Summary
O rim zebrafish é o lar de ambos renal e hematopoiéticas tronco adultas / progenitoras das células, e representa uma excelente oportunidade para estudar essas células tipos e seus descendentes em um organismo modelo vertebrados. Aqui, nós demonstramos um procedimento de dissecação detalhada que permite ao pesquisador identificar e remover cirurgicamente o rim zebrafish adulto, que pode ser usado para aplicações como isolamento de células, transplantes, e estudos de expressão de rim e / ou populações de células do sangue.
Abstract
Investigadores que trabalham no campo emergente da biologia de células estaminais adultas procuram entender os sinais que regulam o comportamento ea função das células tronco durante a homeostase normal e estados de doença. A compreensão das células-tronco adultas tem amplas implicações para o futuro chegar de uma medicina regenerativa. Por exemplo, um melhor conhecimento sobre a biologia das células estaminais adultas podem facilitar o desenho de estratégias terapêuticas em que órgãos são acionados para se curar ou mesmo a criação de métodos para órgãos de crescimento in vitro que podem ser transplantados para seres humanos 1. O peixe-zebra tornou-se um modelo animal poderosa para o estudo da biologia celular vertebrados 2. Houve uma extensa documentação e análise do desenvolvimento embrionário no zebrafish 3. Só recentemente os cientistas procuraram documento anatomia adultos e técnicas de dissecção cirúrgica 4, como tem havido um movimento progressista dentro da comunidade zebrafish para ampliar as aplicações deste organismo de pesquisa para estudos com adultos. Por exemplo, há expansão dos interesses no uso de zebrafish para investigar a biologia de populações de células-tronco adultas e fazer modelos adultos sofisticados de doenças como o câncer 5. Historicamente, o isolamento do rim adulto zebrafish tem sido fundamental para o estudo da hematopoiese, como o rim é a localização anatômica da produção de células sanguíneas em peixes 6,7. O rim é composto de unidades de néfrons funcionais encontradas em arranjos arborizada, cercada por tecido hematopoiético que está disperso por todos os espaços de intervenção. O componente hematopoiético é constituído por células-tronco hematopoéticas (HSCs) e seus descendentes que habitam o rim até que diferenciar terminal 8. Além disso, sabe-se agora que um grupo de renal tronco / progenitoras (RPCs) também habitam o órgão rim paulistinha e permitir que tanto a regeneração do rim e do crescimento, como observado em outras espécies de peixes 9-11. À luz desta nova descoberta, o rim zebrafish é um órgão que abriga a localização de duas oportunidades para tronco adultas estudos de biologia celular. É claro que muitas questões pendentes poderiam ser bem servida com este sistema experimental. Para incentivar a expansão desse campo, é benéfico para documentar métodos detalhados de visualizar e, em seguida, isolar o órgão rim adulto zebrafish. Este protocolo detalhes nosso procedimento para dissecção do rim adultos de ambos os animais unfixed e fixos. Dissecção do órgão renal pode ser usada para isolar e caracterizar células-tronco hematopoéticas e renal e seus filhos usando técnicas estabelecidas, como a histologia, separação de células ativadas por fluorescência (FACS) 11,12, 13,14 perfil de expressão, e transplante 11,15. Esperamos que a divulgação deste protocolo irá proporcionar aos pesquisadores com o conhecimento para implementar uma utilização mais ampla de estudos zebrafish que finalmente pode ser traduzido para aplicação humana.
Protocol
1. Dissecção do rim zebrafish adultos a partir de uma amostra de animais unfixed
- Selecione um peixe-zebra adulto entre 3-6 meses de idade para dissecção.
- Euthanize o peixe, colocando-o em um prato com 0,2% tricaina pH 7,0 por cerca de 4-5 minutos, observando com cuidado para ver que as brânquias e parar de se mover o coração pára de bater.
- Usando uma colher, retire o peixe do banho tricaina em uma pequena quantidade de solução, decantar a solução e gentilmente colocar o animal em uma toalha de papel.
- Use uma tesoura afiada dissecção para remover a cabeça do animal, fazendo um corte logo atrás do opérculo branquial (Figura 1, Um caminho). Descartar a cabeça em um recipiente de resíduos de risco biológico.
- Use a tesoura de dissecção para abrir o corpo do animal, fazendo uma longa incisão ventral, a partir da cabeça e terminando na cauda, na base da nadadeira caudal (Figura 1, B caminho).
- Remover os órgãos internos do animal usando um par de pinças de dissecção / forceps, e colocá-los no lixo de risco biológico. Tenha cuidado para não escovar a parede do corpo dorsal, pois este é o local do rim (Figura 2). Se você tiver selecionado um peixe fêmea, você terá de colher ovos em desenvolvimento fora da cavidade do corpo, que pode ser mais facilmente feito usando um par de pinças anguladas ou pinça.
- Use agulhas dissecção ao pino abrir as paredes do corpo a uma bandeja de dissecação, e ângulo os pinos para que o rim pode ser visualizado. O rim irá possuir uma forma característica (tronco, cabeça / cauda sela) e cor, sendo intercaladas com pigmentação em tons preto (Figura 2). Você também pode ver a aorta cheio de sangue periférico, que passa pela linha média da estrutura do órgão.
- Use uma pinça fina para separar o rim da parede dorsal do corpo, usando um par de fórceps para tirar o rim como você separa o órgão a partir do tecido conjuntivo que a fundamentam.
- Delicadamente, coloque o rim para o veículo desejado para posterior estudo de células vivas, tais como um tubo de microcentrífuga contendo PBS 1x para a preparação FACS.
2. Preparação e dissecção do rim zebrafish adultos a partir de uma amostra de animais fixos
- Prepare uma solução de 4% PBST paraformaldehyde/1X. Ferva a solução para dissolver o PFA em solução, então resfriar a mistura para 4 ° C e adicionar dimetilsulfóxido 0,1%. Tivemos o maior sucesso com a preservação do tecido do uso de soluções acabadas de fazer PFA em oposição a alíquotas congeladas. Faça solução suficiente para submergir o peixe-zebra adulto durante a dissecção.
- Encha uma bandeja de dissecação com solução de fixação suficiente para submergir o peixe-zebra adulto durante a dissecção. Nós execute as etapas subseqüentes com esta bandeja posicionada sob o microscópio, o que pode ser colocado em um capuz químico para minimizar a exposição ao odores fixação.
- Selecione um peixe-zebra adulto entre 3-6 meses de idade para dissecção.
- Euthanize o peixe, colocando-o em um prato com 0,2% tricaina pH 7,0 por cerca de cinco minutos, observando com cuidado para ver que as brânquias e coração parar de bater.
- Usando uma colher, retire o peixe do banho tricaina em uma pequena quantidade de solução, decantar a solução e gentilmente colocar o animal em uma toalha de papel.
- Use uma tesoura afiada dissecção para remover a cabeça do animal, fazendo um corte logo atrás do opérculo branquial (Figura 1, Um caminho). Descartar a cabeça em um recipiente de resíduos de risco biológico, e imediatamente colocar o animal na bandeja de dissecação PFA contendo.
- Use a tesoura de dissecção para abrir o corpo do animal, fazendo uma longa incisão ventral, a partir da cabeça e terminando na cauda, na base da nadadeira caudal (Figura 1, B caminho), e manter o corpo parcialmente submerso durante o procedimento.
- Remover os órgãos internos do animal usando um par de pinças de dissecção / forceps, e colocá-los no lixo de risco biológico. Tenha cuidado para não escovar a parede do corpo dorsal, pois este é o local do rim (Figura 2).
- Use agulhas dissecção ao pino abrir as paredes do corpo, e os pinos ângulo de modo que o rim pode ser visualizado. O rim irá possuir uma forma característica (cabeça, sela, cauda) e cor, sendo intercaladas com pigmentação em tons preto (Figura 2). Você também pode ver a aorta cheio de sangue periférico, que passa pela linha média da estrutura do órgão.
- Fixar a amostra durante a noite, colocando a bandeja a 4 ° C, quando você é feito com amostras de organizar o desejado.
- No dia seguinte, retire a solução PFA da bandeja e substituir com 1x PBST.
- Use uma pinça fina para retirar cuidadosamente o rim da parede dorsal do corpo, usando um par de fórceps para tirar o rim como você separa o órgão a partir do tecido conjuntivo que a fundamentam. O tecido renal será macio e flexível do DMSO na solução fixadora, tornando possível para dissecar o órgão rim inteiro em uma única peça.
- Use um amplofuro pipeta de transferência para colocar o rim em um tubo de microcentrífuga.
- O rim pode agora ser processada posteriormente para realizar montagem histológica ou toda em estudos de expressão gênica situ com base no estudo desejado.
3. Resultados representativos:
Os passos que estão diagramadas na Figura 1 indicam o procedimento de dissecção. O rim pode ser identificada com base na sua forma característica e coloração, e localização anatômica na parede dorsal da cavidade corporal do animal, como mostrado na Figura 2. Após a dissecção de um rim montagem amostra fixa, toda a hibridização in situ pode ser usado para localizar a expressão de um gene de interesse, como mostrado na Figura 3.
Figura 1: Procedimento que permite o acesso direto para dissecar o rim adulto zebrafish. (A) zebrafish Euthanized é dissecado de forma gradual (indicados por números e setas) para dar ao pesquisador o acesso mais fácil ao órgão renal completa. Imagens da cavidade abdominal antes (B) e depois (C) a remoção dos órgãos abdominais.
Figura 2:. Visualização do rim zebrafish em uma amostra unfixed Após a remoção de órgãos na cavidade do corpo, o rim aparece como um órgão único e achatado que é aderente à parede do corpo dorsal através de tecidos conjuntivos (A), e foi esquematizada (B) para mostrar a sua forma anatômica.
Figura 3: mount inteiro em hibridizações in situ realizadas em todo o órgão adulto rim. (A) cadherin17 transcrições são detectados no túbulo de néfrons renais de adultos, ampliada em (A '). (B) transcrições mafba estão localizadas tipos néfron proximal de células no rim adulto (compare a túbulo inteira no painel A). (B' ) Uma visão ampliada de expressão mafba revela que as transcrições são especificamente localizada no podócitos (P), as células do sangue filtro (glomérulo) e túbulo contornado proximal (PCT).
Discussion
Células-tronco adultas são componentes dinâmicos e essenciais que mantêm a forma corporal do adulto 1. Células-tronco adultas também pode servir para neutralizar os danos que a incorre corpo durante estados de doença e da disfunção ou perda de células-tronco adultas podem levar ao declínio da função do órgão e tem sido implicado a conduzir neoplasias malignas do câncer e contribuem para o envelhecimento. Células-tronco adultas apresentam propriedades celulares que os distinguem dos tipos de células diferenciadas. Após a divisão celular, as células-tronco adultas são capazes de auto-renovação ea produção de células progenitoras que, por sua vez pode dar origem a descendentes diferenciados distintas. Há um grande interesse em compreender os caminhos que regulam as decisões célula destino e potência de células-tronco adultas devido ao seu papel importante na homeostase do tecido 1. Por exemplo, cientistas, atualmente, muitos procuram identificar os sinais que mantêm várias populações de células-tronco adultas em seu nicho, ou microambiente especializado, e como este nicho é afetado por fatores humorais.
Adulto células-tronco hematopoéticas (HSCs) são células pluripotentes que o combustível o rejuvenescimento contínuo de células sangüíneas em animais 8. Hematopoese é um processo vibrante que está constantemente em curso durante a vida de um organismo vertebrado porque o maduro tipos de células diferenciadas do sangue são de curta duração e, portanto, devem ser repostos regularmente. Como eles se dividem, HSCs suprir esta demanda crucial de auto-renovar e produzir uma série de progenitores que dão origem ao eritróide, megacariócitos linhagens, linfóide e mielóide. Cada um destes tipos de células do sangue executa funções originais na circulação, incluindo o fornecimento de troca gasosa para o tecido, uma forma de selar ferimentos aos vasos sanguíneos através da formação de coágulos, ou mecanismos de defesa contra patógenos invasores. Enquanto HSCs foram reconhecidos por muitos anos, uma infinidade de questões fascinantes permanecem sem resposta sobre essas células incrível. Estudos recentes identificaram subclasses de HSCs com diferentes longo prazo auto-renovação propriedades, e da elucidação dos componentes do nicho e sinais que modulam o comportamento HSC 8. O peixe-zebra é agora entre os pilares da hematopoiese paradigmas de investigação, com base nos atributos genéticos e moleculares deste modelo animal 8. Pesquisa utilizando o zebrafish levou a novas percepções sobre a biologia HSC que são conservados com os vertebrados superiores, como mamíferos, enfatizando a importância de investigações biomédicas peixes de sangue 8.
Historicamente, o conhecimento sobre HSCs abriu o caminho para as expedições que procuram descobrir se outros órgãos do corpo são mantidos por células-tronco adultas. Numerosas populações de células-tronco adultas são agora apreciada a existir, variando através de diversas estruturas do cérebro para o intestino, pele e músculo esquelético. Esforços contínuos na área de células-tronco procurar identificar como as células-tronco adultas e até mesmo outros tipos de células diferenciadas pode exibir a potência reforçada em várias configurações.
Com relação ao rim, tem havido grande debate entre os nefrologistas para saber se existem células-tronco renal 16. Descobertas independentes têm documentado populações de células renais de mamíferos que possuem diferentes graus de potencial regenerativo, mas um entendimento coeso desses relatórios ainda não foi alcançado. Curiosamente, há fortes evidências para apoiar a noção de que muitas espécies de peixes possuem células que podem robustamente combustível regeneração dos néfrons danificadas, bem como crescer néfrons inteiramente novo na fase adulta 9. Recente trabalho identificou as características moleculares das células-tronco adultas renal no zebrafish 10,11, e demonstrou a potência auto-renovação desses chamados renal tronco / progenitoras (RPCs) 11. Futuros estudos são necessários para verificar se células do rim análogas estão presentes nos mamíferos. No entanto, as investigações continuaram sobre os mecanismos celulares e moleculares que regulam RPCs peixes pode fornecer insights sobre como proezas regenerativa pode ser estimulada no rim de mamíferos. É evidente que ainda há muito a ser entendido sobre RPCs, e que muitas ferramentas agora disponíveis para o pesquisador zebrafish podem ser implementadas para enfrentar essas questões intrigantes.
Neste protocolo, descrevemos o nosso método para a identificação e dissecção anatômica do rim zebrafish adulto. Medidas alternativas podem ser usadas para dissecar o rim, tais como a abertura da cavidade abdominal ventral com uma incisão com uma tesoura de dissecção, no entanto, encontramos o maior sucesso no acesso a todo o rim quando a parede abdominal está preso aberta ea cabeça é removida. Sangue e rins pesquisadores tanto que desejam isolar e trabalhar com esses tipos de células pode usar o método de dissecação. Note-se que o método que descrevemos para isolar e working com o rim adulto zebrafish certamente não é limitada a cientistas que desejam seguir perguntas da biologia de células-tronco adultas, como a dissecção deste órgão pode facilitar os estudos para os pesquisadores de uma investigação sobre temas que vão desde a fisiologia do envelhecimento. Além disso, este método pode ser combinada com outras tecnologias, como os transgênicos, de modo a molecularmente rótulo e, em seguida, purificar e estudar subpopulações discretas de sangue ou de células de rim tipo selvagem ou mutante geneticamente zebrafish 11. Olhando para a frente, como procedimentos de purificação detalhada dos tipos de células-tronco e progenitoras é vital para ganhar o conhecimento sobre como seu comportamento é regulado, como testes operacionais, tais como transplante ou cultura progenitor constituem a base pela qual a potência e identidade dessas células é definido. Recentes avanços em métodos de cultura de células progenitoras hematopoéticas abrir muitas novas avenidas para o estudo, e pode ser adaptado a cultura das populações renal 17. Genética zebrafish químicos têm sido bem sucedidos na identificação de vias que modulam HSCs e progenitores renal em vários contextos 18-20, e continuará a ser uma avenida útil para testar em combinação com as técnicas de biologia celular acima. Tomados em conjunto, tem havido uma série de contribuições inovadoras para os campos de hematologia e nefrologia utilizando o modelo peixe-zebra, e continuou a pesquisa nessas arenas promessas de exercer maior entendimento de transformação nos próximos anos.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Desejos RAW de agradecer aos membros da Zon e da pesquisa Davidson laboratórios para suas inúmeras contribuições para ajudar a desenvolver estratégias que têm vindo progressivamente a forma esta técnica de dissecação de peixe-zebra adulto ao longo da última década. Além disso, queremos expressar nossa gratidão aos membros do pessoal da Notre Dame Centro de Pesquisa Zebrafish para prestação de cuidados de manejo em curso excelente para a nossa colônia zebrafish. RAW obteve financiamento da investigação a partir da atribuição da subvenção NIH-NIDDK DK083512, e de laboratório generoso financiamento start-up da Universidade de Notre Dame.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Dissection angled forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5058 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Stocum, D. L., Zupanc, G. K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).
- Zon, L. I. Developmental biology of hematopoiesis. Blood. 86, 2876-2891 (1995).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. Mutant-specific gene programs in the zebrafish. Blood. 106, 521-530 (2005).
- Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106, 534-541 (2005).
- Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).
