Подготовка Подрезанный Модель Посттравматическое Epileptogenesis в Грызунов

Summary

Частично изолированные коры ("подрезать") является эффективной модели животных посттравматических epileptogenesis. Здесь мы показываем, как сделать новый хирургический устройство и использовать его для создания более точных и последовательных поражений для создания этой модели.

Abstract

Частично изолированные коры ("подрезать") является животной модели посттравматического epileptogenesis. Хирургическая процедура включает в себя, проходящем через сенсомоторной коры и под белого вещества (подрезать), так что определенной области коры головного мозга в значительной степени изолированы от соседних коры и подкорковых областях ^1-3. После задержки двух и более недель после операции, эпилептиформные разряды могут быть записаны в мозг ломтики от грызунов ^1, а электрические или припадки поведение можно наблюдать в естественных условиях от других видов, таких как кошки и обезьяны ^4-6. Это хорошо организованной животной модели эффективно генерировать и имитирует несколько важных характеристик черепно-мозговой травмой. Тем не менее, технически сложных пытается сделать точный корковых поражений в маленьком мозге грызунов при свободной рукой. На основе процедуры первоначально создан в лаборатории доктора Дэвида принца в Стэнфордском университете ^1, здесь мы представляем улучшение техники для выполнения операции по подготовке этой модели у мышей и крыс. Мы показываем, как сделать простые хирургические устройства и использовать его для получения лучшего контроля глубины резания и угла для получения более точных и последовательных результатов. Устройство легко сделать, и процедуру быстро учиться. Поколение этой модели животных обеспечивает эффективная система для исследования механизмов посттравматических epileptogenesis.

Protocol

1. Создание простого устройства для подрывает хирургии

1. Подрезать мы создали устройство состоит из трех частей (рис. 1): (1) опорной пластины из нержавеющей стали или пластика, что позволяет крепление руководящих трубки и игла, и сидит напротив черепа окна во время операции, (2) направляющая труба, которая держит иголку в положение и позволяет игле вращения, и (3) иглой, которая изгибается на 90 градусов при температуре ~ 3 мм от кончика, и подвижна вращением и вставки.
2. Отрежьте кусок 1-1.5 мм, 7 ~ 10 х 30 мм прямоугольные из нержавеющей стали или прозрачного пластика (1), чтобы сделать опорной пластины. Подготовка 1,5 дюйма 22 калибра (BD компании, # 305156) и 1,5 дюйма 25 калибра (BD компании, # 305127) иглы шприца. Для того, чтобы руководящие трубку, отрезал пластиковый конец и нижний кончик иглы из 22 калибра иглы шприца так, чтобы его общая протяженность составляет около 31-32 мм (2). Песок металлический наконечник, чтобы сделать ее ровной и гладкой. Окончательная длина этого руководящие трубка должна быть около 5-6 мм короче, чем 25-калибр иглы шприца.
3. Используйте цианакрилатного клея исправить руководящих трубки на опорной пластины, убедившись, что игла перпендикулярна краю металла.
4. Вставьте 25-калибровочного шприца иглу в руководящих трубки, и согните иглу на 90 градусов на 2,5-3 мм от наконечника (рис. 1).
5. Отрегулируйте вертикальное перемещение спектр иглы склеиванием небольшой пластиковой трубкой на до конца иглы (рис. 1, иглы остановка). Окончательный движущихся спектр иглы определяет, насколько глубоко иглы могут быть вставлены в коре, и должна быть 1,6-1,8 мм для P21 крыс и 1,3-1,5 мм для P21 мышей. Эта длина должна быть скорректирована для разных видов и возрастов животных.
6. Прикрепите небольшой медной проволоки или небольшой кусочек ленты на верхнем конце иглы в том же направлении, загнутым кончиком (рис. 1 стрелочного указателя). Проволоки или ленты указывает угол поворота иглы во время подрывает хирургии (рис. 1).

2. Животное подготовки

1. Все хирургические инструменты должны быть в автоклаве, стерилизуют стеклянные бусины-стерилизатор или дезинфицируют 70% этанола.
2. Мы используем Sprague / Dawley крыс в постнатальный возраст 20 - 22 дней (P20-22) или CD1 мышей в том же возрасте. Различные штаммы мышей и крыс могут быть использованы для конкретных проектов.
3. Обезболить мышь с IP-инъекции кетамина 80 мг / кг и ксилазина 8 мг / кг. Хирургическая процедура начинается после того, животное не реагирует на хвост щепотку. Во время операции, при необходимости, бустерной дозы одной трети оригинального дозу анестетика коктейля могут быть предоставлены для восстановления исходного состояния наркоза.
4. Cut волос на волосистой части головы животного с электрическим триммером волосы. Нанесите небольшое количество глазной мази на глазах животных для защиты от сухости во время анестезии. Лечить кожи головы с использованием 10% повидон-йод раствор, а затем на 70% этанола.
5. Горы животных на стереотаксического аппарата держать голову в стабильной фиксированном положении. На протяжении операции, мы держим животных на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение.
6. Сделать средней линии передне-задний разрез на коже головы с помощью скальпеля, простирающейся от лямбда между глазами. Используйте hemostats тянуть кожу в сторону, и выставить левую череп достаточно.
7. Сделать прямоугольного сечений на левой черепа, а также использовать скальпель, чтобы соскрести надкостницы. Этот шаг позволит снизить кровотечение и облегчить бурение на черепе.

3. Создание подрывает

1. Добавьте небольшое количество стерильного физиологического раствора к воздействию череп области, а затем использовать несколько Q-советы для очистки крови и сухой области.
2. Под хирургического микроскопа, начать бурение прямоугольный паз (~ 5 х 7 мм у крыс, 4 х 5 мм у мышей) по центру левой черепа (примерно над левой сенсомоторной коры). Применение капли солевого на черепе облегчает бурение и рассеивает тепло. После примерно 2 / 3 глубины кость сверлить, удалить избыток физиологического раствора и чистых буровых области с Q-Tip. Медленно и осторожно сверлить глубже, пока центр кусок кости подвижен на нежное прикосновение пинцета.
3. Осторожно снимите центральную часть кости, вставив острый кончик от щипцов на краю кости и медленно подъема щипцы подвергать левого полушария.
4. Под операционного микроскопа, удерживая подорвать устройство, и ориентироваться иголку в парасагиттальных направлении и опорной пластины перпендикулярно к средней линии, наклоняя устройство слегка каудально так, чтобы поддерживать визуализация кончика иглы и целевой зоны коры головного мозга. Цель кончике иглы область 1-2 мм латеральнее верхнего сагиттального шва, в середине черепа окна, и избегать прямого проникновения крупных сосудов.
5. Вставьте иглу в горизонтальном направлении через твердую мозговую оболочку и под мягкой, чтобы запасные кровеносные сосуды. Сядьте в нижней части подорвать устройствона обоих краях черепа окна так, чтобы игла расположена нормально к поверхности коры (рис. 1). Отдых устройства на обоих краях черепа окно вручную позволит значительно уменьшить или устранить дрожание рук во время следующей процедуры. Поднимите иглу под мягкой, затем медленно опустите ее для создания транскортикальной сократить до иглы не может идти глубже. Поворот ~ 135 ° от средней линии, чтобы создать полукруг белого вещества / глубоком слое VI подрезать. Затем поднять иглу снова под мягкой. Наклоните устройство обратно и вывести иглу.
6. При желании можно повторить описанную выше процедуру (шаг 2,5), но не поворачивая иглу так, чтобы создать дополнительные транскортикальной сократить на боковых краев окна. Это позволит создать более полную корковых изоляции.
7. Место кусок полиэтиленовой пленки (6 х 6 мм) на черепные окна для защиты, а шов кожи головы. Место животное на площадку нагревается до конца оправиться от наркоза.

4. Представитель результаты:

Корональные корковых ломтиками может быть подготовлен, чтобы подтвердить успех подрывает хирургии. В подготовленные ломтики> 2 недель после операции, транскортикальной и подорвать сокращений заметно при низких цель сила микроскопа (рис. 2). Частично изолированной коры обычно становится немного тоньше, и эпилептиформной активности могут быть обнаружены в большинстве корковых ломтики потенциала поля записи (рис. 3).

В отличие от этого, формирование большого отверстия в белом веществе или в глубоких слоях коры, драматические истончение коры пораженном, или странствующий сократить быть выше или ниже белого вещества сделает мозга непригодным для дальнейших экспериментов.

Рисунок 1. Структура и применение подорвать устройство. Направляющая труба (2), наклеиваются на опорной пластины (1), который сделан из нержавеющей стали или прозрачного пластика. Иглу шприца (3) вводится через трубку руководящих и согнуты в ~ 3 мм до кончика. Иглу остановить из пластика трубки наклеиваются на верхнем конце иглы, чтобы вертикального перемещения диапазона иглы ограничена до ~ 1,2 мм и ~ 1,5 мм для использования в P21 мышей и крыс соответственно. Сегмент малого медный провод крепится под ручку, как игла индикатора ориентации изогнутые иглы. Обратите внимание, что элемент находится под углом и в контакте с обеими краю черепа окна так, чтобы разрез может быть сделано параллельно пиальных поверхности.

Рисунок 2. Представитель образ подорвать срез. А. флуоресцентное изображение среза, который был подготовлен через две недели после поражения в подорвать P48 крысы. Режущие раны были помечены флуоресцентным красителем DII. Белые стрелки справа указывают транскортикальной вырезать, и стрелки на нижней указывают подрезать, которые прошли, хотя граница между слоем IV и белого вещества.

Рисунок 3. Потенциал поля записи с подорвать ломтик. Потенциала поля записи с подорвать срез мозга выставлены эпилептиформной активности, предполагая, возбудимость коры ранения ткани.

Discussion

Подрезать модель высокоэффективной системой для изучения посттравматического epileptogenesis. Типичная операция занимает около 20-30 минут до конца, и вызвал или спонтанной эпилептиформной активности могут быть записаны в срезах от большинства животных, через две недели после операции ^1-2. Что еще более важно, эта модель имитирует аспекты изменений после черепно-мозговой травмы, такие как кровотечение, воспаление, отек, axotomy и гибель нейронов ^7. Мало того, что эпилептиформной активности наблюдается у грызунов и других животных, но и эпилептические припадки были зарегистрированы у людей, которые страдают сопоставимых корковых поражений ^8. Значительный прогресс был достигнут выяснить основные механизмы, в последние годы. Спонтанное и вызвала межприступный эпилептиформных разрядов были зафиксированы в мозгу ломтиками> через 2 недели после поражения, и эти действия были признаны возникают в крысу коркового слоя V ^1. Свидетельство схему реорганизации, потеря ГАМКергических интернейронов и расторможенность, повышает возбудимость нейронов в мембраны, а также ростом возбуждающие синаптические связи также было продемонстрировано, в частности, коркового слоя V ^2,9-13.

Здесь мы ввели новый инструмент для создания подорвать поражений. Когда человек совершает операции с подорвать свободную руку, дрожание рук часто вызывает трудности в создании стабильного и точного корковых поражений. Хотя практика и опыт может улучшить качество хирургии, значительная изменчивость в глубину и качество поражения не существует. Устройство мы ввели здесь выгодно в трех аспектах. Во-первых, опираясь на краях черепа окна, устройства в значительной степени устраняет проблемы дрожание рук во время операции, что позволяет сделать гладкую прорезать тонкие ткани головного мозга. Во-вторых, глубина вставки иглы и углом поворота может быть тщательно контролируется, что позволяет сократить более четко и последовательно в белом веществе под слоем VI. В-третьих, поверхность коры полушарии искривлено: с медиальной выше, чем боковые стороны (рис. 1), что может привести отсутствие целевого белого вещества, если угол иглы не соответствующим образом скорректированы. По отдыха устройства на черепные окна, иглы наклонена в сторону, и угол резания автоматически регулируется так, что вращение иглы всегда параллельно поверхности коры и точного поражения получается (рис. 2). Одна потенциальная проблема с использованием этого устройства является то, что это может помешать прямой визуализации иглы под микроскопом. Эта проблема может быть решена, слегка наклоняя устройство в сторону каудальном направлении, когда проникающая пиальных и коры головного мозга. Как только игла опускается до белого вещества, устройство нуждается в корректировке, чтобы стать вертикально к поверхности коры, и остановились на черепе. В этот момент, глядя на стрелочного указателя достаточно для контроля иглы вращения. В общем, с этим ряд преимуществ и его относительная простота конструкции, подорвать модель станет более доступным и полезным для изучения посттравматического epileptogenesis.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Foredom micromotor kit	equipment	Foredom	K.1070
1.5 inch 22-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305156
1.5 inch 25-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305127
Cyanoacrylate glue	material	Ted Pella, Inc.	14450