Summary
zebrafish의 신장은 모두 신장과 조혈 성인 줄기 / 전구 세포의 고향이며, 척추 모델 생물에서 이러한 세포 유형과 그들의 자손을 공부하기 위해 우수한 기회를 나타냅니다. 여기, 우리는 세포 분리, 이식 및 신장 및 / 또는 혈액 세포 집단의 표현 연구와 같은 애플 리케이션에 사용할 수있는 성인 zebrafish의 신장을 확인하고 수술 제거하는 연구자 수 있도록 상세한 해부 절차를 보여줍니다.
Abstract
성인 줄기 세포 생물학의 급성장 분야에서 일하는 연구자는 정상적인 항상성 및 질병 상태 동안 줄기 세포의 동작과 기능을 조절 신호를 이해하기 위해 추구합니다. 성인 줄기 세포의 이해는 재생 의료 1의 미래에 대한 광범위한 도달 의미가 있습니다. 예를 들어, 성인 줄기 세포 생물학에 대한 더 나은 지식은 장기가 스스로 또는 인간 하나에 이식 수있는 체외에서 성장하는 기관에 대한 방법도 생성을 치유하기 위해 실행하는 치료 전략의 디자인을 용이하게하실 수 있습니다. zebrafish는 척추 세포 생물학 2의 학습을위한 강력한 동물 모델이되었다. zebrafish 3 배아 발달의 광범위한 문서 및 분석하고있다. 최근 성인 연구이 연구 유기체의 응용 프로그램을 확대하기 위해 zebrafish 지역 사회 내에서 진보 운동이 존재한 이래로, 성인 해부학, 외과 절개 기법 4 문서 모색 과학자 있습니다. 예를 들어, 성인 줄기 세포 집단의 생물 학적 조사와 같은 암 5 질병의 정교한 성인 모델을 만들기 위해 zebrafish를 사용하여 관심이 확대됩니다. 역사적으로, zebrafish 성인 신장의 분리는 신장 물고기 6,7에서 혈액 세포 생산의 해부 학적 위치이므로, 조혈 공부를위한 수단되었습니다. 신장은 개입 공간에 걸쳐 흩어져 있기 때문에 조혈 조직으로 둘러싸여 arborized 준비에있는 nephron 기능 단위로 구성되어 있습니다. 조혈 구성 요소들은 말기 8 차별 때까지 신장 서식 조혈 줄기 세포 (HSCs)와 그들의 자손으로 구성되어 있습니다. 또한, 그것은 지금과 같은 다른 어종 9-11에서 관찰, 신장 줄기 / 전구 세포의 그룹 (RPC를)이 또한 zebrafish 신장 기관이 서식하고 신장의 재생과 성장을 모두 사용하는 것이 감사합니다. 이 새로운 발견에 비추어, zebrafish 신장은 성인 줄기 세포 생물학 연구의 두 가지 흥미로운 기회의 위치를 주택 장기 하나입니다. 그것은 많은 훌륭한 질문이 잘이 실험 시스템을 제공 될 수 있다고 분명하다. 이 분야의 확장을 촉진하기 위해서는 시각화에 대한 자세한 방법을 문서화하고 다음 성인 zebrafish의 신장 기관을 분리하기 위해 유용합니다. 이 프로토콜은 수정되지 않은 및 고정 모두 동물의 성인 신장의 해부에 대한 세부 절차를. 신장 기관의 해부는 이러한 조직학, 형광 활성 세포 분류 (외과) 11,12, 표현 파일링 13,14, 및 이식 11,15 설립 기술을 사용하여 조혈 및 신장 줄기 세포와 그 자손을 분리하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜의 보급이 궁극적으로 인간의 응용 프로그램에 대한 번역될 수 zebrafish 연구의 광범위한 사용을 구현할 수있는 지식과 연구자를 제공하기를 바랍니다.
Protocol
1. 고정되지 않은 동물의 샘플에서 성인 zebrafish의 신장의 해부
- 해부에 대한 시대에 3-6개월 사이의 성인 zebrafish를 선택합니다.
- 아가미가 이동하고 심장 박동 중지 중지 있는지주의 깊게 관찰, 약 4~5분에 대한 0.2 % Tricaine 산도 7.0 그릇에 그것을 배치하여 물고기를 안락사.
- 스푼을 사용하여, 솔루션의 소량의 Tricaine 욕조에서 물고기를 리프트 솔루션을 가만히 따르다 부드럽게 종이 타월에 동물을 놓으십시오.
- 그냥 길 operculum (그림 1, 경로) 뒤에 상처를 만들고, 동물의 머리를 제거하는 해부 가위의 날카로운 쌍을 사용합니다. 생물 학적 폐기물 용기에 머리를 삭제.
- 머리부터 꼬리 지느러미와 (그림 1, 경로 B)의 기본에 꼬리를 종료, 긴 복부 절개를하여, 동물의 시체를 엽니다 해부 가위를 사용합니다.
- 해부의 핀셋 / 포셉 한 켤레를 사용하여 동물의 내장을 제거하고, 생물 학적 폐기물에서 그들을 놓으십시오. 이것은 신장의 위치 (그림 2)와 같이, 등의 신체 벽 브러시하지 않도록주의하십시오. 당신이 여성 물고기를 선택한 경우, 당신은 가장 쉽게 집게 또는 핀셋의 직각 쌍을 사용 할 수 뱃속의 개발 달걀을 푸다해야합니다.
- 절개 트레이에 몸을 벽을 열고 핀, 그리고 신장이 시각 수 있도록 핀을 각도 절개의 바늘을 사용합니다. 신장은 특징적인 모양 (머리, 트렁크 / 안장, 꼬리)와 색상을 가지게 되리라 블랙 hued 착색 (그림 2)와 interspersed되고. 당신은 또한 장기 구조의 정중선을 실행 말초혈, 가득 대동맥를 볼 수 있습니다.
- 당신이 그것을 기초 결합 조직에서 오르간을 별도로 신장을 리프트로 포셉 중 한 쌍을 사용 등의 신체 벽에서 신장을 분리하기 위해 미세 집게를 사용하십시오.
- 부드럽게 같은 외과 준비에 대한 1X PBS를 포함하는 microcentrifuge 관으로 더 라이브 세포 연구에 대한 원하는 차량에 신장을 놓으십시오.
2. 고정 동물의 샘플에서 성인 zebrafish의 신장의 준비 및 해부
- 4퍼센트 paraformaldehyde/1X의 PBST의 솔루션을 준비합니다. 솔루션에 PFA를 해산하기 위해 솔루션을 삶아 다음 ° C 4 혼합물을 냉각하고 0.1 % dimethylsulfoxide를 추가합니다. 우리는 냉동 aliquots 반대로 갓 만든 PFA 솔루션을 사용하여 조직 보존과 함께 가장 성공을 있었다. 잠수함 해부 동안 성인 zebrafish를 충분히 솔루션을 확인하십시오.
- 잠수함 해부 동안 성인 zebrafish를 충분히 고정 솔루션으로 절개 트레이를 채우십시오. 우리는 고정 냄새에 노출을 최소화하기 위해 화학 후드에 놓일 수있는 현미경이 위치 트레이와 후속 단계를 수행합니다.
- 해부에 대한 시대에 3-6개월 사이의 성인 zebrafish를 선택합니다.
- 보고 신중하게 지켜보고, 약 5 분 동안 0.2 % Tricaine 산도 7.0 그릇에 그것을 배치하여 물고기를 안락사되는 아가미와 심장 박동 정지.
- 스푼을 사용하여, 솔루션의 소량의 Tricaine 욕조에서 물고기를 리프트 솔루션을 가만히 따르다 부드럽게 종이 타월에 동물을 놓으십시오.
- 그냥 길 operculum (그림 1, 경로) 뒤에 상처를 만들고, 동물의 머리를 제거하는 해부 가위의 날카로운 쌍을 사용합니다. 생물 학적 폐기물 용기에 머리를 삭제하고, 즉시 PFA 함유 절개 트레이에 동물을 놓으십시오.
- 머리부터와 꼬리 지느러미 (그림 1, 경로 B)의 기본에 꼬리를 종료, 긴 복부 절개를하여, 동물의 시체를 엽니다 해부 가위를 사용하여 부분적으로 동안 잠수 신체를 유지 절차.
- 해부의 핀셋 / 포셉 한 켤레를 사용하여 동물의 내장을 제거하고, 생물 학적 폐기물에서 그들을 놓으십시오. 이것은 신장의 위치 (그림 2)와 같이, 등의 신체 벽 브러시하지 않도록주의하십시오.
- 신체 벽면을 열고 핀, 그리고 신장이 시각 수 있도록 핀을 각도 절개의 바늘을 사용합니다. 신장은 검은색 hued 착색 (그림 2)와 interspersed되는 특성 모양 (머리, 안장, 꼬리)와 색상을 가지고 있습니다. 당신은 또한 장기 구조의 정중선을 실행 말초혈, 가득 대동맥를 볼 수 있습니다.
- 4 트레이를 배치, 야간 샘플을 수정 ° 당신이 원하는 샘플을 꺼리 완료되면 C.
- 다음날, 트레이에서 PFA 솔루션을 제거하고 1X PBST로 바꿉니다.
- 주의깊게 당신이 그것을 기초 결합 조직에서 오르간을 별도로 신장을 리프트로 포셉 중 한 쌍을 사용 등의 신체 벽에서 신장을 분리하기 위해 미세 집게를 사용하십시오. 신장 조직은 가능한 한 조각의 전체 신장 장기를 해부하다 수 있도록, 정착액 솔루션 DMSO에서 부드러운 고분 고 분한 것입니다.
- 사용 넓은을microcentrifuge 관에 신장을 배치 보어 전송 pipet.
- 신장 이제 원하는 연구를 기반으로 현장 유전자 발현 연구에 histological 또는 전체 마운트를 수행하기 위해 추가로 처리할 수 있습니다.
3. 대표 결과 :
그림 1 diagrammed하는 단계는 절개 절차를 나타냅니다. 그림 2에서와 같이 신장은 그 특성 모양과 착색, 그리고 동물의 뱃속의 지느러미 벽에 해부 위치에 따라 확인할 수 있습니다. 현장 하이브리드화에 고정 신장 샘플, 전체 마운트의 절개 후 그림 3과 같이, 관심 유전자의 표현을 집중하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1 : zebrafish 성인 신장을 해부에 대한 직접 액세스를 가능하게 절차. (A) Euthanized zebrafish는 연구자에게 완전한 신장 기관에 대한 쉬운 액세스를 제공하기 위해 (번호와 화살표로 표시) stepwise 방식으로 해부하는 것입니다. 복강의 이미지 이전 (B) 및 이후 (C) 복부 장기의 제거.
그림 2 :. 떼어낸 샘플에 zebrafish 신장의 시각화 뱃속에있는 장기에 따라 제거, 신장은 결합 조직 (A)를 통해 지느러미 몸 벽에 자기편이라고 하나, 평평 기관으로 나타나며, schematized되었습니다 (B)의 해부 학적 모양을 표시합니다.
그림 3 : 전체 성인의 신장 기관에서 수행 현장 hybridizations에서 전체 탑재합니다. (A) cadherin17 성적은 (A ')의 확대, 성인 신장 nephrons의 가느다란 관에 감지됩니다. (B) mafba의 성적표가 성인 신장 (패널의 전체 가느다란 관과 비교할 때)의 근위 nephron 세포 유형화된 있습니다. (B' ) mafba 표현의 확대는 성적이 특히 혈액 필터 (glomerulus)와 근위 뒤얽힌 가느다란 관 (PCT)의 podocyte (P) 세포화된 아르 보여줍니다.
Discussion
성인 줄기 세포는 성인 신체 양식 1 유지 역동적이고 필수 구성 요소입니다. 성인 줄기 세포는 질병 상태 동안 신체 incurs 및 성인 줄기 세포의 기능 장애 또는 손실이 장기 기능의 감소로 이어질 수 있으며, 암 malignancies를 드라이브 및 노화에 기여하는 연루되어있다는 손상을 중화하는 역할을 수 있습니다. 성인 줄기 세포는 차별화된 세포 유형에서 그들을 구별 세포 특성을 나타냅니다. 세포 분열시, 성인 줄기 세포 자기 갱신과 차례로 뚜렷한 차별 자손에게 상승을 줄 수 전구 세포의 생산이 가능합니다. 때문에 조직의 항상성 1 그들의 중요한 역할의 세포 운명 결정과 성인 줄기 세포의 힘 조절 경로를 이해하는 큰 관심이있다. 예를 들어, 많은 과학자들은 현재 자신의 틈새 시장에서 다양한 성인 줄기 세포의 집단, 또는 전문 microenvironment, 그리고 어떻게 틈새는 체액성 요인에 의해 영향을이다를 유지 신호를 식별을 추구합니다.
성인 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 연료 동물 8 혈액 세포의 지속적인 도로 젊어짐 pluripotent 세포 수 있습니다. 조혈은 성숙 차별화된 혈액 세포 유형은 수명이 짧은되며 따라서 정기적으로 보충함해야하기 때문에 척추 유기체의 수명 동안 지속적으로 진행되는 역동적인 과정이다. 그들이 분열로 HSCs 자기 갱신과 erythroid, megakaryocyte 림프 및 골수양 lineages을 일으키다 progenitors 일련의 생산하여이 중요한 요구를 제공합니다. 이러한 혈액 세포 유형의 각각은 조직 응고 형성의 수단, 또는 병원균에 침해에 대한 방어 메커니즘에 의해 혈관에 부상을 막기위한 방법을 가스 교환을 제공 포함한 유통에서 고유 기능을 수행합니다. HSCs가 수년 동안 인정을 받고있는 반면, 매혹적인 질문의 과다이 놀라운 세포에 대해서 답이 남아 있습니다. 최근 연구는 다른 장기 자기 갱신 등록 및 틈새 구성 요소 및 HSC 행동 8 변조 신호의 해설과 함께 HSCs의 서브 클래스를 확인합니다. zebrafish는이 동물 모델 8 유전자와 분자 특성에 따라 조혈 연구 패러다임의 기초 중 지금이다. zebrafish를 이용 연구는 물고기 혈액 조사 8 의생명 관련성을 강조, 포유류와 같은 고등 척추 동물과 보존 아르 HSC 생물학에 대한 통찰력 소설되었다.
역사적으로, HSCs에 대한 지식은 다른 신체 기관은 성인 줄기 세포가 관리하는 경우 발견하고자 원정을 위해 포장하는 방법이 있습니다. 많은 성인 줄기 세포 집단은 이제 두뇌에서 창자, 피부 및 골격 근육에 다양한 구조를 통해 이르기까지 존재 감사합니다. 줄기 세포 분야의 지속적인 노력은 성인 줄기 세포, 심지어 다른 차별화된 세포 유형은 다양한 설정에서 향상된 힘을 표시할 수있는 방법을 파악을 추구합니다.
신장과 관련하여, 신장 줄기 세포 16 존재 여부를 nephrologists 사이에 큰 논쟁이있었습니다. 독립적인 연구 결과는 재생 가능성의 학위를 가지고 다양한 포유류의 신장 세포의 인구를 문서화 있지만, 이러한 리포트의 응집 이해 얻을 아직있다. 흥미롭게도, 많은 물고기 종 (种)은 견고하게 손상 nephrons의 재생을 연료뿐만 아니라 성인 9 동안 완전히 새로운 nephrons을 성장할 수 세포를 가지고있는 개념을 지원하는 강력한 증거가있다. 최근 작품은 zebrafish 10,11의 성인 신장 줄기 세포의 분자 특징을 파악하고, 이러한 소위 신장 줄기 / 전구 세포 (RPC를) 11의 자기 갱신 힘을 보여주었다. 미래 연구는 유사한 신장 세포가 포유류에 존재 여부를 확인할 필요가있다. 그럼에도 불구하고, 생선 RPC를 조절 세포와 분자 메커니즘에 대한 지속적인 조사가 재생 업적은 포유류의 신장에 자극 수 방법에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 많은 RPC를 대한 이해에 그대로 남아 있으며, zebrafish 연구원 사용할 이제 다양한 도구가 이러한 흥미로운 질문을 해결하기 위해 구현할 수 있는지 분명하다.
이 프로토콜에서는, 우리는 성인 zebrafish의 신장의 해부 식별 및 해부를위한 방법을 설명합니다. 다른 단계는 이러한 해부 가위를 사용하여 복부 절개로 복강을 여는 등 신장을 해부하다하는 데 사용할 수 있지만, 우리는 복벽을 열고 고정된하고 머리가 제거되면 전체 신장 액세스에서 가장 성공가 발생했습니다. 이러한 세포 유형 분리 및 작업하고자하는 모두 혈액 및 신장 연구자 절개 방법 중 하나를 사용할 수 있습니다. 그것은 지적되어야한다는 것을 분리하고 노력을 위해 우리가 설명하는 방법zebrafish 성인 신장과 g는 확실히이 장기의 해부은 생리학에서 노화에 이르기까지 다양한 주제에 대한 조사를 추구하는 이들 연구자에 대한 연구를 촉진 수, 성인 줄기 세포 생물학의 질문을 추구하고자하는 과학자에 국한되지 않습니다. 또한,이 방법은 molecularly 라벨 후 wildtype 또는 유전자 돌연변이 zebrafish 11 혈액이나 신장 세포의 이산 subpopulations 정화 공부을 줄 수있는만큼, 이러한 트렌스 제닉와 같은 다른 기술과 결합 수 있습니다. 줄기 및 전구 세포 유형 등 세부적인 정화 절차는 앞으로 자신의 행동을 규제하는 방법에 대해 얻는 지식에 필수적인 요소입니다 찾는 등 이식이나 전구 culturing으로 운영 테스트의 기초를 구성으로하는 이러한 세포의 힘과 정체성이 정의됩니다. 조혈 전구 문화 방식의 최근 발전 연구를위한 많은 새로운 아베를 열고 신장 인구 17 culturing 적응 수 있습니다. Zebrafish 화학 유전학이 HSCs 다양한 문맥 18-20에서 신장 progenitors을 조절하고, 위의 세포 생물학 기법와 함께 테스트를 유용한 수단으로 계속 경로의 식별에 성공했습니다. 함께 촬영이 zebrafish 모델을 이용하여 혈액 및 신장학 분야에 혁신적인 기여의 숫자를 해왔으며이 무대에서 연구를 계속은 오는 년 휘두르다 추가 transformative 통찰력을 약속드립니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
점차적으로 지난 10 년간 성인 zebrafish이 절개 기법을 모양이 전략을 개발하기 위해 도움이 그들의 수많은 공헌을위한 Zon 및 데이비슨 연구 실험실의 구성원에게 감사 RAW 기원합니다. 또한, 우리는 zebrafish 콜로니 우수한 지속적인 축산 관리를 제공하는 Zebrafish 연구 노틀담 센터의 직원에게 우리의 감사를 표현하고 싶습니다. RAW는 NIH - NIDDK 부여 보너스 DK083512에서 연구 자금을 얻고, 그리고 노트르담 대학에서 관대한 실험실 시작 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Dissection angled forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5058 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Stocum, D. L., Zupanc, G. K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).
- Zon, L. I.
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I.
- Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106, 534-541 (2005).
- Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).
