הכנת דגם לערער של Epileptogenesis פוסט במכרסמים

Summary

קליפת המוח מבודד חלקית ("לערער") הוא מודל של בעל חיים יעיל epileptogenesis פוסט. כאן אנו מדגימים כיצד להפוך מכשיר כירורגי חדשני להשתמש בו כדי לבצע נגעים מדויקת יותר ועקבית כדי ליצור את המודל הזה.

Abstract

קליפת המוח מבודד חלקית ("לערער") הוא מודל של בעל חיים epileptogenesis פוסט. הליך כירורגי כרוך חיתוך דרך קליפת המוח הסנסורית מתחת החומר הלבן (לערער), כך אזור מסוים בקליפת המוח מבודד במידה רבה בקליפת השכנות ואזורים קורטיקליים ^1-3. לאחר ההשהיה של שבועיים או יותר לאחר הניתוח, הפרשות epileptiform יכול להיות מוקלט פרוסות המוח של מכרסמים ^1; והתקפים חשמל או התנהגות ניתן להבחין in vivo ממינים אחרים, כגון חתול קוף ^4-6. מודל זה מבוסס היטב חיה יעילה כדי ליצור מחקה מאפיינים חשובים של פגיעה מוחית טראומטית. עם זאת, הוא מאתגר מבחינה טכנית מנסה לעשות נגעים קורטיקליים המדויק במוח מכרסם קטן ביד חופשית. על פי הנוהל שנקבע בתחילה באוניברסיטת סטנפורד ¹ במעבדה של ד"ר דוד של הנסיך, כאן אנו מציגים טכניקה משופרת לבצע ניתוח להכנת מודל זה עכברים וחולדות. אנו מדגימים כיצד להפוך מכשיר כירורגי פשוט להשתמש בו כדי להשיג שליטה טובה יותר של חיתוך עומק וזווית להפיק תוצאות מדויקות יותר עקבית. המכשיר קל לעשות, ההליך הוא מהיר ללמוד. הדור של מודל זה החי מספק מערכת יעילה ללימוד על המנגנונים של epileptogenesis פוסט.

Protocol

1. הפיכת מכשיר פשוט לניתוח לערער

1. המכשיר לערער יצרנו מורכב משלושה חלקים (איור 1): (1) צלחת תמיכה עשוי פלדה אל חלד או פלסטיק המאפשר התקשרות של צינור המנחה מחט, והוא יושב מול החלון גולגולתי במהלך הניתוח, (2) צינור המנחה שמחזיק מחט במצב והיתרים סיבוב מחט; ו (3) מחט זה כפוף 90 מעלות בשעה 3 מ"מ ~ מקצה, והוא מטלטלין על ידי סיבוב הכניסה.
2. חותכים חתיכה של 1-1.5 מ"מ עובי, 7 ~ 10 x 30 מ"מ פלדה מלבני נירוסטה או פלסטיק שקוף (1) כדי להפוך את צלחת תמיכה. הכן 1.5 אינץ 22 מד (BD החברה, # 305156) ו 1.5 אינטש 25 מד (BD החברה, # 305127) מחט המזרק. כדי להפוך את צינור המנחה, לחתוך את הקצה פלסטיק קצה מחט התחתון של מחט 22-לאמוד את המזרק כך האורך הכולל שלה הוא כ - 31-32 מ"מ (2). בחול סוף מתכת כדי לעשות את זה שטוח וחלק. אורכו הסופי של צינור זה המנחה צריך להיות בערך 5-6 מ"מ קצר יותר מאשר מחט 25-לאמוד את המזרק.
3. השתמש בדבק cyanoacrylate לתקן את הצינור המנחה לצלחת תמיכה, ולוודא כי הוא המחט בניצב קצה המתכת.
4. הכנס את מחט מד 25-מזרק לתוך הצינור המנחה, לכופף את המחט 90 מעלות 2.5-3 מ"מ מהקצה (איור 1).
5. התאם את טווח נע האנכית של המחט על ידי הדבקת צינורית פלסטיק קטנה אל הקצה את המחט (איור 1, לעצור את המחט). הטווח נע הסופי של המחט קובע כמה עמוק את המחט יכול להיות מוכנס לתוך קליפת המוח, ויש 1.6-1.8 מ"מ עבור p21 חולדות 1.3-1.5 מ"מ עבור p21 בעכברים. אורך זה צריך להיות מותאם המינים בגילאים שונים של בעלי חיים.
6. צרף חוטי נחושת קטנים או חתיכה קטנה של סרט אל הקצה העליון של המחט באותו כיוון כמו קצה כפופות (תמונה 1 אינדיקטור מחט). חוט או סרט מציין את זווית מפנה של המחט במהלך הניתוח לערער (איור 1).

2. בעלי חיים הכנה

1. כל מכשירי ניתוח צריך להיות autoclaved, מעוקר עם מעקר חרוזי זכוכית, או לחטא עם אתנול 70%.
2. אנו משתמשים ספראג / Dawley חולדות בגיל הלידה 20-22 ימים (P20-22) או CD1 עכברים באותו גיל. זנים שונים של עכברים או חולדות עשוי לשמש לפרויקטים ספציפיים.
3. להרדים את העכבר עם זריקה ip של קטמין 80 מ"ג / ק"ג ו xylazine 8 מ"ג / ק"ג. הליך כירורגי מתחיל אחרי החיה אינו מגיב קמצוץ הזנב. במהלך הניתוח, במידת הצורך, במינון של המאיץ שליש מנה המקורי של קוקטייל ההרדמה יכולה להינתן כדי לשחזר את המצב המקורי הרדמה.
4. חותכים את השיער על הקרקפת של החיה עם גוזם שיער חשמלי. למרוח כמות קטנה של משחה עיניים על העיניים של החיה להגנה מפני יובש במהלך ההרדמה. לחטא את הקרקפת בעזרת 10% povidone-יוד פתרון, ואחריו אתנול 70%.
5. הר חיה על מנגנון stereotaxic לשמור את הראש בתנוחה קבועה ויציבה. במהלך הניתוח, אנו שומרים את החיה על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה.
6. ביצוע חתך קו האמצע קדמית, אחורית על הקרקפת בעזרת אזמל, המשתרעת למבדה אל בין העיניים. השתמש hemostats למשוך את העור בצד שמאל לחשוף את הגולגולת מספיק.
7. ביצוע חתך מלבני בגולגולת משמאל, ולהשתמש אזמל כדי לגרד periosteum. צעד זה יקטין דימום להקל קידוח בגולגולת.

3. ביצוע פוגע

1. הוספת כמות קטנה של תמיסת מלח סטרילית על לאזור גולגולת חשופה, ולאחר מכן להשתמש Q-כמה טיפים כדי לנקות דם יבש את האזור.
2. תחת מיקרוסקופ כירורגי, להתחיל קידוח חריץ מלבני (~ 5 x 7 מ"מ בחולדות, 4 x 5 מ"מ בעכברים) על מרכז הגולגולת שמאל (כ לעיל שמאל הסנסורית הקורטקס). מריחת טיפה של מלח על הגולגולת מאפשר קידוח החום מתפוגג. אחרי עומק כ 2 / 3 של העצם הוא קדח, להסיר עודף מלח לנקות את אזור הקידוח עם Q-קצה. לאט לאט ובזהירות לקדוח עמוק עד פיסת מרכז העצם ניד על מגע עדין של מלקחיים.
3. מוציאים בזהירות את פיסת המרכזי של עצם על ידי הוספת טיפ חדה של מלקחיים על קצה העצם ולאט לאט מרימים את מלקחיים לחשוף את האונה השמאלית.
4. תחת מיקרוסקופ כירורגי, תקרב את המכשיר לערער, ​​וכן לכוון את המחט לכיוון parasagittal ואת בניצב צלחת תומכת את המכשיר קו האמצע, הטיית מעט caudally כדי לשמור על ויזואליזציה של קצה המחט לאזור היעד קליפת המוח. כוון את קצה המחט מ"מ שטח 1-2 לרוחב תפר sagittal מעולה, באמצע החלון גולגולתי, ולמנוע חדירה ישירה של כלי גדול.
5. הכנס את המחט בכיוון אופקי דרך הדורה ומתחת פיא כדי לחסוך כלי הדם. שב התחתון של המכשיר לערערעל שני הקצוות של החלון גולגולתי כך המחט ממוקם נורמלי אל פני השטח קליפת המוח (איור 1). די להציב את המכשיר על שני הקצוות של חלון הגולגולת ביד יהיה להקטין באופן משמעותי או לחסל ביד רועדת במהלך ההליך הבא. הרימו את המחט אל מתחת פיא, ואז לאט לאט להוריד אותו כדי ליצור חתך transcortical עד המחט לא יכול ללכת יותר עמוק. סובב ~ 135 ° הרחק קו האמצע כדי ליצור עניין חצי עיגול לבן / שכבה VI עמוק לערער. ואז להעלות את המחט שוב ​​מתחת פיא. הטה את המכשיר לאחור לשלוף את המחט.
6. לחלופין, אפשר לחזור על התהליך הנ"ל (שלב 2.5), אבל מבלי להפוך את המחט כדי ליצור חתך transcortical נוספים בקצוות לרוחב החלון. פעולה זו תיצור בידוד קליפת המוח שלם יותר.
7. מניחים פיסת סרט פלסטי (6 x 6 מ"מ) על גבי החלון גולגולתי עבור הגנה תפר את הקרקפת. מניחים את חיה על משטח לוהט עד התאושש לחלוטין מן ההרדמה.

4. נציג התוצאות:

פרוסות קליפת המוח העטרה יכול להיות מוכן לאשר את ההצלחה של הניתוח לערער. ב פרוסות מוכן> 2 שבועות לאחר הניתוח, חותך transcortical ולערער ניכרים תחת המטרה צריכת חשמל נמוכה של מיקרוסקופ (איור 2). קליפת המוח מבודד חלקית בדרך כלל הופך מעט דק יותר, ופעילות epileptiform ניתן להבחין ברוב של פרוסות קליפת המוח עם הקלטה שדה פוטנציאלי (איור 3).

ב היווצרות לעומת זאת, חורים גדולים בחומר הלבן או בשכבות קליפת המוח עמוק, דרמטי דילול של קליפת lesioned, או לחתוך תועה להיות מעל או מתחת החומר הלבן במוח יגרום שמיש עבור ניסויים נוספים.

באיור 1. מבנה היישום של התקן לערער. צינורית המנחה (2) מודבק על גבי צלחת תמיכה (1) כי הוא עשוי נירוסטה או פלסטיק שקוף. מחט מזרק (3) מוחדר דרך צינורית המנחה והתכופף על 3 מ"מ ~ אל קצה. מחט להפסיק עשוי צינור פלסטיק מודבק על הקצה העליון של המחט כך נעים בטווח האנכית של המחט מוגבל ל 1.2 מ"מ ו ~ ~ 1.5 מ"מ לשימוש p21 עכברים וחולדות בהתאמה. קטע של חוט נחושת קטן מהודק מתחת לידית כאינדיקטור מחט על הכיוון של המחט כפופות. שים לב כי המכשיר מוטה ו במגע עם קצה שני של החלון גולגולתי כך חתך יכול להתבצע במקביל למשטח pial.

איור 2. תמונה מייצגת של פרוסת לערער. א תמונה פלורסנט פרוסת כי הוכנה שבועיים לאחר הנגע לערער על עכברוש P48. הפצע חיתוך סומן על ידי DiI פלורסנט לצבוע. חצים לבנים על הזכות להצביע לחתוך transcortical, ואת החצים בתחתית לערער עולה כי למרות עברו את הגבול בין שכבה IV ו החומר הלבן.

איור 3. הקלטה שדה פוטנציאליים פרוסה לערער. שדה הקלטה פוטנציאליים פרוסה המוח לערער הציג פעילות epileptiform, דבר המצביע על לרגשנות יתר של רקמת קליפת המוח נפגע.

Discussion

המודל לערער היא מערכת היעילה ביותר ללימוד epileptogenesis פוסט. ניתוח טיפוסי לוקח רק כ 20-30 דקות לסיום, והוא עורר או פעילות ספונטנית epileptiform יכול להיות מוקלט פרוסות מרוב חיות שבועיים לאחר הניתוח ^1-2. וחשוב יותר, המודל הזה מחקה ההיבטים של השינויים הבאים פגיעה מוחית טראומטית, כגון דימום axotomy דלקת, בצקת ומוות עצבי ^7. לא רק פעילות epileptiform נצפו מכרסמים וחיות אחרות, אלא גם התקפים אפילפטיים תועדו אצל בני אדם הסובלים נגעים קורטיקליים דומים ^8. התקדמות משמעותית נעשתה על מנת להבהיר את המנגנונים בשנים האחרונות. ספונטנית ועוררה הפרשות interictal epileptiform נרשמו פרוסות המוח> 2 שבועות לאחר הפגיעה, ואת פעילויות אלה נמצאו מקורן שכבת עכברוש קליפת המוח V ^1. עדויות של ארגון מחדש במעגל, אובדן interneurons GABAergic ו disinhibition, עליות רגישות עצבית הממברנה, ועלייה צימוד סינפטיים מעוררים גם הוכח, בעיקר בקליפת המוח שכבה V ^2,9-13.

הצגנו כאן מכשיר רומן להכנת נגעים לערער. כאשר אחד מבצע ניתוח לערער ביד חופשית, ביד רועדת לעיתים קרובות גורמת קושי בקבלת נגעים קורטיקליים יציב ומדויק. למרות התרגול והניסיון עשויים לשפר את איכות הניתוח, השתנות משמעותית עומק ואיכות נגעים קיים. המכשיר הצגנו כאן מועילה בשלושה היבטים. ראשית, על ידי הצבת בשולי החלון גולגולתי, המכשיר מבטל במידה רבה את הבעיה של יד רועדת במהלך הניתוח, ובכך ניתן לבצע קיצוץ חלקה דרך רקמת המוח העדינה. שנית, את עומק החדרת המחט ואת מידת הסיבוב יכול להיות נשלט בתשומת לב, המאפשר לחתוך בדיוק רב יותר באופן עקבי בחומר הלבן מתחת לשכבה VI. שלישית, על פני השטח של קליפת המוח באונה עקום: עם המדיאלי להיות גבוה יותר מאשר הצד לרוחב (איור 1), אשר יכול לגרום חסר החומר הלבן ממוקד אם הזווית של המחט אינה בהתאם. ידי הנחת המכשיר על החלון גולגולתי, המחט מוטה רוחבית, ואת זווית חיתוך מותאם באופן אוטומטי, כך הסיבוב של המחט הוא תמיד במקביל על פני השטח של קליפת המוח ואת הנגע מדויק מתקבל (איור 2). בעיה אחת עם פוטנציאל שימוש במכשיר זה היא שזה עלול להפריע להדמיה ישירה של המחט מתחת למיקרוסקופ. בעיה זו ניתן לפתור על ידי הטיית המכשיר מעט לכיוון הזנב, כאשר חודר pial לבין קליפת המוח. ברגע מחט הוא הוריד את החומר הלבן, המכשיר צריך להיות מותאם כדי להפוך אנכית למשטח קליפת המוח, ונח על הגולגולת. בנקודה זו, מסתכל מחוון מחט מספיק כדי לפקח על סיבוב המחט. לסיכום, עם אלה מספר יתרונות וקלות היחסי של הבנייה, מודל לערער יהפוך לנגיש יותר ושימושי ללימוד epileptogenesis פוסט.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Foredom micromotor kit	equipment	Foredom	K.1070
1.5 inch 22-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305156
1.5 inch 25-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305127
Cyanoacrylate glue	material	Ted Pella, Inc.	14450