Summary
Parcialmente aisladas corteza ("socavar") es un modelo animal eficiente de epileptogénesis postraumático. Aquí se demuestra cómo hacer que un dispositivo quirúrgico novedoso y lo utilizan para hacer que las lesiones más preciso y consistente para generar este modelo.
Abstract
Parcialmente aisladas corteza ("socavar") es un modelo animal de la epileptogénesis postraumático. El procedimiento quirúrgico consiste en cortar a través de la corteza sensorio-motor y la parte de abajo la sustancia blanca (debilitar) a fin de que una región específica de la corteza cerebral es en gran parte aislado de la corteza vecinos y regiones subcorticales 1-3. Después de una latencia de dos o más semanas después de la cirugía, las descargas epileptiformes se pueden grabar en secciones de cerebro de los roedores una, y ataques eléctricos o de comportamiento se puede observar en vivo a partir de otras especies como el gato y el mono 4-6. Este modelo animal bien establecido es eficiente para generar e imita varias características importantes de la lesión cerebral traumática. Sin embargo, es técnicamente difícil tratar de precisar las lesiones corticales en el cerebro de roedores pequeños con las manos libres. Con base en el procedimiento establecido inicialmente en el laboratorio del Dr. David príncipe en la Universidad de Stanford 1, aquí le presentamos una técnica mejorada para realizar una cirugía para la preparación de este modelo en ratones y ratas. Nos muestra cómo crear un dispositivo quirúrgico simple y lo utilizan para obtener un mejor control de la profundidad de corte y el ángulo de generar resultados más precisos y consistentes. El dispositivo es fácil de hacer, y el procedimiento es rápido de aprender. La generación de este modelo animal proporciona un sistema eficiente para el estudio de los mecanismos de epileptogénesis postraumático.
Protocol
1. Haciendo un simple dispositivo para la cirugía de socavar
- El dispositivo de socavar hemos creado consta de tres partes (Fig. 1): (1) una placa de soporte de acero inoxidable o de plástico que permite la unión de un tubo guía y una aguja, y se sienta a través de la ventana craneal durante la cirugía, (2) un tubo guía que sostiene una aguja en su posición y permite la rotación de agujas, y (3) una aguja que es un ángulo de 90 grados en ~ 3 mm de la punta, y se puede mover por la rotación y la inserción.
- Corte un pedazo de 1 a 1,5 mm de espesor, de 7 a 10 x 30 mm rectangular de acero inoxidable o de plástico transparente (1) para hacer la placa de soporte. Preparar un 1,5 pulgadas de calibre 22 (BD empresa, # 305156) y un 1,5 pulgadas de calibre 25 (BD empresa, # 305127) aguja de la jeringa. Para hacer un tubo de guía, cortar el extremo de plástico y la punta de la aguja inferior de la aguja de la jeringa de calibre 22 para que su longitud total es de unos 31-32 mm (2). Arena al final de metal para que sea plana y lisa. La longitud final de este tubo guía debe ser de unos 5-6 mm más corta que la aguja de la jeringa de calibre 25.
- Utilice pegamento de cianoacrilato para fijar el tubo guía en la placa de soporte, asegurándose de que la aguja es perpendicular a la orilla del metal.
- Inserte la aguja de la jeringa de calibre 25 en el tubo guía, y doblar la aguja de 90 grados a 2,5-3 mm de la punta (Fig. 1).
- Ajustar el rango vertical que se desplaza de la aguja, pegando un pequeño tubo de plástico en el extremo de la aguja (Fig. 1, parada de la aguja). El rango final de movimiento de la aguja que determina la profundidad de la aguja se puede insertar en la corteza, y debe ser 1.6-1.8 mm de P21 ratas y 1.3-1.5 mm de P21 ratones. Esta longitud debe ser ajustado para diferentes especies y edades de los animales.
- Conecte un cable de cobre pequeña o un pedazo pequeño de cinta adhesiva en el extremo superior de la aguja en la misma dirección que la punta doblada (Fig. 1 indicador de aguja). El cable o cinta indica el ángulo de giro de la aguja durante la cirugía de socavar (Fig. 1).
2. Animal preparación
- Todos los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados en autoclave, esterilizado con un esterilizador de bolas de cristal, o desinfectada con etanol al 70%.
- Utilizamos ratas Sprague / Dawley a la edad postnatal 20 a 22 días (P20-22) o ratones CD1 a la misma edad. Las diferentes cepas de ratones o ratas pueden ser utilizados para proyectos específicos.
- Anestesiar a los ratones con una inyección ip de ketamina 80 mg / kg y xilacina 8 mg / kg. El procedimiento quirúrgico se inicia después de que el animal no responde al pellizcar la cola. Durante la cirugía, si es necesario, una dosis de refuerzo de un tercio de la dosis original del cóctel anestésico se puede dar para restablecer el estado original de la anestesia.
- Cortar el cabello en el cuero cabelludo del animal con una cortadora de cabello eléctrica. Aplique una pequeña cantidad de ungüento oftálmico en los ojos de los animales para protegerse de la sequedad durante la anestesia. Desinfectar el cuero cabelludo con un 10% de solución de povidona yodada, seguido de 70% de etanol.
- Monte el animal en un aparato estereotáxico para mantener la cabeza en una posición fija estable. A lo largo de la cirugía, que mantener al animal en un cojín de la calefacción para prevenir la hipotermia.
- Haga una línea media anterior-posterior incisión en el cuero cabelludo con un bisturí, que se extiende desde lambda de entre los ojos. Use pinzas hemostáticas para tirar de la piel a un lado y exponer el cráneo de la izquierda lo suficiente.
- Haga un corte rectangular en el cráneo a la izquierda, y el uso del bisturí para raspar el periostio. Este paso será reducir el sangrado y facilitar la perforación en el cráneo.
3. Lo que socava
- Agregue una pequeña cantidad de solución salina estéril en la zona del cráneo expuesto, a continuación, utilizar varios Q-tips para limpiar la sangre y seca el área.
- Bajo un microscopio quirúrgico, iniciar la perforación de una ranura rectangular (~ 5 x 7 mm en las ratas, 4 x 5 mm en los ratones) en el centro del cráneo, a la izquierda (aproximadamente por encima de la corteza sensoriomotora izquierda). La aplicación de una gota de solución salina en el cráneo facilita la perforación y el calor se disipa. Después de aproximadamente 2 / 3 de profundidad del hueso se perfora, eliminar el exceso de solución salina y limpiar el área de perforación con un Q-tip. Despacio y con cuidado perforar más profundo hasta que la pieza central de los huesos se puede mover a tocarlo con un fórceps.
- Retire con cuidado la pieza central de hueso mediante la inserción de una punta afilada de una pinza en el borde del hueso y levantando lentamente las pinzas para exponer el hemisferio izquierdo.
- Bajo el microscopio quirúrgico, mantenga el dispositivo de socavar, y orientar la aguja en una dirección parasagital y la placa de soporte perpendicular a la línea media, la inclinación del dispositivo ligeramente caudal a fin de mantener la visualización de la punta de la aguja y la región de destino cortical. Dirija la punta de la aguja a una zona 1-2 mm lateral a la sutura sagital superior, en el centro de la ventana del cráneo, y evitar la penetración directa de los grandes vasos.
- Insertar la aguja en dirección horizontal a través de la duramadre y en el PIA para evitar a los vasos sanguíneos. Sentarse la parte inferior del dispositivo socavaren ambos bordes de la ventana del cráneo para que la aguja se coloca perpendicular a la superficie cortical (Fig. 1). Descansando el dispositivo en los bordes de la ventana craneal tanto a mano de manera significativa a reducir o eliminar la mano temblorosa en el siguiente procedimiento. Levante la aguja por debajo de la pia, y luego baja lentamente para crear una corte transcortical hasta que la aguja no puede ir más profundo. Gire ~ 135 ° de la línea media para crear un tema de medio círculo blanco / capa profunda VI vender más barato. A continuación, levantar la aguja de nuevo a por debajo de la pia. Incline el dispositivo hacia atrás y retirar la aguja.
- Opcionalmente, se puede repetir el procedimiento anterior (paso 2.5) pero sin volver la aguja a fin de crear un recorte adicional transcortical en los bordes laterales de la ventana. Esto creará un aislamiento cortical más completa.
- Coloque un trozo de película de plástico (6 x 6 mm) en la ventana del cráneo de protección, y la sutura en el cuero cabelludo. Colocar el animal sobre un cojín calentado hasta que esté completamente recuperado de la anestesia.
4. Los resultados representativos:
Coronal rodajas cortical se puede preparar para confirmar el éxito de la cirugía de vender más barato. En rodajas preparado> 2 semanas después de la cirugía, los recortes transcortical y socavar son discernibles en el objetivo de baja potencia de un microscopio (Fig. 2). La corteza parcialmente aislados por lo general se hace un poco más delgada, y la actividad epileptiforme se puede detectar en la mayoría de las rebanadas corticales con la grabación de campo de potencial (Fig. 3).
Por el contrario, la formación de grandes agujeros en la sustancia blanca o en profundas capas corticales, dramático adelgazamiento de la corteza lesionada, o un corte errante por encima o por debajo de la sustancia blanca del cerebro se hacen inutilizables para otros experimentos.
Figura 1. Estructura y la aplicación de un dispositivo de retención. Un tubo de guía (2) está pegada sobre una placa de apoyo (1) que es de acero inoxidable o de plástico transparente. Una aguja de la jeringa (3) se inserta a través del tubo guía y se inclinó a ~ 3 mm de la punta. Una aguja deje de tubo de plástico pegado a la parte superior de la aguja de modo que el rango vertical en movimiento de la aguja se limita a ~ ~ 1,2 mm y 1,5 mm para su uso en P21 ratones y ratas, respectivamente. Un segmento de alambre de cobre pequeños se fija por debajo de la manija como aguja del indicador de la orientación de la aguja doblada. Tenga en cuenta que el dispositivo está inclinado y en contacto con los bordes de la ventana del cráneo para que el corte puede hacerse en paralelo a la superficie pial.
Figura 2. Una imagen representativa de la rebanada de vender más barato. A. fluorescentes imagen de una sección que se preparó dos semanas después de la lesión socavado en una rata P48. La herida de corte fue marcado por fluorescentes DII tinte. Las flechas blancas a la derecha indican corte transcortical, y las flechas en la parte inferior indica que socavar pasó a través de la frontera entre la capa IV y la materia blanca.
Figura 3. Grabación de campo potencial de una rebanada de vender más barato. Campo de registro de potenciales de una rebanada del cerebro mostraron socavar la actividad epileptiforme, lo que sugiere la hiperexcitabilidad cortical del tejido lesionado.
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Discussion
El modelo de socavar un sistema altamente eficiente para el estudio de epileptogénesis postraumático. Una cirugía típica sólo toma unos 20-30 minutos para el final, y evocó la actividad epileptiforme espontánea o se pueden grabar en rodajas de la mayoría de los animales dos semanas después de la cirugía 1-2. Más importante aún, este modelo reproduce los aspectos de los cambios después de una lesión traumática del cerebro, tales como sangrado, inflamación, edema, axotomía y la muerte neuronal 7. No sólo tiene la actividad epileptiforme se ha observado en los roedores y otros animales, sino también las crisis epilépticas se han documentado en los seres humanos que sufren lesiones corticales comparable 8. Progreso significativo se ha hecho para dilucidar los mecanismos subyacentes en los últimos años. Descargas interictales espontáneo y provocado epileptiformes se han registrado en rodajas de cerebro> 2 semanas después de la lesión, y estas actividades se encontró que se originan en la capa cortical de rata V 1. La evidencia de la reorganización de circuitos, la pérdida de interneuronas GABAérgicas y desinhibición, aumento de la excitabilidad de la membrana neuronal, y el aumento en el acoplamiento excitación sináptica También se ha demostrado, sobre todo en la capa cortical V 2,9-13.
Aquí hemos introducido un nuevo instrumento para la toma de las lesiones vender más barato. Cuando uno lleva a cabo la cirugía de socavar con la mano libre, la mano temblorosa con frecuencia causa dificultades en la toma de las lesiones corticales estable y precisa. Aunque la práctica y la experiencia pueden mejorar la calidad de la cirugía, una variabilidad significativa en la profundidad y la calidad de las lesiones existe. El dispositivo que hemos introducido aquí es beneficioso en tres aspectos. En primer lugar, al colocar en los bordes de la ventana del cráneo, el dispositivo elimina en gran medida el problema de la mano temblorosa durante la cirugía, por lo que es posible hacer un corte liso a través del delicado tejido cerebral. En segundo lugar, la profundidad de la inserción de la aguja y el grado de rotación puede ser controlado cuidadosamente, lo que permite cortar con mayor precisión y coherencia en la sustancia blanca debajo de la capa VI. En tercer lugar, la superficie del hemisferio cortical es curva: con la media es más alta que la parte lateral (Fig. 1), que puede causar falta de la sustancia blanca blanco si el ángulo de la aguja no se ajusta en consecuencia. Colocando el dispositivo en la ventana del cráneo, la aguja se inclina lateralmente, y el ángulo de corte se ajusta automáticamente para que la rotación de la aguja es siempre paralela a la superficie de la corteza y la lesión precisa se obtiene (Fig. 2). Un problema potencial con el uso de este dispositivo es que puede interferir con la visualización directa de la aguja en el microscopio. Este problema se puede resolver un poco la inclinación del dispositivo hacia la dirección caudal al penetrar el pial y la corteza. Tan pronto como la aguja se reduce a la sustancia blanca, el dispositivo debe ser ajustado para convertirse en vertical a la superficie cortical, y descansó en el cráneo. En este punto, mirando el indicador de aguja es suficiente para controlar la rotación de la aguja. En resumen, con estas ventajas y su relativa facilidad de la construcción, el modelo de socavar será más accesible y útil para el estudio de la epileptogénesis postraumático.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH / NINDS NS subvención 4R00 057.940, y la concesión SCBI 200-12 de la médula espinal y lesión cerebral Fondo de Investigación del Departamento de Salud del Estado de Indiana.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Foredom micromotor kit | equipment | Foredom | K.1070 | |
| 1.5 inch 22-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305156 | |
| 1.5 inch 25-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305127 | |
| Cyanoacrylate glue | material | Ted Pella, Inc. | 14450 |
References
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