Summary
De zebravis nier is de thuisbasis van zowel de nier-en hematopoietische volwassen stamcellen / progenitorcellen, en vormt een uitstekende gelegenheid om deze celtypen en hun nakomelingen studie in een gewerveld modelorganisme. Hier tonen we een gedetailleerde dissectie procedure die de onderzoeker in staat stelt te identificeren en chirurgisch te verwijderen van de volwassen zebravissen nieren, die kunnen worden gebruikt voor toepassingen zoals celisolatie, transplantatie, en expressie studies van de nier-en / of bloed celpopulaties.
Abstract
Onderzoekers die werkzaam zijn in de snel groeiende gebied van volwassen stamcellen biologie proberen de signalen die het gedrag en de functie van stamcellen tijdens de normale homeostase en ziekte staten regelen begrijpen. Het begrip van volwassen stamcellen heeft een brede verstrekkende gevolgen voor de toekomst van de regeneratieve geneeskunde 1. Zo kan bijvoorbeeld een betere kennis over volwassen stamcellen biologie vergemakkelijken het ontwerpen van therapeutische strategieën in welke organen worden geactiveerd om zichzelf of zelfs de creatie van methoden voor het kweken van organen in vitro die kunnen worden getransplanteerd naar de mens een te genezen. De zebravis is uitgegroeid tot een krachtig diermodel voor de studie van de gewervelde celbiologie 2. Er is uitgebreide documentatie en analyse van de embryonale ontwikkeling in de zebravis 3. Pas sinds kort hebben wetenschappers gezocht naar volwassen anatomie en chirurgische dissectie technieken 4 document, want er is een progressieve beweging binnen de zebravis gemeenschap om de toepassingen van dit onderzoek te verbreden tot volwassen organisme studies. Zo zijn er belangen in het uitbreiden met behulp van zebravis om de biologie van volwassen stamcellen populaties te onderzoeken en geavanceerde volwassen modellen van ziekten zoals kanker 5 te maken. Historisch gezien is isolatie van de zebravis volwassen nier geweest voor het bestuderen van hematopoiese, zoals de nieren is de anatomische locatie van de aanmaak van bloedcellen in vis 6,7. De nier is opgebouwd uit nefron functionele eenheden te vinden in arborized regelingen, omringd door hematopoietische weefsel dat is verspreid over de tussenliggende ruimtes. De hematopoietische component bestaat uit hematopoietische stamcellen (HSC's) en hun nageslacht dat de nier bewonen totdat ze terminaal differentiëren 8. Bovendien is het nu duidelijk zijn, dat een groep van nier-stam / voorlopercellen (RPC) ook de zebravis nieren orgel bewonen en in staat stellen zowel nier regeneratie en groei, zoals bij andere vissoorten 9-11. In het licht van deze nieuwe ontdekking, de zebravis nier is een orgaan dat de locatie van twee interessante mogelijkheden voor volwassen stamcellen biologisch onderzoek huizen. Het is duidelijk dat veel openstaande vragen konden goed worden geserveerd met deze experimentele systeem. Het stimuleren van uitbreiding van dit terrein, is het gunstig om gedetailleerde methoden voor het visualiseren van document en vervolgens isoleren van de volwassen zebravissen nier orgel. Dit protocol details onze procedure voor dissectie van de volwassen nier van zowel de nog niet opgeloste en vaste dieren. Dissectie van de nier orgaan kan worden gebruikt voor het isoleren en karakteriseren hematopoietische en renale stamcellen en hun nakomelingen met behulp van bestaande technieken, zoals histologie, fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) 11,12, expressie profilering 13,14, 11,15 en transplantatie. We hopen dat de verspreiding van dit protocol zullen de onderzoekers te voorzien van de kennis om ruimer gebruik van de zebravis studies die uiteindelijk vertaald kunnen worden voor menselijke toepassing te implementeren.
Protocol
1. Dissectie van de volwassen zebravis nier van een dier niet vastgelegde monster
- Kies een volwassen zebravissen tussen 3-6 maanden in leeftijd voor dissectie.
- Euthanaseren de vis door deze in een schaal met 0,2% tricaïne pH 7.0 voor ongeveer 4-5 minuten, kijken voorzichtig om te zien dat de kieuwen stoppen met bewegen en het hart stopt met kloppen.
- Met behulp van een lepel, til de vis uit de tricaïne bad in een kleine hoeveelheid van de oplossing, giet de oplossing en voorzichtig het dier op een papieren handdoek.
- Gebruik een scherp paar van dissectie schaar aan de kop van het dier te verwijderen, het maken van een snede net achter de kieuw operculum (Figuur 1, pad A). Gooi het hoofd in een biologisch gevaarlijk afval container.
- Gebruik de dissectie schaar om het lichaam te openen van het dier, door het maken van een lange ventrale incisie, te beginnen met het hoofd en eindigt bij de staart aan de basis van de staartvin (figuur 1, pad B).
- Verwijder de interne organen van het dier met behulp van een paar van de dissectie pincet / tang, en plaats ze in biologisch gevaarlijk afval. Wees voorzichtig dat u de dorsale lichaamswand borstel, want dit is de locatie van de nier (figuur 2). Als u hebt gekozen voor een vrouwelijke vis, moet u de ontwikkeling van eieren schep van de lichaamsholte, die kan heel eenvoudig worden gedaan met behulp van een schuine paar pincetten of pincet.
- Gebruik dissectie naalden om pin van het lichaam muren open voor een dissectie lade en de pinnen, zodat de nieren kunnen worden gevisualiseerd hoek. De nier zal beschikken over een karakteristieke vorm (hoofd, romp / zadel, staart) en de kleur, wordt afgewisseld met zwarte hued pigmentatie (figuur 2). U kunt ook de aorta gevuld met perifeer bloed, die naar beneden loopt de middellijn van het orgel structuur.
- Gebruik fijn pincet om de nieren los te maken van het dorsale lichaam muur, met behulp van een paar pincetten om de nier te heffen als je los het orgel van het bindweefsel, dat het ten grondslag liggen.
- Plaats voorzichtig de nier in de gewenste voertuig voor de verdere live cell studies, zoals een microcentrifugebuis met 1x PBS voor FACS voorbereiding.
2. Voorbereiding en dissectie van de volwassen zebravis nier van een dier vast monster
- Bereid een oplossing van 4% paraformaldehyde/1X PBST. Kook de oplossing voor de PFA te ontbinden in oplossing, dan is het mengsel afkoelen tot 4 ° C en voeg 0,1% dimethylsulfoxide. We hebben het meeste succes met weefsel behoud van het gebruik van vers gemaakte PFA-oplossingen, in tegenstelling tot diepvries fracties. Maak voldoende oplossing om onder te duiken de volwassen zebravissen tijdens de dissectie.
- Vul een dissectie bak met voldoende fixatie oplossing om onder te duiken de volwassen zebravissen gedurende de dissectie. Wij voeren de volgende stappen met deze lade gepositioneerd onder de microscoop, die kan worden geplaatst in een chemische kap om de blootstelling aan fixatie geuren te minimaliseren.
- Kies een volwassen zebravissen tussen 3-6 maanden in leeftijd voor dissectie.
- Euthanaseren de vis door deze in een schaal met 0,2% tricaïne pH 7.0 voor ongeveer 5 minuten kijken zorgvuldig om te zien dat de kieuwen en het hart stoppen met kloppen.
- Met behulp van een lepel, til de vis uit de tricaïne bad in een kleine hoeveelheid van de oplossing, giet de oplossing en voorzichtig het dier op een papieren handdoek.
- Gebruik een scherp paar van dissectie schaar aan de kop van het dier te verwijderen, het maken van een snede net achter de kieuw operculum (Figuur 1, pad A). Gooi het hoofd in een biologisch gevaarlijk afval container, en onmiddellijk het dier te plaatsen in de PFA-bevattende dissectie lade.
- Gebruik de dissectie schaar om het lichaam van het dier te openen, door het maken van een lange ventrale incisie, te beginnen met het hoofd en eindigt bij de staart aan de basis van de staartvin (figuur 1, pad B), en houdt het lichaam gedeeltelijk onder het tijdens de de procedure.
- Verwijder de interne organen van het dier met behulp van een paar van de dissectie pincet / tang, en plaats ze in biologisch gevaarlijk afval. Wees voorzichtig dat u de dorsale lichaamswand borstel, want dit is de locatie van de nier (figuur 2).
- Gebruik dissectie naalden om pin openen van het lichaam muren, en de pinnen, zodat de nieren kunnen worden gevisualiseerd hoek. De nier zal beschikken over een karakteristieke vorm (hoofd, zadel, staart) en de kleur, wordt afgewisseld met zwarte hued pigmentatie (figuur 2). U kunt ook de aorta gevuld met perifeer bloed, die naar beneden loopt de middellijn van het orgel structuur.
- 'S nachts vast het monster, het plaatsen van de lade bij 4 ° C wanneer u klaar bent met het regelen van de gewenste monsters.
- De volgende dag, verwijder de PFA-oplossing uit de lade en vervang met 1x PBST.
- Gebruik fijn pincet om de nier voorzichtig los te maken van het dorsale lichaam muur, met behulp van een paar pincetten om de nier te heffen als je los het orgel van het bindweefsel, dat het ten grondslag liggen. Het nierweefsel wordt zacht en soepel worden van de DMSO in het fixeermiddel oplossing, waardoor het mogelijk is om de gehele nier orgel ontleden in een stuk.
- Gebruik een bredeboring overdracht pipet om de nier te plaatsen in een microcentrifugebuis.
- De nier kan nu verder worden verwerkt tot histologische of hele berg gedrag in situ genexpressie studies op basis van de gewenste studie.
3. Representatieve resultaten:
De stappen die zijn schematisch in figuur 1 geven de dissectie procedure. De nier kan worden geïdentificeerd op basis van zijn karakteristieke vorm en kleur, en anatomische locatie op de dorsale wand van het lichaam van het dier holte, zoals weergegeven in figuur 2. Na ontleding van een vaste nier monster, ganse berg in situ hybridisatie kan worden gebruikt om lokaliseren van de expressie van een gen van belang, zoals weergegeven in figuur 3.
Figuur 1: Procedure die directe toegang voor het ontleden van de zebravis volwassen nier mogelijk maakt. (A) gedood zebravis is ontleed in een stapsgewijze manier (aangegeven met nummers en pijlen) aan de onderzoeker geeft de gemakkelijkste toegang tot de volledige nier orgel. Beelden van de buikholte vóór (B) en na (C) het verwijderen van de buikorganen.
Figuur 2:. Visualisatie van de zebravis nier in een niet vastgelegde steekproef Na verwijdering van organen in het lichaam holte, de nieren verschijnt als een enkele, afgeplatte orgaan dat is aanhanger van de dorsale lichaamswand via het bindweefsel (A), en is geschematiseerd (B) aan de anatomische vorm te tonen.
Figuur 3: Hele monteren in situ hybridisaties uitgevoerd op de gehele volwassen nier orgel. (A) cadherin17 transcripten zijn gedetecteerd in de tubulus van volwassen nieren nefronen, uitgebreid in (A '). (B) mafba transcripties zijn proximale nefron celtypen in de volwassen nier (te vergelijken met hele tubulus in paneel A) gelokaliseerd. (B' ) Een vergroot aanzicht van mafba expressie blijkt dat transcripties zijn specifiek gelokaliseerd in het podocyte (P) cellen van het bloed filter (glomerulus) en de proximale tubulus (PCT).
Discussion
Volwassen stamcellen zijn dynamisch en essentiële componenten die de volwassen lichaam vormen een te behouden. Volwassen stamcellen kunnen ook dienen om schade tegen te gaan dat het lichaam loopt tijdens de ziekte staten, en het disfunctioneren of het verlies van volwassen stamcellen kunnen leiden tot het verval van orgaanfunctie en is betrokken bij kanker maligniteiten rijden en aan veroudering dragen. Volwassen stamcellen vertonen cellulaire eigenschappen die hen onderscheiden van gedifferentieerde celtypen. Bij de celdeling, volwassen stamcellen in staat zijn om zelf-vernieuwing en de productie van progenitor cellen die op hun beurt kunnen leiden tot verschillende gedifferentieerde nakomelingen. Er is grote belangstelling voor het begrijpen van de paden die de cel beslissingen over het lot en de potentie van volwassen stamcellen regelen vanwege hun belangrijke rol in het weefsel homeostase 1. Bijvoorbeeld, veel wetenschappers op dit moment proberen de signalen die verschillende volwassen stamcellen populaties in hun niche, of gespecialiseerde micro-omgeving, en hoe deze niche wordt beïnvloed door humorale factoren behouden te identificeren.
Volwassen hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn pluripotente cellen die de brandstof voor de voortdurende verjonging van bloedcellen in dieren 8. Hematopoiese is een levendig proces dat voortdurend gaande is gedurende de levensduur van een gewerveld organisme, omdat de volwassen gedifferentieerde bloedcellen types zijn van korte duur en dus moet regelmatig worden aangevuld. Terwijl ze verdelen, HSCs aanbod deze cruciale vraag door zelf-vernieuwing en het produceren van een reeks van voorouders die aanleiding geven tot de erytroïde, megakaryocyten, lymfoïde en myeloïde geslachten. Elk van deze bloed-celtypen vervult unieke functies in de circulatie, waaronder het verstrekken van gas te wisselen om weefsel, een manier voor het afdichten van verwondingen aan bloedvaten door middel van stolselvorming, of afweermechanismen tegen binnendringende ziekteverwekkers. Terwijl HSCs zijn erkend voor vele jaren, een overvloed aan boeiende vragen blijven onbeantwoord over deze verbazingwekkende cellen. Recente studies hebben vastgesteld dat subklassen van HSC met verschillende lange-termijn zelfvernieuwing eigenschappen en de opheldering van niche-componenten en geeft aan dat het gedrag van HSC 8 moduleren. De zebravis is nu een van de hoekstenen van hematopoiese onderzoek paradigma's, op basis van de genetische en moleculaire eigenschappen van dit dier model 8. Onderzoek met behulp van de zebravis heeft geleid tot nieuwe inzichten over HSC biologie die zijn geconserveerd met een hogere gewervelde dieren, zoals zoogdieren, met nadruk op de biomedische relevantie van vis bloed onderzoeken 8.
Historisch gezien is de kennis over HSC heeft de weg vrijgemaakt voor de expedities op zoek om te ontdekken of andere organen worden onderhouden door volwassen stamcellen. Talrijke volwassen stamcellen celpopulaties worden nu gewaardeerd op te bestaan, variërend in diverse structuren van de hersenen naar de darm, de huid en de skeletspieren. Voortdurende inspanningen op het gebied van stamcellen proberen te bepalen hoe volwassen stamcellen en zelfs andere gedifferentieerde celtypes gebruik kunnen verhoogde potentie zien in verschillende settings.
Met betrekking tot de nieren, is er grote debat onder nefrologen over de vraag of renale stamcellen 16 bestaan. Onafhankelijke bevindingen hebben gedocumenteerde populaties van niercellen bij zoogdieren die beschikken over verschillende gradaties van regeneratief potentieel, maar een samenhangend begrip van deze meldingen is nog niet bereikt. Interessant is dat er sterk bewijs voor het idee dat veel vissoorten cellen die robuust kan brandstof regeneratie van beschadigd nefronen, evenals groei geheel nieuwe nefronen tijdens de volwassenheid 9 bezitten ondersteunen. Recent werk heeft gewezen op de moleculaire kenmerken van volwassen nieren stamcellen in de zebravis 10,11, en toonde de zelfvernieuwing potentie van deze zogenaamde nier-stam / voorlopercellen (RPC's) 11. Toekomstige studies zijn nodig om na te gaan of analoog niercellen aanwezig zijn bij zoogdieren. Toch kan verder onderzoek over de cellulaire en moleculaire mechanismen die vis RPCs reguleren geven inzicht in hoe regeneratieve prestaties kunnen worden gestimuleerd in het zoogdier nier. Het is duidelijk dat er nog veel te begrijpen over de RPC, en dat de vele nu beschikbare instrumenten voor de zebravis onderzoeker kan uitgevoerd worden om deze intrigerende vragen aan te pakken.
In dit protocol beschrijven we onze methode voor de identificatie en anatomische dissectie van de volwassen zebravissen nier. Alternatieve stappen kunnen worden gebruikt om de nier, zoals het openen van de buikholte met een ventrale incisie met behulp van een schaar dissectie ontleden, maar we zijn tegengekomen het meeste succes bij de toegang tot de hele nier wanneer de buikwand is gespeld te openen en het hoofd wordt verwijderd. Het bloed en de nieren onderzoekers zowel die wensen te isoleren en te werken met deze celtypen kunnen gebruiken ofwel dissectie methode. Opgemerkt moet worden dat de methode die we beschrijven voor het isoleren en working met de zebravis volwassen nier is zeker niet beperkt tot wetenschappers die willen vragen van volwassen stamcellen biologie na te streven, als de ontleding van dit orgaan kan onderzoeken te vergemakkelijken voor de onderzoekers het nastreven van onderzoeken over onderwerpen variërend van fysiologie aan de vergrijzing. Verder kan deze methode worden gecombineerd met andere technologieën, zoals genetische manipulatie, om zo vervolgens moleculair label en te zuiveren en studie discrete subpopulaties van bloed of nieren cellen van wild-type of genetisch gemuteerde zebravissen 11. Vooruitblikkend, zulke gedetailleerde procedures zuivering van de stam en de voorlopercellen celtypen is van vitaal belang voor het verkrijgen van kennis over hoe hun gedrag wordt gereguleerd, zoals operationele tests, zoals transplantatie of voorlopercellen kweken vormen de basis waarmee de potentie en de identiteit van deze cellen wordt bepaald. Recente ontwikkelingen in de hematopoietische voorlopercellen kweekmethoden openen vele nieuwe mogelijkheden voor studie, en kan worden aangepast aan het kweken van de nierfunctie de bevolking 17. Zebravis chemische genetica succesvol zijn geweest bij de identificatie van de pathways die HSC en renale voorlopers in verschillende contexten 18-20 moduleren, en blijft een nuttig laan in combinatie te testen met bovenstaande celbiologie technieken. Bij elkaar genomen, zijn er een aantal baanbrekende bijdragen aan het gebied van hematologie en nefrologie het gebruik van de zebravis model, en verder onderzoek in deze arena's beloften om verder te hanteren transformatieve inzichten in de komende jaren.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
RAW wil de leden van de Zon en Davidson onderzoekslaboratoria bedanken voor hun ontelbare bijdragen aan het helpen om strategieën die geleidelijk over deze dissectie techniek vorm bij volwassen zebravissen de afgelopen tien jaar te ontwikkelen. Daarnaast willen we onze dank uitspreken aan de medewerkers van de Notre Dame Center for Research zebravis voor het leveren van uitstekende lopende veehouderij zorg voor onze zebravis kolonie. RAW oogstte financiering van het onderzoek van de NIH-NIDDK de toekenning van subsidies DK083512, en gul laboratorium start-up financiering van de University of Notre Dame.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Dissection angled forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5058 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Stocum, D. L., Zupanc, G. K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).
- Zon, L. I. Developmental biology of hematopoiesis. Blood. 86, 2876-2891 (1995).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. Mutant-specific gene programs in the zebrafish. Blood. 106, 521-530 (2005).
- Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106, 534-541 (2005).
- Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).
