 500mL sconcertato. Incubare una notte a 30 ° C con agitazione (200 giri). Se necessario, terreni selettivi possono essere utilizzati anche per queste colture starter.
- La mattina seguente, diluire lo sforzo query per OD 600 = 0.1 in 2L di YPD. Agitare per 4-6 ore a 30 ° C (200 rpm) fino a quando la cultura arriva OD 600 = 0,8-1,0. Per una crescita ottimale, crescono due culture 1L in separato 2,8 fiaschi L sconcertato. Se necessario, terreni selettivi può anche essere usato al posto di YPD.
2. Lievito di trasformazione
- Celle di raccolta per centrifugazione. Riempite quattro tubi monouso 225ml conica con la cultura lievito e far girare a 3000rpm (~ 1800 xg) per 5 minuti in centrifuga da tavolo (Eppendorf 5810R). Eliminare il surnatante e ripetere fino a quando tutte le cellule vengono raccolte.
- Lavare le cellule in 200 ml di distillato in autoclave H 2 O. Risospendere il pellet cellulare agitazione o vortex. Combina le cellule in una provetta conica 225ml. Spin a 3000rpm per 5 minuti. Rimuovere il surnatante.
- Preparare la soluzione 0.1MLiOAc/1XTE (0,1 M LiOAc, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 in autoclave acqua distillata). Lavare le cellule in 0.1MLiOAc/1XTE 100 ml. Spin a 3000rpm per 5 minuti. Rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 70 ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Scuotere e / o vortice di assicurare pellet è completamente risospeso.
- Incubare con agitazione a 30 ° C per 30 minuti (200 giri).
- Aggiungi β-mercaptoetanolo per 0,1 M. Incubare con agitazione a 30 ° C per 30 minuti (200 giri). Nota: questo passaggio può essere omesso se si utilizza ceppi di lievito che sono sensibili alle β-mercaptoetanolo. Abbiamo scoperto che questo passaggio non è essenziale per la trasformazione di successo, ma lo fa migliorare l'efficienza di trasformazione.
- Fate bollire 2 ml di DNA sonicato sperma di salmone (10 mg) per 15 minuti, raffreddare e poi su ghiaccio.
- Aggiungere 2 ml di DNA dello sperma di salmone bollito alla miscela di cellule. Attenzione: può formare un precipitato dopo l'aggiunta del DNA dello sperma di salmone alla miscela di cellule. Utilizzando un Pipetman e 200 microlitri punta, rimuovere con attenzione l'eventuale precipitato che si forma, perché questo potrebbe interferire con pipettaggio a valle.
- 50μL aliquota di miscela di cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti utilizzando il Rapidplate BioRobot (può anche usare pipetta multicanale). Non mescolare.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitare.
- Preparare 200 ml di 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml del 50% PEG-3350, DMSO 20 mL, 20 mL LiOAc 1M). Preparare la soluzione immediatamente prima dell'uso.
- Aggiungere 125μL di PEG / LioAc / DMSO soluzione a ciascun pozzetto. Mix di aspirare e dispensare sospensione cellulare otto volte con RapidPlate.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti senza agitare.
- Scossa di calore le cellule a 42 ° C per 15 minuti in un incubatore a secco. Non impilare piatti. Nota: Abbiamo trovato che questo passo shock termico non è essenziale per la trasformazione di successo. Per alcuni ceppi di lievito (per esempio, i mutanti sensibili alla temperatura), shock termico è deleteria. Abbiamo già ridotto il tempo shock termico a un minuto e sono stati in grado di trasformare con successo un ceppo di lievito portatori di una mutazione sensibile ypt1 temperatura con questo protocollo.
- Spin piastre a 2500rpm (ca. 1100 xg) per 5 minuti, utilizzando adattatori centrifuga per accogliere piastre da 96 pozzetti. Rimuovere la soluzione PEG da piastre invertendo oltre secchio dei rifiuti. Blot piastra capovolta su carta assorbente per eliminare il liquido residuo (cellule resterà sul fondo dei pozzi).
- Lavare le cellule con l'aggiunta di 200μL di terreno minimo (ad esempio, SD /-Ura) in ciascun pozzetto con RapidPlate.
- Spin piastre a 2500rpm per 5 minuti e rimuovere sopranatante invertendo secchio dei rifiuti più e assorbente su carta assorbente.
- Aggiungere 200μL di terreno minimo (ad esempio, SD /-Ura) in ciascun pozzetto con RapidPlate.
- Incubare a 30 ° C per 2 giorni senza agitare. Dopo 2 giorni, piccole colonie di cellule dovrebbero iniziare a modulo in fondo di ogni successo trasformato bene.
3. Spotting test
- Dispensare 200μL di raffinosio mezzi di comunicazione basati minimo (ad esempio SRaf /-Ura) in ciascun pozzetto diun nuovo fondo piatto piastra da 96 pozzetti.
- Mescolare ciascun pozzetto della piastra di trasformazione da aspirare e dispensare sospensione cellulare otto volte con Rapidplate.
- Inoculare le piastre con SRaf 5μL di miscela di cellule dalla piastra di trasformazione.
- Incubare a 30 ° C per un giorno. Piccole colonie dovrebbero essere presenti nella parte inferiore di ogni bene dopo un giorno.
- Colonie Spot su SD /-Ura e SGal /-Ura piastre in cappuccio. Sterilizzare 96-bullone replicatore (Frogger) mediante esposizione alla fiamma. Mescolare colonie con Frogger prima spotting su piastre selettive dei media. Dopo spotting, permettono piastre ad asciugare cappuccio per 5-10 minuti.
- Incubare a 30 ° C per 2-3 giorni.
Piastre di fotografia con fotocamera digitale, e confrontare visivamente la crescita di colonie su SGal /-Ura piastre di trovare colonie in cui tossicità ceppo query è migliorato (una crescita più lenta / colonie meno densa) o soppressa (la crescita più veloce / più dense colonie).
4. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Sovraespressione schermo lievito plasmide per identificare soppressori ed esaltatori di TDP-43 tossicità. TDP-43 è una proteina umana che è stato implicato nella patogenesi della sclerosi laterale amiotrofica (malattia di Lou Gehrig). Aggregati citoplasmatici di TDP-43 si accumulano nel cervello e neuroni del midollo spinale di pazienti affetti da SLA 17. Esprimendo TDP-43 nei risultati lievito cellule aggregazione e citotossicità 18. Abbiamo utilizzato questo sistema modello per definire i meccanismi di TDP-43 tossicità 19,20. Presenti sono degli esempi rappresentativo di piatti dal nostro lievito TDP-43 schermo modificatore di tossicità. Queste lastre visualizzare colonie con un sistema integrato di galattosio-inducibile TDP-43 plasmide e anche trasformato con i plasmidi della libreria FLEXGene espressione ORF. La piastra a sinistra contiene glucosio, che reprime l'espressione di TDP-43 o il plasmidi FLEXGene. La piastra di destra contiene galattosio, che induce l'espressione di TDP-43 e la ORF in plasmidi FLEXGene. La freccia verde indica una colonia trasformato con un plasmide che sopprime la tossicità di TDP-43. La freccia rossa indica una colonia trasformato con un plasmide che esalta la tossicità di TDP-43.
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Discussion
Qui vi presentiamo un protocollo per eseguire un elevato throughput schermo plasmide sovraespressione nel lievito. Questo approccio permette di screening rapido e imparziale per modificatori genetici di molti diversi fenotipi cellulari. Usando questo approccio, un ricercatore può schermo una porzione significativa del genoma del lievito in una questione di settimane. Questo approccio imparziale consente inoltre l'identificazione di modifica, che non possono essere previste in base ai risultati precedenti. Abbiamo usato questo metodo per identificare i modificatori di tossicità associata con l'aggregazione di proteine umane malattia neurodegenerativa 19,21-23. Tuttavia, a causa l'adattabilità di questo protocollo per lo studio di altri processi cellulari, questo protocollo sarà utile per i ricercatori affrontare una vasta gamma di importanti questioni biologiche. Per esempio, abbiamo trovato anche questo approccio di screening utile per identificare geni e meccanismi coinvolti nella adattamento a stress ambientali, compresi i metalli pesanti e lo stress ossidativo. Qui ci siamo concentrati su un plasmide biblioteca, la biblioteca lievito FLEXGene 9. Tuttavia, ci sono parecchie librerie di lievito altri plasmide disponibili, che potrebbero essere utilizzati anche per questi schermi 6,8.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro per la SLA Packard ricerca presso la Johns Hopkins (ADG), Premio New Innovator un direttore NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), Rita Allen Foundation Scholar Award. ADP è uno studioso Pew nel Scienze Biomediche, sostenuto dal Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
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