Summary
부분적으로 격리 피질 ( "가격을 내리다") 외상후 epileptogenesis의 효율적인 동물 모델입니다. 여기 소설 수술 장치를 만들고이 모델을 생성하기 위해보다 정확하고 일관성있는 병변을 만들기 위해 그것을 사용하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
부분적으로 격리 피질 ( "가격을 내리다") 외상후 epileptogenesis의 동물 모델입니다. 수술은 sensorimotor 피질과 대뇌 피질의 특정 영역이 크게 인근 피질과 subcortical 지역 1-3에서 격리되도록 흰색 물질 (아래 부분을 잘라냄) 아래에. 통해 절단 포함 수술 다음과 같은 두 개 이상의 주 지연 시간 후, epileptiform의 방전은 설치류 1 뇌 슬라이스에 기록 수 있으며, 전기 또는 행동 압류는 그러한 고양이와 원숭이 4-6와 같은 다른 종 생체내에서 볼 수 있습니다. 이 잘 구축 동물 모델을 생성하는 효율적이며, 외상성 뇌 손상의 여러 가지 중요한 특성을 모방한 것이었 지요. 그러나, 그것은 기술적으로 무료로 손이 작은 쥐 두뇌의 대뇌 피질의 병변 정확한를 만들기 위해 시도 도전이다. 처음에 스탠포드 대학 1 박사 데이비드 왕자의 실험실에서 설립 절차에 따라, 우리가 마우스 및 쥐이 모델의 준비를위한 수술을 수행하는 향상된 기술을 제시한다. 우리는 간단한 수술 장치를 만들고 더 정확하고 일관된 결과를 생성하기 위해 깊이와 각도 절단의 더 나은 통제를 얻을 그것을 사용하는 방법을 보여줍니다. 장치 수 있도록 간단하고, 절차가 빨리 배웁니다. 이 동물 모델의 생성은 외상후 epileptogenesis의 메커니즘에 대한 연구에 대한 효율적인 시스템을 제공합니다.
Protocol
1. 아래 부분을 잘라냄 수술을위한 간단한 장치를 만들기
- 우리가 만든 아래 부분을 잘라냄 장치는 세 부분으로 (그림 1)으로 구성되어 있습니다 : 유도 관의 부착 및 바늘을 수 있으며, 수술 중에 두개골 창을 가로질러 앉아 스테인레스 스틸 또는 플라스틱으로 만들어진 (1) 지원 플레이트 (2) 위치에 바늘을 보유하고 있으며 바늘의 회전을 허용하는지도 튜브 및 끝에서 ~ 3mm에서 90도 구부린 및 회전 삽입로 이동됩니다 (3) 바늘.
- 두께 1-1.5 mm, 7 조각 ~ 10 X 30mm 직사각형 스테인리스 스틸 또는 투명 플라스틱 (1) 지원 플레이트를 만들기 위해 잘라. 1.5 인치 22 게이지 (BD 회사, # 305156)와 1.5 인치 25 게이지 (BD 회사, # 305127) 주사 바늘을 준비합니다. 지도 튜브하려면, 플라스틱 종료하고 그 총 길이가 31-32mm (2)에 관한 있도록 22 게이지 주사 바늘의 낮은 바늘 끝을 잘라. 모래 금속 끝을은 평평하고 부드럽게 만들 수 있습니다. 이 유도 관의 마지막 길이는 25 게이지 주사 바늘보다 짧은 5~6mm에 대해해야합니다.
- 바늘이 금속의 가장자리에 수직되어 있는지 확인하고, 지원 접시에지도 튜브를 해결하기 위해 cyanoacrylate 접착제를 사용하십시오.
- 지도 튜브에 25 게이지 주사 바늘을 삽입하고, 팁 (그림 1) 2.5-3 mm에서 바늘을 90도 구부.
- 바늘의 결국 (그림 1, 바늘 정지)에 gluing 작은 플라스틱 튜브로 바늘의 수직 이동 범위를 조정합니다. 바늘의 마지막 이동 범위는 바늘이 대뇌 피질에 삽입 할 수있는 방법을 깊이 결정, 및 P21 쥐에 대한 1.6-1.8 mm와 P21 생쥐에 대한 1.3-1.5 mm해야합니다. 이 길이는 동물의 종 및 연령에 맞게 변경해야합니다.
- 구부러진 끝 (Fig.1 바늘 표시기)와 같은 방향으로 바늘의 위쪽 끝에 작은 구리 와이어 또는 테이프의 작은 조각을 첨부합니다. 와이어 또는 테이프는 아래 부분을 잘라냄 수술 중 바늘의 회전 각도 (그림 1)을 나타냅니다.
2. 동물 준비
- 모든 수술 장비 유리 비드 살균기, 또는 70 % 에탄올로 소독과 멸균, autoclaved해야합니다.
- 22일 (P20 - 22) 또는 같은 나이에 CD1 쥐들이 - 우리는 출생 후의 20 세에서 스프 / Dawley 쥐를 사용합니다. 마우스 또는 쥐의 다른 변종은 특정 프로젝트에 사용할 수 있습니다.
- 300ml의 IP 주사와 마우스를 마취 80 MG / kg와 xylazine 8 MG / kg. 동물이 꼬리 핀치에 응답하지 않습니다 후 수술이 시작됩니다. 수술하는 동안, 필요한 경우 한 3의 부스터 선량은 마취 칵테일의 원래 복용량은 원래 마취 상태를 복원하기 위해 부여하실 수 있습니다.
- 전기 헤어 트리머와 함께 동물의 두피에서 머리카락을 자르고. 마취 동안 건조로부터 보호하기 위해 동물의 눈을에 안과 연고의 작은 금액을 적용합니다. 70 % 에탄올에 이어 10 % povidone - 요오드 솔루션을 사용하여 두피를 소독.
- 안정적인 고정 위치에 머리를 유지하는 stereotaxic기구에 동물을 탑재합니다. 수술 전반에 걸쳐, 우리는 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에있는 동물을 유지.
- 람다의 눈 사이에 연장 메스를 사용하여 두피에 중간선 앞쪽에 - 후부 절개를합니다. 이외에도 피부를 뽑아 충분히 왼쪽 두개골을 노출 hemostats를 사용합니다.
- 왼쪽 두개골에 사각형 상처를 확인하고, 골막을 모으 메스를 사용합니다. 이 단계는 출혈을 줄이고 두개골에 드릴 용이합니다.
3. undercuts 만들기
- 노출된 두개골 지역에 무균 식염수의 작은 금액을 추가하고 혈액을 청소하고 지역을 건조하는 데 몇 Q - 팁을 사용합니다.
- 수술 현미경, 왼쪽 두개골의 중앙에 사각형 홈을 (쥐에 ~ 5 X 7mm, 4 마우스의 X 5mm) (약 왼쪽 sensorimotor 피질 이상) 드릴링 시작합니다. 두개골에 염분의 드롭을 적용하면 드릴링 및 없어져요 열을 용이하게합니다. 뚫고있는 뼈 약 삼분의이 깊이 후, 여분의 염분을 제거하고 면봉을 넣었로 드릴링 지역을 청소하십시오. 뼈의 중앙 조각은 포셉의 부드러운 터치에 따라 움직일 수있는 때까지 천천히 조심스럽게 깊이 드릴.
- 조심스럽게 뼈의 가장자리에 포셉의 날카로운 팁을 삽입하고 천천히 왼쪽 반구를 노출 포셉 운동으로 뼈의 중앙 조각을 제거합니다.
- 수술 현미경, 아래 부분을 잘라냄 장치를 보유하고 동양 parasagittal 방향으로 바늘과 바늘 끝과 대상 피질 영역의 시각화를 유지하는 등 약간 caudally 있도록 중간선, 틸팅 장치의 지원 플레이트 직각. 두개골 윈도우의 중앙에, 우수한 화살 치료 측면 지역 1~2mm으로 바늘의 끝을 겨냥해서 대형 선박의 직접적인 침투를 방지.
- 혈관을 여분을 줄 수있는만큼 경질 통해 PIA 아래 수평 방향으로 바늘을 삽입합니다. 아래 부분을 잘라냄 장치의 바닥을 앉아두개골 창의 양쪽 가장자리에 너무 바늘은 대뇌 피질의 표면 (그림 1) 정상적인 위치입니다. 손으로 두개골 창의 가장자리 모두에서 장치를 휴식하는 것은 크게 감소하거나 다음 절차를 수행하는 동안 흔들어 손을 제거합니다. PIA 아래에 바늘을 올려 후 천천히 바늘이 깊이 갈 수있을 때까지 그것이 transcortical 상처를 만들 수 낮추십시오. ° 떨어진 VI는 아래 부분을 잘라냄 반 원을 흰색 물질 / 깊은 레이어를 만들 수 중간선에서 ~ 135를 회전합니다. 다음 PIA 아래 다시 바늘을 올립니다. 역방향 장치를 기울이기와 바늘을 철회.
- 선택, 하나는 위의 절차 (단계 2.5) 반복하지만 윈도우의 측면 가장자리에서 추가 transcortical 상처를 만들만큼 바늘을 회전하지 않고 있습니다. 이것은보다 완벽한 대뇌 피질의 격리를 생성합니다.
- 보호하기 위해 두개골 윈도우에 플라스틱 필름의 조각 (6 X 6mm)을 장소, 두피 치료. 완전히 마취에서 회복까지 온수 패드에있는 동물을 놓으십시오.
4. 대표 결과 :
코로나 피질 조각은 아래 부분을 잘라냄 수술의 성공을 확인하는 준비하실 수 있습니다. > 이주 수술 후 준비 슬라이스에서 transcortical과 아래 부분을 잘라냄 인하는 현미경의 저전력 목표 (그림 2)에 따라보고 알 수있는 있습니다. 부분적으로 고립된 피질은 보통 약간 얇은되고, epileptiform 활동 분야 잠재적인 기록 (그림 3)과 대뇌 피질의 조각의 대부분에서 발견하실 수 있습니다.
흰 문제 또는 깊은 피질 층에 큰 구멍 대비 형성에서 lesioned 피질, 또는 위 또는 아래 하얀 문제되고 잘못된 컷의 밝은 극적인 추가 실험을위한 두뇌를 사용할 수 없게 될 것입니다.
그림 1. 아래 부분을 잘라냄 장치의 구조 및 응용 프로그램. 지침 튜브 (2) 스테인레스 스틸 또는 투명 플라스틱으로되어 지원 플레이트 (1)에 붙어있다. 주사 바늘 (3) 팁로 ~ 3mm의지도 튜브 및 구부러진를 통해 삽입됩니다. 니들은 플라스틱 튜브로 만들어진 정지하면 바늘의 수직 이동 범위가 ~ 1.2 mm 각각 P21 마우스 및 쥐에 사용 ~ 1.5 mm로 제한되도록 바늘의 위쪽 끝에 붙어있다. 작은 구리 와이어의 세그먼트는 구부러진 바늘의 방향에 대해 바늘 지표로 핸들 아래에 고정됩니다. 장치가 기울어져 있으며, 두개골 윈도우의 양쪽 가장자리와 접촉 상처가 pial 표면에 평행하게 만들 수 있도록합니다.
그림 2. 허리의 연한 고기 슬라이스의 대표 이미지. P48 쥐에서 아래 부분을 잘라냄 병변 이후 두 주를 준비했습니다 슬라이스의 A. 형광 이미지. 절삭 상처는 형광 염료 DiI에 의해 분류되었다. 오른쪽에 흰색 화살표는 transcortical 컷을 표시하고, 하단에있는 화살표는 계층 IV과 흰색 물질의 경계하지만 합격 아래 부분을 잘라냄 나타냅니다.
그림 3. 아래 부분을 잘라냄 뇌 슬라이스에서 아래 부분을 잘라냄 슬라이스. 필드 잠재 녹화에서 필드 가능성이 기록은 부상 대뇌 피질 조직 hyperexcitability을 제안, epileptiform 활동을 전시.
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Discussion
아래 부분을 잘라냄 모델은 외상후 epileptogenesis를 공부를위한 고효율 시스템입니다. 전형적인 수술을 완료하는 데 약 20-30분 소요하고, evoked 또는 자연 epileptiform 활동이 이주 수술 후 1-2 대부분의 동물에서 슬라이스에 기록하실 수 있습니다. 더 중요한 건,이 모델은 출혈, 염증, 부종, axotomy와의 연결을 죽음 7과 같은 외상성 뇌 손상 다음과 같은 변경 사항을 모방한 것이었 지요. 뿐만 아니라이 설치류 및 다른 동물에 epileptiform 활동 관찰되었으며,뿐만 아니라 간질 발작은 대뇌 피질의 병변 비교 8 고통을 인간에 설명되어있다. 큰 진전은 최근 몇 년 사이에 근본적인 메커니즘을 명료하게하다하기 위해 만든되었습니다. 자연과 evoked interictal epileptiform의 방전은> 2 주 병변 후 뇌 슬라이스에 기록되었으며, 이러한 활동은 쥐의 대뇌 피질의 계층 V 1에 발생한 것으로되었습니다. 회로 개편, GABAergic interneurons 및 disinhibition의 손실의 연결을 막 흥분 증가하고, 흥분성의 시냅스 결합의 증가의 증거는 또한 특히 대뇌 피질의 레이어 V 2,9-13에서 증명되었습니다.
여기 아래 부분을 잘라냄 병변을 만들기위한 소설 악기를 소개했다. 하나는 무료로 손으로 아래를 잘라낸 수술을 수행하면, 자주 흔들어 손 안정적이고 정확한 대뇌 피질의 병변을 만드는 데 어려움을 초래합니다. 연습과 경험이 수술의 품질을 향상시킬 수 있습니다 있지만, 병변의 깊이와 품질에 상당한 변화가 발생합니다. 우리가 도입 장치는 세 가지 측면에서 유용합니다. 첫째, 두개골 윈도우의 가장자리에 휴식으로, 장치가 크게 때문에 그것이 가능한 섬세한 뇌 조직을 통해 부드러운 상처를 만들기 위해 만들어 수술하는 동안 흔들림 손에 문제가 없습니다. 둘째, 바늘 삽입과 회전 정도의 깊이는 가능한 레이어 VI 아래에 흰 문제에 대해보다 정확하고 일관되게 잘라지게하고, 신중하게 조절할 수 있습니다. 셋째, 대뇌 피질의 북반구의 표면은 곡선입니다 함께 중간 바늘의 각도를 적절하게 조정되지 않은 경우 대상 흰색 문제를 일으킬 수없는 측면 측면 (그림 1) 이상되는. 두개골 창에서 장치를 휴식으로 주사 바늘을 옆으로 기울어져 있으며, 절단 각도가 자동으로 바늘의 회전 항상 피질과 정확한 병변의 표면에 평행하게됩니다 (그림 2) 획득되도록 조정됩니다. 이 장치를 사용하여 하나의 잠재적인 문제는 그것이 현미경으로 바늘의 직접적인 시각화를 방해할 수있다는 것입니다. pial과 피질을 관통했을 때이 문제는 꼬리 방향 약간 틸팅 장치에 의해 해결할 수 있습니다. 즉시 바늘이 흰색 문제에 져서으로 장치는 대뇌 피질 표면에 수직되기 조정해야하고, 두개골에 쉬었. 이 시점에서 바늘 표시기를보고하면 바늘 회전을 모니터링하기에 충분한 것입니다. 요약이 몇 가지 장점과 건설의 상대적 용이성과 가격을 내리다 모델은 외상후 epileptogenesis의 연구에 대한 더 편리하게 이용할 수있게됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 척수 및 건강의 인디애나 국무부에서 뇌 손상 연구 기금에서 NIH / NINDS 부여 4R00 NS 057,940, 그리고 부여 SCBI 200-12에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Foredom micromotor kit | equipment | Foredom | K.1070 | |
| 1.5 inch 22-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305156 | |
| 1.5 inch 25-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305127 | |
| Cyanoacrylate glue | material | Ted Pella, Inc. | 14450 |
References
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