げっ歯類で心的外傷後てんかん原のアンダーカットモデルを準備

Summary

部分的に分離された皮質が（"アンダーカット"）外傷後てんかんの効率的な動物モデルである。ここでは、新たな外科手術デバイスを作成し、このモデルを生成するために、より正確で一貫性のある病変を作ってそれを使用する方法を示します。

Abstract

部分的に分離された皮質が（"アンダーカット"）外傷後てんかんの動物モデルである。外科手術は大脳皮質の特定領域は、主に隣接する皮質と^1-3皮質下の領域から分離されるように（アンダーカット）の白質の下に感覚運動皮質を切開して行います。手術後2週間以上の待ち時間の後に、てんかん様放電は、げっ歯類¹からの脳切片に記録することができ、電気的または行動発作は、ネコやサル^4-6と他の種からin vivoで観察することができます。この確立された動物モデルは、生成するために効率的ですし、外傷性脳損傷のいくつかの重要な特徴を模倣しています。しかし、それは技術的にフリーハンドを持つ小型の齧歯類の脳で正確な皮質病変を作るしようと挑戦している。最初にスタンフォード大学¹でデビッドプリンスの研究室で確立された手順に基づいて、ここで我々はマウスおよびラットにおけるこのモデルの準備のための手術を実行するための改良手法を提案。我々は単純な手術装置を作ると、より正確で一貫性のある結果を生成するために深さと角度を切るのよりよい制御を得るためにそれを使用する方法を示します。デバイスは、作るのは簡単です、と手順を学ぶために迅速です。この動物モデルの生成は、外傷後てんかん発生のメカニズムに関する研究のための効率的なシステムを提供します。

Protocol

1。アンダーカット手術のためのシンプルなデバイスを作る

1. 我々が作成したアンダーカット装置は三つの部分（図1）で構成されています：誘導管の添付ファイルと針を可能にし、手術中に頭蓋窓を介して座っているステンレススチールまたはプラスチック製（1）支持板（2）位置および許可の針の回転で針を保持する誘導管、および先端から約3 mmに90度曲がっている（3）針、および回転および挿入によって移動可能である。
2. 支持板を作るために厚さ1〜1.5ミリメートルの一部、7〜10 × 30ミリメートルの長方形ステンレス製または透明プラスチック（1）カット。 1.5インチ22ゲージ（BD会社、＃305156）と1.5インチの25ゲージ（BD会社、＃305127）シリンジの針を準備します。誘導管を作るために、プラスチックの端とその合計の長さが31〜32ミリメートル（2）についてになるように22ゲージの注射針の下針の先端を切断。砂、金属の端を、それが平らで滑らかにする。この誘導管の最後の長さは25ゲージの注射針に比べ約5〜6ミリメートル短くしてください。
3. 針は、金属のエッジに対して垂直であることを確認し、支持板の上に誘導管を固定するシアノアクリレート接着剤を使用してください。
4. 誘導管に25ゲージ注射針を挿入し、先端（図1）2.5〜3ミリメートルで針を90度曲げる。
5. 針の上の端（図1、針の停止）に接着する小さなプラスチック製のチューブで針の垂直方向の移動範囲を調整します。針の最終的な移動範囲は、針を皮質に挿入する方法を深く決定し、P21ラットとP21マウスの1.3〜1.5ミリメートルのための1.6〜1.8ミリメートルでなければなりません。この長さは、異なる種や動物の年齢のために調整する必要があります。
6. 曲がった先端（図1針の指標）と同じ方向に針の上端に小さな銅線またはテープの小片を取り付けます。ワイヤーやテープは、アンダーカット手術（図1）中の針の回転角度を示します。

2。動物の準備

1. すべての手術器具は、ガラスビーズ滅菌器、または70％エタノールで消毒と滅菌、オートクレーブする必要があります。
2. 同じ年齢で22日間（P20 - 22）またはCD1マウスに - 私たちは、出生後20歳でのSprague / Dawleyラットを使用してください。マウスやラットの異なる株は、特定のプロジェクトのために使用することができます。
3. ケタミン80 mg / kgとキシラジン8 mg / kgの腹腔内注射したマウスを麻酔。動物は、尾のピンチに応答しない後に手術が開始されます。手術中は、必要に応じて、麻酔薬のカクテルの三分の一元用量のブースター投与量は、元の麻酔の状態を復元するために与えることができます。
4. 電気毛のトリマーと動物の頭皮の毛をカット。麻酔中の乾燥からの保護のための動物の眼に眼軟膏の少量を適用します。 70％エタノールに続く10パーセントポビドンヨード溶液を、使用して頭皮を消毒する。
5. 安定した固定位置に頭部を保持する定位固定装置の上に動物をマウントします。手術中、私たちは低体温を防ぐために加熱パッドで動物を維持する。
6. ラムダから目の間に伸びる、メスを用いて頭皮上正中前後切開を加えます。わきの皮膚を引っ張ると十分に左頭蓋骨を露出させる止血を使用してください。
7. 左頭蓋骨の長方形のカットを確認し、骨膜を掻きにメスを使用。このステップでは、出血を減らし、頭蓋骨にドリルを容易にするでしょう。

3。アンダーカットを作る

1. 露出した頭蓋骨のエリアへの滅菌生理食塩水を少量追加し、その後、血液をきれいにし、エリアを乾燥させるいくつかの綿棒を使用してください。
2. 手術用顕微鏡下で、左側の頭蓋骨の中心（約左感覚運動皮質上記）の長方形の溝（ラットでは〜5 × 7 mmの、マウスの4 × 5 mm）を掘削開始。頭蓋骨に生理食塩水の滴を適用すると、掘削を容易にし、熱を放散する。掘削された骨の約2 / 3の深さの後に、過剰な生理食塩水を削除し、Q -ティップで掘削エリアを清掃してください。骨のセンターピースは、鉗子の優しいタッチ時に移動可能になるまで、ゆっくりと慎重に深くドリル。
3. 慎重に骨の縁に鉗子の鋭い先端を挿入し、ゆっくりと左半球を公開するために鉗子を持ち上げて、骨の中央部分を削除してください。
4. 手術用顕微鏡下で、針の先端とターゲット皮質領域の可視化を維持するために矢状方向に針と正中線への支持プレートに垂直、傾斜デバイス少し尾側アンダーカットデバイスをホールドし、向き。頭蓋窓の真ん中に、上矢状縫合の外側領域に1〜2ミリメートルに針の先端を目指し、大型船の直接侵入を避ける。
5. 血管を倹約するように硬膜を介してと軟膜下の水平方向に針を挿入します。アンダーカット装置の底部に座る頭蓋窓の両方のエッジ上に針を皮質表面（図1）に通常の配置されるように。手で頭蓋窓の両方のエッジでデバイスを置くと、大幅に、次の手順の実行中に手ぶれを軽減または排除されます。 PIAの下に針を持ち上げ、その後徐々に針が深く行くことができないまで、皮質間のカットを作成するために下げる。 °離れてVIは、アンダーカットの半円形の白質/深い層を作成するには、正中線から〜135を回転させる。その後、PIAの下に再び針を上げる。後方デバイスを傾け、針を撤回する。
6. それに付随して、上記の手順（ステップ2.5）繰り返すが、ウィンドウの横方向の端で追加の皮質間のカットを作成するように針を回すことなくできます。これにより、より完全な皮質分離が作成されます。
7. 保護のための頭蓋窓の上にプラスチックフィルム（6 × 6 mm）の部分を置き、頭皮を縫合。完全に麻酔から回復するまで加熱されたパッドの上に動物を置きます。

4。代表的な結果：

コロナ皮質スライスは、アンダーカット手術の成功を確認するために調製することができる。 > 2週間、手術後の準備のスライスでは、皮質間のとアンダーカットは、顕微鏡の低消費電力の目標（図2）の下に認められるです。部分的に分離された皮質は、通常わずかに薄くなり、てんかん様の活動は、フィールドの潜在的な記録（図3）と皮質スライスの大部分で検出することができます。

対照的に、白質のまたは深く皮質層に大きな穴、病変皮質の間伐劇的な、または上または下白質は、さらなる実験のための脳が使用できなくなるだろうという誤ったカットの形成。

図1。アンダーカット装置の構造と応用。導くチューブ（2）ステンレス鋼または透明プラスチックで作られて支持板（1）の上に接着される。注射針（3）先端まで〜3 mmの誘導管や曲がりが挿通されている。針は、プラスチックチューブ製の停止は、針の垂直方向の移動範囲が約1.2 mmとそれぞれP21マウスとラットでの使用のための〜1.5 mmに制限されているように、針の上端に接着される。小さな銅線のセグメントは、曲がった針の方向のための針の指標として、ハンドルの下に締結されている。カットが軟膜表面に平行に行われるようにデバイスを傾けると頭蓋窓のエッジの両方に接触していることに注意してください。

図2。アンダーカットスライスの代表画像。 P48ラットにおけるアンダーカットの病変の後二週間を作製したスライスのA.蛍光画像。カット傷は蛍光色素のDIIによって標識した。右側の白い矢印は、皮質間のカットを示しており、底部の矢印は、IV層と白質の間の境界も合格したことをアンダーカットを示している。

図3。アンダーカットの脳のスライスからアンダーカットスライス。フィールドの潜在的な録音からフィールドの潜在的な記録は、損傷した皮質組織の興奮を示唆し、てんかん様活性を示した。

Discussion

アンダーカットモデルは、心的外傷後てんかんを研究するための非常に効率的なシステムです。典型的な手術が終了するのは約20〜30分かかり、誘発または自発的なてんかん様活動二週間手術^1月2日後にほとんどの動物からのスライスに記録することができます。さらに重要なことは、このモデルでは、出血、炎症、浮腫、軸索切断や神経細胞死⁷などの外傷性脳損傷後の変化の側面を模倣している。だけでなく、てんかん様活動は、げっ歯類や他の動物で観察されているだけでなく、てんかん発作は、同等の皮質病変^8に苦しむヒトで報告されている。大きな進展は近年の基礎となるメカニズムを解明するためになされている。自発、誘発発作てんかん様放電は、> 2週間病変後の脳切片に記録されており、これらの活動は、ラット皮質層V ¹に由来することが見出された。回路の再編成、GABA作動性介在ニューロンと脱抑制の喪失、神経細胞の膜興奮性の増加、および興奮性シナプス結合の増加の証拠はまた、特に皮質層V ^2,9-13で、実証されている。

ここでは、アンダーカット病変を作るための新たな楽器を導入した。いずれかのフリーハンドでアンダーカット手術を実行すると、頻繁に手ぶれは、安定した正確な皮質病変を作ることが困難になります。実践と経験が手術の質を向上させる可能性がありますが、病変の深さと品質の大幅な変動が存在する。我々がここで紹介しているデバイスは、3つの面で有益です。最初に、頭蓋ウィンドウの端で休んで、デバイスは主にこういった可能繊細な脳組織を介してスムーズにカットをすること、手​​術中に手ぶれの問題を排除します。第二に、針の挿入と回転の度合いの深さは、層VIの下の白質で正確にそして一貫してカットすることが可能になる、慎重に制御することができます。第三に、半球皮質の表面が湾曲している：と内側針の角度が適切に調整されていない場合、ターゲット白質が不足して原因となる側面（図1）、より高くなる。頭蓋窓にデバイスを置くことにより、針が横方向に傾いている、と（図2）切削角度が自動的に針の回転は、常に皮質の表面に平行になるように調整されており、正確な病変が得られる。このデバイスを使用すると一つの潜在的な問題は、それが顕微鏡下で針の直接可視化を妨げる可能性があるということです。軟膜と皮質を貫通するとき、この問題は尾の方向に向かってわずかに傾斜装置によって解決することができます。とすぐに針が白質に低くなるにつれ、デバイスは、皮質表面に垂直になるように調整する必要があり、頭蓋骨に休まれた。この時点で、針のインジケータを見ると針の回転を監視するのに十分です。要約すると、これらのいくつかの利点と建設のその相対的な容易さで、アンダーカットモデルは、外傷後てんかんの研究のためのより多くのアクセスと便利になります。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Foredom micromotor kit	equipment	Foredom	K.1070
1.5 inch 22-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305156
1.5 inch 25-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305127
Cyanoacrylate glue	material	Ted Pella, Inc.	14450