Summary
Gedeeltelijk geïsoleerd cortex ("ondermijnen") is een efficiënte diermodel van posttraumatische epileptogenese. Hier laten we zien hoe je een roman chirurgisch apparaat te maken en het gebruiken om meer nauwkeurige en consistente letsels aan te brengen in dit model te genereren.
Abstract
Gedeeltelijk geïsoleerd cortex ("ondermijnen") is een diermodel van posttraumatische epileptogenese. De chirurgische procedure heeft betrekking op het doorsnijden van de sensomotorische cortex en de daaronder witte stof (te onderbieden) zodat een specifieke regio van de cerebrale cortex grotendeels geïsoleerd is van de naburige cortex en subcorticale regio's 1-3. Na een vertraging van twee of meer weken na de operatie, kan epileptiforme ontladingen worden opgenomen in de hersenen plakjes van knaagdieren een en elektrische of het gedrag van epileptische aanvallen kan worden waargenomen in vivo van andere soorten zoals kat en aap 4-6. Dit gevestigde diermodel is efficiënt te genereren en bootst een aantal belangrijke kenmerken van traumatisch hersenletsel. Het is echter technisch uitdagende poging om nauwkeurige corticale laesies te maken in de kleine knaagdieren hersenen met een vrije hand. Gebaseerd op de procedure in eerste instantie opgericht in het labo van dr. David Prins aan de Stanford University een, hier presenteren wij een verbeterde techniek om een operatie uit te voeren voor de voorbereiding van dit model bij muizen en ratten. We laten zien hoe je een eenvoudige chirurgische apparaat te maken en het gebruiken om een betere controle van de zaagdiepte en de hoek om meer nauwkeurige en consistente resultaten te genereren te krijgen. Het apparaat is makkelijk te maken, en de procedure is snel te leren. De generatie van dit dier model biedt een efficiënt systeem voor het onderzoek naar de mechanismen van posttraumatische epileptogenese.
Protocol
1. Het maken van een simpel apparaat voor ondersnijding chirurgie
- De undercut apparaat dat we geschapen bestaat uit drie delen (fig. 1): (1) een ondersteunende plaat van roestvrij staal of kunststof die bevestiging van een leidende buis en een naald toelaat, en zit over de hele schedel raam tijdens een operatie, (2) een leidende buis die een naald houdt in stand en vergunningen naald rotatie, en (3) een naald die is 90 graden gebogen op ~ 3 mm van de tip, en is beweegbaar door rotatie en inbrengen.
- Knip een stuk van 1-1,5 mm dik, 7 ~ 10 x 30 mm rechthoekige roestvrij staal of transparant plastic (1) om de ondersteunende plaat te maken. Bereid een 1,5 inch 22-gauge (BD bedrijf, # 305156) en een 1,5 inch 25-gauge (BD bedrijf, # 305127) naald van de spuit. Om een geleidingsbuis, afgesneden het plastic uiteinde en het onderste punt van de naald van de 22-gauge naald, zodat de totale lengte is ongeveer 31 tot 32 mm (2). Zand de metalen eind aan maken vlak en glad. De uiteindelijke lengte van deze geleidingsbuis moet ongeveer 5-6 mm korter dan de 25-gauge naald van de spuit.
- Gebruik cyanoacrylaat lijm om de leidende buis vast op de steunplaat, zorg ervoor dat de naald loodrecht staat op de rand van het metaal.
- Plaats de 25-gauge naald in de leidende buis, en buig de naald 90 graden op 2.5 tot 3 mm van de tip (afb. 1).
- De verticale beweging bereik van de naald door lijmen een klein plastic buisje op het eindigen van de naald (afb. 1, naald-stop). De laatste bewegende bereik van de naald bepaalt hoe diep de naald kan worden ingebracht in de cortex, en moet 1.6-1.8 mm voor P21 ratten en 1.3-1.5 mm voor P21 muizen. Deze lengte moet worden aangepast voor verschillende soorten en leeftijden van de dieren.
- Bevestig een kleine koperen draad of een klein stukje tape op de bovenkant van de naald in dezelfde richting als de gebogen tip (Fig.1 naald indicator). De draad of band geeft de draaihoek van de naald tijdens de ondersnijding chirurgie (afb. 1).
2. Dier voorbereiding
- Alle chirurgische instrumenten dienen te worden geautoclaveerd, gesteriliseerd met een glazen kraal sterilisator, of gedesinfecteerd met 70% ethanol.
- We maken gebruik van Sprague / Dawley ratten op postnatale leeftijd 20 - 22 dagen (P20-22) of CD1 muizen op dezelfde leeftijd. Verschillende stammen van muizen of ratten mogen worden gebruikt voor specifieke projecten.
- Verdoven van de muis met een ip injectie van ketamine 80 mg / kg en xylazine 8 mg / kg. De chirurgische procedure start nadat het dier niet reageert op de staart knijpen. Tijdens de operatie, indien nodig, een booster dosis van een derde van de oorspronkelijke dosering van de narcose cocktail kan worden gegeven aan de oorspronkelijke staat te herstellen narcose.
- Knip dan de haren op de hoofdhuid van het dier met een elektrische tondeuse. Breng een kleine hoeveelheid oogzalf op de ogen van het dier voor de bescherming tegen uitdroging tijdens anesthesie. Ontsmet de hoofdhuid met behulp van een 10% povidon-jodium-oplossing, gevolgd door 70% ethanol.
- Monteer het dier op een stereotaxische apparaat om het hoofd te houden in een stabiele vaste positie. Gedurende de operatie, houden we het dier op een verwarmingselement om onderkoeling te voorkomen.
- Maak een middellijn anterior-posterior incisie op de hoofdhuid met behulp van een scalpel, dat zich uitstrekt van lambda tussen de ogen. Gebruik hemostats om de huid opzij te trekken en voldoende bloot de linker schedel.
- Maak een rechthoekig gesneden aan de linker schedel, en gebruik de scalpel te schrapen uit periosteum. Deze stap zal verminderen bloeden en vergemakkelijkt het boren op de schedel.
3. Het maken van ondersnijdingen
- Voeg een kleine hoeveelheid steriele zoutoplossing op de blootgestelde schedel gebied, en vervolgens gebruik maken van verschillende Q-tips om bloed te reinigen en het gebied droog.
- Onder een chirurgische microscoop, start het boren van een rechthoekige groef (~ 5 x 7 mm bij ratten, 4 x 5 mm in muizen) in het midden van de linker schedel (ongeveer boven de linker sensomotorische cortex). Het aanbrengen van een druppel zoutoplossing op de schedel vergemakkelijkt het boren en wordt warmte afgevoerd. Na ongeveer 2 / 3 diepte van het bot is geboord, verwijder overtollig zout en reinig het boren gebied met een Q-tip. Langzaam en voorzichtig boren dieper tot de kern van het bot is verplaatsbaar bij lichte aanraking van een pincet.
- Verwijder voorzichtig het centrale stuk bot door het invoegen van een scherpe punt van een pincet op de rand van het bot en langzaam het opheffen van de tang aan de linker hersenhelft bloot te leggen.
- Onder de chirurgische microscoop, houdt u de ondersnijding apparaat en oriënteren van de naald in een parasagittal richting en de ondersteunende plaat loodrecht op de middellijn, kantelen van het apparaat iets caudaal om visualisatie van de naaldpunt en target corticale regio te handhaven. Richt de punt van de naald naar een gebied 1-2 mm lateraal van de superieure pijlnaad, in het midden van de schedel raam, en vermijd direct penetratie van grote schepen.
- Steek de naald in een horizontale richting door de dura en onder de pia om zo de bloedvaten te sparen. Zit de onderkant van het apparaat ondersnijdingop beide kanten van de schedel venster, zodat de naald is geplaatst loodrecht op het corticale oppervlak (afb. 1). Rust het apparaat op de beide randen van craniale venster met de hand zal aanzienlijk verminderen of te elimineren de hand schudden tijdens de volgende procedure. Til de naald onder de pia, dan langzaam zakken naar een transcorticale snijden maken totdat de naald kan niet dieper. Draai ~ 135 ° uit de buurt van de middenlijn aan een halve cirkel witte stof / diepe laag VI undercut te creëren. Dan weer verhogen van de naald onder de pia. Naar achteren kantelen van het apparaat en trek de naald.
- Optioneel kan een herhaal de bovenstaande procedure (stap 2.5), maar zonder het draaien van de naald om zo een extra transcorticale gesneden op de laterale randen van het venster te maken. Dit zal leiden tot een meer complete corticale isolement.
- Leg een stukje plastic folie (6 x 6 mm) op de schedel venster voor bescherming en hechting van de hoofdhuid. Leg het dier op een verwarmd kussen totdat volledig hersteld van de anesthesie.
4. Representatieve resultaten:
Coronale corticale plakjes kunnen worden voorbereid op het succes van de ondersnijding operatie te bevestigen. In plakjes bereid> 2 weken na de operatie, transcorticale en ondergraven bezuinigingen zijn te onderscheiden in laag vermogen doelstelling van een microscoop (afb. 2). De gedeeltelijk geïsoleerde cortex wordt meestal iets dunner, en epileptische activiteit kan worden gedetecteerd in de meerderheid van de corticale plakjes met veld mogelijke opname (afb. 3).
In tegenstelling tot de vorming van grote gaten in de witte stof of in diepe corticale lagen, dramatische dunner worden van de gelaedeerde cortex, of een dolende zaagsnede boven of onder het witte stof zal maken in de hersenen onbruikbaar voor verdere experimenten.
Figuur 1. Structuur en toepassing van een ondersnijding apparaat. Een leidend buis (2) is gelijmd op een steunplaat (1) dat is gemaakt van roestvrij staal of doorzichtig plastic. Een naald (3) wordt ingebracht via de leidende buis en gebogen ~ 3 mm voor de tip. Een naald stop gemaakt van kunststof buis is gelijmd op het bovenste uiteinde van de naald, zodat de verticale beweging bereik van de naald is beperkt tot 1,2 mm ~ en ~ 1,5 mm voor gebruik in P21 muizen en ratten respectievelijk. Een segment van de kleine koperdraad is vastgemaakt onder de handgreep als naald indicator voor de oriëntatie van de gebogen naald. Merk op dat het apparaat is gekanteld en in contact met zowel rand van het craniale venster, zodat een snede gemaakt kan worden parallel aan het pial oppervlak.
Figuur 2. Een representatief beeld van ondergraven slice. A. TL-beeld van een plakje die twee weken was bereid na te onderbieden laesie in een P48 rat. Het snijden wond werd bestempeld door de fluorescente kleurstof DII. De witte pijlen aan de rechterkant geven aan transcorticale gesneden, en de pijlen op de bodem geven aan dat undercut gepasseerd hoewel de grens tussen laag IV en witte stof.
Figuur 3. Veld mogelijke opname van een undercut slice. Field mogelijke opname van een undercut hersenen slice tentoongesteld epileptische activiteit, wat suggereert hyperexciteerbaarheid van de geblesseerde corticale weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ondersnijding model is een zeer efficiënt systeem voor het bestuderen van posttraumatische epileptogenese. Een typische ingreep duurt slechts ongeveer 20-30 minuten afwerking aan, en riepen of spontane epileptische activiteit kan worden opgenomen in de segmenten van de meeste dieren twee weken na de operatie 1-2. Nog belangrijker, dit model bootst aspecten van de veranderingen na traumatisch hersenletsel, zoals bloeden, ontsteking, oedeem, axotomy en neuronale dood 7. Niet alleen is epileptische activiteit waargenomen bij knaagdieren en andere dieren, maar ook epileptische aanvallen zijn gedocumenteerd bij mensen die lijden vergelijkbaar corticale laesies 8. Aanzienlijke vooruitgang is geboekt om de onderliggende mechanismen te ontrafelen in de afgelopen jaren. Spontane en opgewekte interictale epileptiforme ontladingen werden geregistreerd in de hersenen plakjes> 2 weken na de laesie, en deze activiteiten bleken afkomstig zijn uit de rat corticale laag V 1. Bewijs van circuit reorganisatie, verlies van GABAergische interneuronen en ontremming, stijging van de neuronale membraan prikkelbaarheid, en een toename van excitatoire synaptische koppeling hebben ook aangetoond, met name in corticale laag V 2,9-13.
Hier introduceerden we een nieuw instrument voor het maken van ondersnijding laesies. Wanneer men te onderbieden chirurgie met een vrije hand uitvoert, met de hand te schudden veroorzaakt vaak moeilijkheden bij het maken van een stabiele en nauwkeurige corticale laesies. Hoewel de praktijk en ervaring kunnen verbeteren van de kwaliteit van de operatie, grote variabiliteit in de diepte en de kwaliteit van de laesies bestaat. Het apparaat dat we hier hebben geïntroduceerd is gunstig in drie aspecten. De eerste, door te rusten op de randen van de craniale venster, het apparaat elimineert grotendeels het probleem van de hand schudden tijdens de operatie, waardoor het mogelijk is om een gladde snede te maken door de delicate hersenweefsel. Ten tweede kan de diepte van de naald inbrengen en de mate van rotatie zorgvuldig gecontroleerd worden, die het mogelijk maakt om meer nauwkeurig en consequent snijden in de witte stof onder de laag VI. Ten derde, is het oppervlak van de corticale halfrond gebogen: met de mediale hoger is dan de laterale zijde (afb. 1), wat kan leiden tot het missen van de gerichte witte stof wanneer de hoek van de naald is niet aangepast. Door te rusten het apparaat op de schedel raam, is de naald zijdelings gekanteld, en de snijhoek wordt automatisch aangepast zodat de rotatie van de naald altijd parallel aan het oppervlak van de cortex en precieze letsel is verkregen (afb. 2). Een potentieel probleem met het gebruik van dit apparaat is dat het kan interfereren met directe visualisatie van de naald onder de microscoop. Dit probleem kan worden opgelost door een beetje kantelen van het apparaat in de richting van de caudale richting bij het betreden van de pial en de cortex. Zodra de naald is verlaagd tot de witte stof, het apparaat dient te worden aangepast te worden verticaal op de corticale oppervlak, en rustte op de schedel. Op dit punt, kijkend naar de naald indicator is voldoende om de naald rotatiesensor. Kortom, met deze verschillende voordelen en zijn relatieve gemak van de bouw, zal het ondergraven model worden meer toegankelijk en bruikbaar voor de studie van posttraumatische epileptogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH / NINDS verlenen 4R00 NS 057940, en het verlenen van SCBI 200-12 van het ruggenmerg en de hersenen Injury Research fonds van de Indiana State Department of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Foredom micromotor kit | equipment | Foredom | K.1070 | |
| 1.5 inch 22-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305156 | |
| 1.5 inch 25-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305127 | |
| Cyanoacrylate glue | material | Ted Pella, Inc. | 14450 |
References
- Hoffman, S. N., Salin, P. A., Prince, D. A. Chronic neocortical epileptogenesis in vitro. J Neurophysiol. 71, 1762-1773 (1994).
- Topolnik, L., Steriade, M., Timofeev, I. Hyperexcitability of intact neurons underlies acute development of trauma-related electrographic seizures in cats in vivo. Eur J Neurosci. 18, 486-496 (2003).
- Graber, K., Prince, D. A. Models of Seizures and Epilepsy. , Elsevier. 477-493 (2005).
- Nita, D. A., Cisse, Y., Timofeev, I., Steriade, M. Increased propensity to seizures after chronic cortical deafferentation in vivo. J Neurophysiol. 95, 902-913 (2006).
- Sharpless, S. K., Halpern, L. M. The electrical excitability of chronically isolated cortex studied by means of permanently implanted electrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 244-255 (1962).
- Echlin, F. A., Battista, A. Epileptiform Seizures from Chronic Isolated Cortex. Arch Neurol. 9, 154-170 (1963).
- Prince, D. A. Epileptogenic neurons and circuits. Adv Neurol. 79, 665-684 (1999).
- Marin-Padilla, M. Developmental neuropathology and impact of perinatal brain damage. II: white matter lesions of the neocortex. J Neuropathol Exp Neurol. 56, 219-235 (1997).
- Jin, X., Prince, D. A., Huguenard, J. R. Enhanced excitatory synaptic connectivity in layer v pyramidal neurons of chronically injured epileptogenic neocortex in rats. J Neurosci. 26, 4891-4900 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. J Neurophysiol. 88, 2-12 (2002).
- Salin, P., Tseng, G. F., Hoffman, S., Parada, I., Prince, D. A. Axonal sprouting in layer V pyramidal neurons of chronically injured cerebral cortex. J Neurosci. 15, 8234-8245 (1995).
- Avramescu, S., Nita, D. A., Timofeev, I. Neocortical post-traumatic epileptogenesis is associated with loss of GABAergic neurons. J Neurotrauma. 26, 799-812 (2009).
- Avramescu, S., Timofeev, I. Synaptic strength modulation after cortical trauma: a role in epileptogenesis. J Neurosci. 28, 6760-6772 (2008).
