Summary
Kısmen izole korteks ("alttan"), travma sonrası epileptogenezisin verimli bir hayvan modeli. Burada nasıl bir roman cerrahi cihaz yapmak ve bu model oluşturmak için daha kesin ve tutarlı lezyonlar yapmak için kullanabilirsiniz göstermektedir.
Abstract
Kısmen izole korteks ("alttan"), travma sonrası epileptogenezisin bir hayvan modeli. Cerrahi işlem sensorimotor korteks ve serebral korteksin belirli bir bölgeye komşu korteks ve subkortikal bölgelerde 1-3 büyük ölçüde izole edilmiş, böylece beyaz madde (alttan) altında. Üzerinden kesme içerir. Epileptiform deşarjlar, ameliyatı takip eden iki hafta veya daha fazla bir gecikme sonra kemirgenler beyin dilimleri 1; ve elektrik veya davranış nöbet gibi kedi ve maymun 4-6 gibi diğer türler in vivo olarak görülebilir. Bu iyi kurulmuş bir hayvan modeli oluşturmak için etkili ve travmatik beyin hasarı birçok önemli özelliklerini taklit ederek. Ancak, teknik olarak ücretsiz bir el ile küçük kemirgen beyin hassas kortikal lezyonlar haline getirmeye çalışıyor zordur. Başlangıçta, Stanford Üniversitesi'nden 1 Dr David Prince laboratuarda kurulan prosedürü dayanarak, burada fare ve sıçanlarda bu modelin hazırlanması için bir ameliyat gerçekleştirmek için geliştirilmiş bir teknik mevcut . Biz basit bir cerrahi cihaz ve daha kesin ve tutarlı sonuçlar üretmek için derinlik ve açı kesme daha iyi bir kontrol elde etmek için kullanmak için nasıl göstermektedir. Cihaz yapmak kolaydır ve prosedürü öğrenmek için hızlı. Bu hayvan modeli nesil posttravmatik epileptogenezisin mekanizmaları için verimli bir çalışma sistemi sağlar.
Protocol
1. Alttan ameliyatı için basit bir cihaz yapma
- Yarattığımız alttan cihazı (Şekil 1) üç bölümden oluşur: (1), yol gösterici bir tüp eki ve bir iğne sağlar ve ameliyat sırasında kranyal pencere karşısına geçiyor, paslanmaz çelik veya plastikten yapılmış bir destek plakası; (2) pozisyonda bir iğne tutan ve iğne dönme izin veren yol gösterici bir tüp; ve (3) ucundan ~ 3 mm 90 derece bükülmüş ve rotasyon ve ekleme hareketli bir iğne.
- 1-1.5 mm kalınlığında, 7 ~ 10 x 30 mm dikdörtgen, paslanmaz çelik veya şeffaf plastik (1) destekleyen plaka yapmak için bir parça kesin. 1.5 inç 22-gauge (BD şirketi, # 305.156) ve 1.5 inç 25-gauge (BD şirketi, # 305.127) şırınga iğnesinin hazırlayın. Yol gösterici bir tüp yapmak için, plastik sonu ve böylece toplam uzunluğu 31-32 mm (2) yaklaşık 22-gauge şırınga iğne iğne ucu alt kesti. Kum metal uç düz ve pürüzsüz bir hale getirmek için. Bu kılavuz tüp nihai uzunluğu 25 gauge enjektör iğnesi 5-6 mm daha kısa olmalıdır.
- Iğne metal kenarına dik olduğundan emin olun, destek plakası üzerine kılavuz tüpü düzeltmek için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın.
- 25-gauge enjektör iğnesi kılavuz tüp içine yerleştirin ve ucu (Şekil 1) 2.5-3 mm iğne 90 derece bükün.
- Iğne sonuna kadar (Şekil 1, iğne durdurma) üzerine yapıştırma küçük bir plastik tüp iğne dikey hareket aralığı ayarlayın. İğnenin son hareket aralığı ne kadar derin iğne korteks eklenebilir belirler ve, P21 sıçanlar için 1.6-1.8 mm ve P21 fareler için 1,3-1,5 mm olmalıdır. Bu uzunluk, farklı hayvan türleri ve yaşları için ayarlanması gerekiyor.
- Kıvrık ucu ile aynı yönde (Şekil 1 iğne göstergesi) üst ucuna iğne küçük bir bakır tel veya küçük bir parça bant takın. Tel veya bant alttan ameliyat sırasında iğne dönme açısı (Şekil 1) gösterir.
2. Hayvan hazırlık
- Tüm cerrahi aletler, cam boncuk sterilizatör, veya% 70 etanol ile dezenfekte ile sterilize otoklava gerekir.
- Postnatal yaş 20 - 22 gün (P20-22) ya da aynı yaşta CD1 fareler, Sprague / Dawley rat kullanır. , Fareler ya da sıçanlar farklı türlerin belirli projeler için kullanılıyor olabilir.
- Fareyi bir ip ketamin enjeksiyonu ile anestezi 80 mg / kg ve ksilizin 8 mg / kg. Hayvan kuyruk tutam yanıt vermiyor sonra cerrahi prosedür başlar. Ameliyat sırasında, gerekirse, bir rapel doz üçte birinin orijinal doz anestezik kokteyl orijinal anestezi devlet geri verilecektir.
- Elektrikli saç kesme makineleri ile hayvan kafa derisi, saç kesin. Anestezi sırasında kuruluğa karşı koruma için bir hayvanın gözleri üzerine küçük bir miktar oftalmik merhem uygulayın. Kafa derisi,% 70 etanol,% 10 povidon-iyot çözeltisi ile dezenfekte edin.
- Hayvan istikrarlı bir sabit pozisyonda kafa tutmak için stereotaksik bir aparat üzerine monte edin. Ameliyat boyunca, hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde hayvan tutun.
- Lambda gelen gözler arasında uzanan bir neşter kullanılarak kafa derisi ön-arka orta hat kesi olun. Hemostat deri bir kenara çekin ve sol kafatası yeterince açığa çıkarmak için kullanın.
- Sol kafatası üzerinde dikdörtgen bir kesim olun ve periost kazımak için neşter kullanabilirsiniz. Bu adım kanamayı azaltmak ve kafatası delme kolaylaştıracaktır.
3. Undercut'lar yapma
- Maruz kafatası alan üzerine küçük bir miktar steril tuzlu su ekleyin ve sonra kan, temiz ve kuru alan birkaç Q-ipuçlarını kullanın.
- Cerrahi bir mikroskop altında, sol kafatasının merkezinde dikdörtgen bir oluk (sıçanlarda ~ 5 x 7 mm, 4 farelerde x 5 mm) (yaklaşık, sol sensorimotor korteks üstte) sondaj başlar. Kafatası üzerinde bir damla serum fizyolojik uygulanması, sondaj ve dağıtır ısı kolaylaştırır. Kemik derinliği sonra yaklaşık 2 / 3 delinir, aşırı tuzlu su çıkarmak ve Q-tip sondaj alanını temiz. Kemik merkezi parçası üzerine hareketli bir forseps nazik bir dokunuş kadar yavaş ve dikkatli derin delme.
- Merkezi parça kemik, kemik kenarına forseps keskin bir ucu ekleme ve sol hemisfer yavaş yavaş ortaya çıkarmak için forseps kaldırma dikkatlice çıkarın.
- Cerrahi mikroskop altında, alttan cihazı ve yönlendirmek parasagital bir yönde iğne ve iğne ucu ve hedef kortikal bölgedeki görselleştirme korumak için biraz kaudal böylece orta hatta, devirme cihaz için destek plakası dik. Kraniyal penceresinin ortasında, superior sagittal sütür yanal bir alana 1-2 mm iğne ucu Amaç, ve büyük damarların doğrudan nüfuz önlemek.
- Kan damarlarının Yedek şekilde dura aracılığıyla pia altında yatay yönde iğne takın. Alttan cihazın alt Sitböylece iki kraniyal pencere kenarları üzerine iğne kortikal yüzey (Şekil 1) normal konumlandırılmış. Elle kafatası pencere kenarlarını hem cihaz Dinlenme önemli ölçüde azaltmak veya aşağıdaki yordamı sırasında el sallayarak ortadan kaldıracaktır. Pia altına iğne yukarı kaldırın, sonra yavaş yavaş iğne derin gidemez kadar transkortikal bir kesim oluşturmak için daha düşük. ~ 135 ° uzakta VI alttan yarım daire beyaz madde / derin katmanı oluşturmak için orta hat döndürün. Sonra pia altına iğne tekrar yükseltin. Cihazı geriye doğru yatırın ve iğneyi çıkartın.
- İsteğe bağlı olarak, yukarıdaki prosedürü (adım 2.5) tekrar ama pencerenin lateral kenarları ek bir transkortikal kesme oluşturacak kadar iğne açmadan. Bu, daha eksiksiz bir kortikal izolasyon yaratacaktır.
- Plastik film (6 x 6 mm) bir parçası koruması için kafa pencere üzerine yerleştirin ve kafa derisi sütür. Anesteziden tamamen düzelene kadar ısıtılmış bir pad üzerinde hayvan yerleştirin.
4. Temsilcisi sonuçları:
Koronal kortikal dilim alttan cerrahi başarı onaylamak için hazırlanmış olabilir. Ameliyattan 2 hafta sonra hazırlanan dilim, transkortikal ve alttan kesikler, mikroskop düşük güç hedefi (Şekil 2) altında görülebilir. Kısmen izole korteks genellikle biraz daha ince olur ve epileptiform aktivite alanında potansiyel kayıt (Şekil 3) ile kortikal dilim çoğunluğu tespit edilebilir.
Kontrast, beyaz cevher veya derin kortikal tabakalar, büyük delik oluşumu Lezyonlu korteks, ya da altında veya üstünde beyaz cevher, hatalı kesim dramatik incelmesi, daha fazla deneyler için beyin kullanılamaz yapacak.
Şekil 1. Alttan bir cihazın yapısı ve uygulama yol gösterici tüp (2), paslanmaz çelik ya da şeffaf plastik bir plaka (1) üzerine yapıştırılır . Bir şırınga (3) iğne ucu ~ 3 mm kılavuz tüp ve bükülmüş sokulur. Bir iğne, plastik tüp yapılmış durdurmak iğne iğne dikey hareket aralığı ~ 1.2 mm ve kullanım için sırasıyla P21 fare ve sıçanlarda ~ 1.5 mm ile sınırlıdır, böylece üst ucuna yapıştırılır. A segmentinde küçük bakır tel yönelim bükük iğne iğne göstergesi olarak kolu altında bağlanır. Not cihaz hareket ettirildiğinde ve kraniyal pencerede iki kenarı ile temas eden bir kesim pial yüzeyine paralel böylece.
Şekil 2. Alttan dilim bir temsilcisi görüntü. P48 sıçan alttan lezyon iki hafta sonra hazırlanan bir dilim A. Floresan görüntü. Kesme yara, floresan boya DII etiketli oldu. Sağ tarafta beyaz oklar transkortikal kesim gösteren ve alt okları katmanlı IV ve beyaz madde arasındaki sınır rağmen geçti alttan göstermektedir.
Şekil 3. Alan potansiyeli alttan alttan bir beyin dilim dilim Alan potansiyel kayıt kayıt yaralı kortikal doku hipereksitabilite düşündüren, epileptiform aktivite sergiledi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alttan model posttravmatik epileptogenezisin eğitimi için son derece etkili bir sistem. Tipik bir cerrahi bitirmek için sadece yaklaşık 20-30 dakika sürer ve uyarılmış veya cerrahi 1-2 iki hafta sonra spontan epileptiform aktivite çoğu hayvanlardan dilimleri kaydedilebilir. Daha da önemlisi, bu model, travmatik beyin hasarı, kanama, inflamasyon, ödem, axotomy ve nöronal ölüm 7 gibi aşağıdaki değişikliklerden yönlerini taklit eder. Kemirgenler ve diğer hayvanlardan sadece epileptiform aktivite gözlenmiştir, ama aynı zamanda epileptik nöbetler, karşılaştırılabilir kortikal lezyonlar acı 8 insanlarda dokümante edilmiştir . Son yıllarda önemli bir ilerleme altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için yapılmıştır. Lezyon> 2 hafta sonra spontan ve uyarılmış interiktal epileptiform deşarjların beyin dilimleri kaydedilmiştir ve bu faaliyetlerin sıçan kortikal tabaka V 1 geldiği tespit edildi. Devre reorganizasyon, GABAerjik internöronlar ve disinhibisyon kaybı, nöronal membran eksitabilite artar ve eksitatör sinaptik bağlantıları artış kanıtı da, özellikle kortikal tabaka V 2,9-13 ispat edilmiştir .
Burada alttan lezyonlar yapmak için yeni bir araç tanıttı. Ücretsiz bir el ile alttan cerrahi gerçekleştirdiğinde, sık sık El sallama, kararlı ve hassas kortikal lezyonlar yaparken zorluk neden olur. Cerrahi uygulama ve deneyim kalitesini artırmak olsa da, lezyonların derinliği ve kalitesi önemli farklılıklar vardır. Burada tanıtılan cihaz, üç açıdan faydalıdır. Birincisi, kraniyal pencere kenarlarında dinlenme, cihazın, büyük ölçüde, bu nedenle mümkün hassas beyin dokusu ile pürüzsüz bir kesim yapmak için ameliyat sırasında el sallayarak sorunu ortadan kaldırır. İkincisi, iğne yerleştirilmesi ve dönme derecesi derinliği mümkün altındaki beyaz tabaka VI konuda daha kesin ve tutarlı bir şekilde kesmek için yapar, dikkatli bir şekilde kontrol edilebilir. Üçüncü olarak, kortikal yarımkürenin yüzeyi kavisli: medial iğne açısı buna göre ayarlanır değilse hedeflenen beyaz cevher eksik neden olabilir (Şekil 1) lateral tarafında daha yüksek olması. Kraniyal pencerede cihazı dinlenme, iğne yanal hareket ettirildiğinde ve kesme açısı otomatik rotasyon iğne her zaman korteks ve kesin lezyon yüzeyine paralel olarak elde edilmiştir (Şekil 2) olacak şekilde ayarlanır. Bir potansiyel bir sorun bu cihaz ile mikroskop altında iğne doğrudan görselleştirme engel olabilir. Bu sorun pial ve korteks nüfuz kaudal yöne doğru hafifçe eğerek cihaz tarafından çözülebilir. En kısa sürede iğne beyaz cevher indirdi olarak, cihaz kortikal yüzeye dik hale ayarlanması gerekir, ve kafatası üzerinde duruyordu. Bu noktada, iğne göstergesi bakarak iğne dönüşünü izlemek için yeterli. Özetle, bu çeşitli avantajları ve inşaat göreli kolaylığı ile, alttan modeli, travma sonrası epileptogenezisin çalışma için daha erişilebilir ve kullanışlı hale gelecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü / NINDS Omurilik ve Indiana Eyalet Sağlık Bölümü Beyin Hasarı Araştırma fonu hibe 4R00 NS 057.940, ve hibe SCBI 200-12 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Foredom micromotor kit | equipment | Foredom | K.1070 | |
| 1.5 inch 22-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305156 | |
| 1.5 inch 25-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305127 | |
| Cyanoacrylate glue | material | Ted Pella, Inc. | 14450 |
References
- Hoffman, S. N., Salin, P. A., Prince, D. A. Chronic neocortical epileptogenesis in vitro. J Neurophysiol. 71, 1762-1773 (1994).
- Topolnik, L., Steriade, M., Timofeev, I. Hyperexcitability of intact neurons underlies acute development of trauma-related electrographic seizures in cats in vivo. Eur J Neurosci. 18, 486-496 (2003).
- Graber, K., Prince, D. A. Models of Seizures and Epilepsy. , Elsevier. 477-493 (2005).
- Nita, D. A., Cisse, Y., Timofeev, I., Steriade, M. Increased propensity to seizures after chronic cortical deafferentation in vivo. J Neurophysiol. 95, 902-913 (2006).
- Sharpless, S. K., Halpern, L. M. The electrical excitability of chronically isolated cortex studied by means of permanently implanted electrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 244-255 (1962).
- Echlin, F. A., Battista, A. Epileptiform Seizures from Chronic Isolated Cortex. Arch Neurol. 9, 154-170 (1963).
- Prince, D. A. Epileptogenic neurons and circuits. Adv Neurol. 79, 665-684 (1999).
- Marin-Padilla, M. Developmental neuropathology and impact of perinatal brain damage. II: white matter lesions of the neocortex. J Neuropathol Exp Neurol. 56, 219-235 (1997).
- Jin, X., Prince, D. A., Huguenard, J. R. Enhanced excitatory synaptic connectivity in layer v pyramidal neurons of chronically injured epileptogenic neocortex in rats. J Neurosci. 26, 4891-4900 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. J Neurophysiol. 88, 2-12 (2002).
- Salin, P., Tseng, G. F., Hoffman, S., Parada, I., Prince, D. A. Axonal sprouting in layer V pyramidal neurons of chronically injured cerebral cortex. J Neurosci. 15, 8234-8245 (1995).
- Avramescu, S., Nita, D. A., Timofeev, I. Neocortical post-traumatic epileptogenesis is associated with loss of GABAergic neurons. J Neurotrauma. 26, 799-812 (2009).
- Avramescu, S., Timofeev, I. Synaptic strength modulation after cortical trauma: a role in epileptogenesis. J Neurosci. 28, 6760-6772 (2008).
