Summary
ここではでプラスミド過剰発現の画面を説明
Abstract
出芽酵母、 サッカロマイセスセレビシエは 、ヒトの疾患への直接的な関連性を有するものを含む多くの重要な細胞プロセス、の基本的なメカニズムを定義するための強力なモデルシステムです。で、短い世代時間と十分に特徴付けゲノムから、酵母のモデルシステムの主要experimental利点は、特定のプロセスに関与する遺伝子と経路を同定する遺伝子スクリーニングを実行する機能です。 30年間にわたってこのような遺伝子スクリーニングは、細胞周期、分泌経路、および真核細胞生物学1-5の多くの高度に保存された側面を解明するために使用されている。ここ数年では、酵母菌株とプラスミドのいくつかのゲノムワイドライブラリは6-10生成されている。これらのコレクションは、現在の利得と機能喪失型のアプローチ11-16を使用して遺伝子機能の系統的な尋問を可能にする。ここでは、5500酵母プラスミドのアレイライブラリを使用して、プラスミド過剰発現の画面を実行するために液体ハンドリングロボットによるハイスループット酵母の形質転換プロトコルを使用するための詳細なプロトコルを提供しています。我々は、凝集が発生しやすい人間の神経変性疾患のタンパク質の蓄積に関連付けられている毒性の遺伝的修飾を識別するために、これらの画面を使用している。ここで紹介する手法は、関心のある他の細胞の表現型の研究に迅速に適用可能であり。
Protocol
1。酵母の形質転換のための準備
このプロトコルは、10、96ウェルプレート用に設計されていますが、それに応じて上または下に拡張することができます。我々は、このプロトコルは、変換のラウンドあたり20以上の96ウェルプレート用にうまく動作しないことがわかりました。全体の変換手順は（ステップI.3から）約8時間かかります。
- BiorobotのRapidPlate液体ハンドラ付き丸底96ウェルプレートの各ウェルに酵母FLEXGene ORFのライブラリーからのアリコットプラスミドDNAの5 -10μL（100 ng /μLの）。場所は乾燥して一晩クリーンベンチドラフト内で96ウェルプレートを発見。我々は、CENと2μ酵母プラスミドと同様の形質転換効率を発見した。
- 500mLにバッフル付き三角フラスコ内のクエリ株と酵母ペプトンデキストロース（YPD）メディア（10グラム/ L酵母エキス、20グラム/ Lペプトン、20グラム/ Lグルコース）の200mLのを接種する。 （200rpm）し振とうしながら30℃で一晩インキュベートする。必要な場合、選択培地はまた、これらのスターター培養に使用することができます。
- 次の朝は、YPDの2LでOD 600 = 0.1をクエリ菌株を希釈する。 30 ° C（200回転）の文化がOD 600 = 0.8から1.0に達するまでに4〜6時間振とうする。最適な成長のために、独立した2.8 Lバッフル付きフラスコに2つの1Lの文化で育ったの。必要に応じて、選択培地は、YPDの代わりに使用できます。
2。酵母の変換
- 遠心分離により細胞を回収。卓上遠心機で5分間、3000rpmの（〜1800 × g）で（エッペンドルフ5810R）で酵母培養液とスピンを持つ4つの使い捨ての225mLコニカルチューブを埋める。上清を捨て、すべてのセルが収穫されるまで繰り返す。
- オートクレーブした蒸留H 2 Oの200mLので細胞を洗浄振ったり、ボルテックスして細胞ペレットを再懸濁します。 one 225mLコニカルチューブに細胞を組み合わせる。 5分間3000rpmの時にスピン。上清を取り除く。
- 0.1MLiOAc/1XTE溶液（0.1M LiOAc、10mMのトリス、1mMのEDTA、オートクレーブ蒸留水のpH 8）を準備する。 100mLの0.1MLiOAc/1XTEで細胞を洗浄。 5分間3000rpmの時にスピン。上清を取り除く。
- 70mL 0.1M LiOAc/1xTEで再懸細胞ペレット。ペレットが完全に再懸されていることを確認すると/またはボルテックス振る。
- 30分（200rpm）し、30℃で振盪しながらインキュベートする。
- 0.1Mにβ-メルカプトエタノールを追加。 30分（200rpm）し、30℃で振盪しながらインキュベートする。注：β-メルカプトエタノールに敏感な酵母株を使用している場合、このステップは省略することができます。我々は、このステップが成功した変換のために不可欠ではないことを発見した、しかしそれは、形質転換効率を向上させます。
- 15分間超音波処理したサケ精子DNA（10mg/mL）の2mLのを沸かし、次に氷上で冷やします。
- 細胞混合物にゆでサケ精子DNAの2mLのを追加。注意：沈殿物は、細胞の混合物にサケ精子DNAの添加により形成することがあります。 pipetmanと200μlの先端を使用して、慎重にこれは下流のピペッティングを妨害する可能性があるため、フォームの沈殿物を取り除く。
- BioRobotのRapidplateを使用して96ウェルプレートの各ウェルに細胞混合物のアリコート50μLは、（また、マルチチャンネルピペットを使用することができます）。混ぜて使用しないでください。
- 振盪せずに30分間室温でインキュベートする。
- 40パーセントPEG-3350/10％DMSO/0.1M LiOAc（50％PEG - 3350、20mlのDMSO、20mlの1M LiOAcの160mL）の200mLの準備。使用直前に溶液を調製します。
- 各ウェルにPEG / LioAc / DMSO溶液の125μLを追加。 RapidPlateで8回吸引し、細胞懸濁液を分注して混ぜる。
- 振盪せずに30分間室温でインキュベートする。
- 熱ショックで42セル℃で乾燥したインキュベーターで15分間。プレートを積み重ねないでください。注：我々は、この熱ショックのステップが成功した変換のために不可欠ではないことを発見した。特定の酵母菌株（例えば、温度感受性変異株）については、熱ショックは有害です。我々は以前に1分に熱ショック時間を短縮していると正常にこのプロトコルを使用してypt1温度感受性突然変異を保有する酵母株を形質転換することができた。
- 96ウェルプレートに対応するために遠心アダプターを使用して、5分間2500rpm（〜1100 × g）でプレートを回転させる。廃棄物のバケット上に反転板でのPEG溶液を除去。残液を除去するためにペーパータオル上で逆さプレートをブロット（細胞がウェルの底に残ります）。
- RapidPlateで各ウェルに（例えばSD / - 裏）最少培地の200μLを加えることによって細胞をすすいでください。
- 5分間2500rpmで板を回転し、反転以上廃棄物のバケツやペーパータオルでブロッティングにより上清を取り除く。
- RapidPlateで各ウェルに最少培地の200μL（例えばSD / - 裏）を追加します。
- 振盪せずに2日間、30℃でインキュベートする。 2日後、細胞の小さなコロニーがうまくうまく変換された各の下部にあるフォームを開始する必要があります。
3。アッセイをスポッティング
- の各ウェルにラフィノースベースの最少培地（例えばSRAF /浦）の200μLを分注する新しい平底96ウェルプレート。
- Rapidplateで8回吸引し、細胞懸濁液を分注することによって形質転換プレートの各ウェルを混ぜる。
- 形質転換プレートから細胞混合物の5μLとSRAFプレートに接種する。
- 一日のために30℃でインキュベートする。小さなコロニーは、1日後に各ウェルの底に存在すべきである。
- SD / -裏とSGal /浦フードのプレート上のスポットのコロニー。炎によって96ボルトレプリケータ（フロッガー）を滅菌する。選択培地プレート上にスポッティングする前にフロッガーを持つコロニーを混ぜる。スポッティング後、プレートを5〜10分間フード内で乾燥させます。
- 2〜3日間30℃でインキュベートする。
写真デジタルカメラとプレート、そして視覚的にクエリひずみ毒性が増強されるコロニー（遅い成長/密度の低いコロニー）または抑制を（速く成長/より緻密なコロニー）を見つけるためにSGal /浦プレート上のコロニーの成長を比較する。
4。代表的な結果：
TDP - 43毒性の抑制およびエンハンサーを同定するために図1。酵母プラスミド過剰発現の画面。 TDP - 43は、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリッグ病）の病因に関与しているヒトタンパク質である。 TDP - 43の細胞質凝集体は、ALS患者17の脳と脊髄の神経細胞に蓄積されます。凝集と細胞毒性18の酵母細胞の結果におけるTDP - 43を表現する。我々は、TDP - 43毒性19,20のメカニズムを定義するには、このモデルシステムを使用している。示すように私たちの酵母TDP - 43毒性の修飾子画面から板のrepesentative例です。これらのプレートはFLEXGene ORF発現ライブラリーからのプラスミドで形質転換した統合型ガラクトース誘導TDP - 43プラスミドともあるコロニーが表示されます。左側のプレートは、TDP - 43またはFLEXGeneプラスミドの発現を抑制するグルコースを、含まれています。右側のプレートは、TDP - 43の発現とFLEXGeneプラスミドのORFを誘導するガラクトースが含まれています。緑の矢印は、TDP - 43の毒性を抑制することをプラスミドで形質転換コロニーを示している。赤い矢印は、TDP - 43の毒性を増強することをプラスミドで形質転換コロニーを示している。
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Discussion
ここでは、酵母における高スループットプラスミド過剰発現の画面を実行するためのプロトコルを提示する。このアプローチは、多くの異なる細胞の表現型の遺伝的修飾のための迅速かつ公平な審査が可能になります。このアプローチを使用して、研究者は数週間のうちに酵母ゲノムのかなりの部分を選別できます。この公平なアプローチは、以前の調査結果に基づいて予測されていない可能性が修飾子の識別、することができます。私たちは、人間の神経変性疾患のタンパク質19,21-23の集約に関連付けられている毒性の修飾子を識別するためにこのアプローチを使用している。しかし、により他の細胞プロセスを研究するためにこのプロトコルの適応性に、このプロトコルは、重要な生物学的な質問の広い範囲に対処する研究者にも有用でしょう。例えば、我々はまた、重金属や酸化的ストレスを含む環境ストレスへの適応に関与する遺伝子と経路を識別するためのこのスクリーニングのアプローチが有用な発見した。ここでは、1つのプラスミドライブラリ、酵母FLEXGeneライブラリ9日に焦点を当てている。しかし、また、これらの画面6,8を使用することができる利用可能ないくつかの他の酵母プラスミドライブラリーは、ある。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ジョンズホプキンス大学でALS研究のためのパッカードセンター（ADG）、NIHのディレクターの新イノベーター賞1DP2OD004417 - 01（ADG）、NIH R01 NS065317（ADG）、リタアレン財団奨学生賞からの助成金によって支えられて。 ADGは、ピュー慈善財団がサポートしている医歯薬学総合研究でピュー学者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
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