Summary
Murine रेटिनल कोशिकाओं में प्लास्मिड डीएनए के शामिल करने के लिए या तो लाभ या समारोह के अध्ययन के नुकसान के प्रदर्शन के उद्देश्य के लिए एक विधि
Protocol
1. Electroporation के लिए प्लाज्मिड तैयारी
डीएनए electroporation के लिए आवश्यक एकाग्रता 5μg/μl है. यह आमतौर पर वांछित plasmids एक मैक्सी (Qiagen) - प्रस्तुत करने या समकक्ष विधि शोधन और डीएनए के काम कर राशि के लिए एकाग्रता द्वारा पीछा का उपयोग हो प्रवर्धित की आवश्यकता है. निम्नलिखित चरणों का काम कर राशि के लिए डीएनए की तैयारी का वर्णन.
- विभाज्य डीएनए के 100 μg (मैक्सी प्रस्तुत करने या समकक्ष से) और गड़बड़ी की आसानी के लिए 100 μL मात्रा पतला.
- Phenol जोड़ें, phenol की राशि एक लगभग 60% / डीएनए मात्रा अनुपात (μg डीएनए: कुल मात्रा) प्राप्त करने के लिए गणना की जानी चाहिए अर्थात्: 100 μg डीएनए (100 μL में) से अधिक 67 μL phenol (100 μg: 167 μL). अच्छी तरह मिक्स, पिपेट और नहीं नीचे के रूप में यह डीएनए के अत्यधिक बाल काटना के कारण हो सकता है.
- डीएनए को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14000 RPM में स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला लीजिए और क्लोरोफॉर्म ही डीएनए का उपयोग जोड़ने: 1.2 चरण में कुल मात्रा अनुपात, मिश्रण के रूप में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 14000 RPM में 1.2 कदम और स्पिन में वर्णित है.
- सतह पर तैरनेवाला लीजिए, डीएनए समाधान के लिए 10% 3 एम सोडियम एसीटेट की सतह पर तैरनेवाला मात्रा जोड़ने, धीरे मिश्रण है और 2.5 एक्स 100% इथेनॉल सतह पर तैरनेवाला मात्रा जोड़ने. उलटा द्वारा मिक्स. डीएनए समाधान के मिश्रण के दौरान वेग चाहिए.
- 14000 RPM में 10 मिनट के लिए 4 में डीएनए ° सी स्पिन.
- 4 में 70% इथेनॉल 350 μl, 5 मिनट के लिए 14000 RPM में स्पिन के साथ कुल्ला डिग्री सेल्सियस
- एयर सूखी गोली तो एक एक्स 5μg/μL पीबीएस (सेल जीव विज्ञान ग्रेड) में डीएनए भंग. Overdry नमूना के रूप में यह कर देगा यह बहुत मुश्किल पीबीएस में भंग करने के लिए मत करो.
- डीएनए समाधान के लिए फास्ट ग्रीन डाई (10% शेयर) जोड़ें, डाई के अंतिम एकाग्रता 0.1% है, एक इंजेक्शन अनुरेखक के रूप में कार्य.
2. डीएनए के Subretinal इंजेक्शन
निम्नलिखित चरणों का एक stereomicroscope की सहायता के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. एक बार अभ्यास आंख खोलने, चीरा और इंजेक्शन की प्रक्रिया में कम से कम 1.5 मिनट है जो ठीक करने के लिए एक ठीक anesthetized पिल्ला के लिए पर्याप्त समय नहीं है लेता है. एक तेज 30 गेज सुई का प्रयोग, ध्यान से इनकार junctional उपकला (छवि 1C) के साथ काटने से आँख खुली. अत्यधिक बल को लागू करने के रूप में यह अंतर्निहित आँख की कटौती में परिणाम कर सकते हैं मत करो. पलक जंक्शन के सीमा से परे कटौती के रूप में यह खून बह रहा है जो इंजेक्शन अस्पष्ट कर सकते हैं में परिणाम होगा बचें.
- बर्फ पर कई मिनट (छवि 1A) के लिए नवजात चूहों anesthetize, पिल्ले बर्फ में नहीं दफनाने के रूप में इस मृत्यु दर में परिणाम कर सकते हैं. बर्फ पर समय की लंबाई से पिल्ला पिल्ला, आमतौर पर 5 मिनट के लिए पर्याप्त है लेकिन चूहों को ध्यान से हो सकता है व्यक्तियों के रूप में बहुत जल्दी से जवाब या अब जोखिम की आवश्यकता के लिए उपयुक्त संज्ञाहरण सुनिश्चित हो सकता है निगरानी करनी चाहिए है चर रहा है. वापसी पलटा के लिए जाँच करने के लिए hemostats के साथ एक पंजा चुटकी आचरण.
- क्रम में subretinal अंतरिक्ष के लिए डीएनए के इंजेक्शन की सुविधा के लिए आंख पहले खोला जाना चाहिए. झाड़ू से साफ़ करना एक 70% isopropyl शराब प्रस्तुत करने का (Tyco स्वास्थ्य) के साथ इंजेक्शन और इनकार junctional उपकला जहां दो पलकें एक साथ आते हैं (छवि 1B) की पहचान आँख.
- एक तेज 30 गेज सुई का प्रयोग, ध्यान से इनकार junctional उपकला (छवि 1C) के साथ काटने से आँख खुली. अत्यधिक बल को लागू करने के रूप में यह अंतर्निहित आँख की कटौती में परिणाम कर सकते हैं मत करो. पलक जंक्शन के सीमा से परे कटौती के रूप में यह खून बह रहा है जो इंजेक्शन अस्पष्ट कर सकते हैं में परिणाम होगा बचें.
- कुंद समाप्त इंजेक्शन सुई 30-guage एक सुई की नोक उपयोग कॉर्निया (छवि 1E) के साथ जंक्शन के निकट श्वेतपटल में एक छोटा सा चीरा बनाने के द्वारा आँख की पहुंच की सुविधा है. बहुत गहरा घुसना के रूप में इस लेंस के एक पंचर में परिणाम कर सकते हैं मत करो.
- एक 33 गेज कुंद समाप्त इंजेक्शन सिरिंज gradients का उपयोग प्रत्येक इंजेक्शन (Exmire microsyringe; इतो कॉर्प सुई बाहरी व्यास 0.52 मिमी, भीतरी व्यास 0.13 मिमी) के लिए मात्रा को मापने के व्यक्तिगत सुई में डीएनए समाधान के 0.3 μl ड्रा. चीरा में सुई डालें तक विरोध scleral दीवार के प्रतिरोध का अनुभव है. मर्मज्ञ लेंस के रूप में सुई vitreal चैम्बर (छवि 2B) के माध्यम से पारित कर दिया है से बचने के लिए सावधान रहो.
- धीरे subretinal तर्जनी या अंगूठे का उपयोग करने के लिए सिरिंज सवार दबाना अंतरिक्ष में डीएनए समाधान के 0.3 μl इंजेक्षन. experimenter सवार अवसाद की गति ताकि दर है जिस पर डीएनए समाधान subretinal अंतरिक्ष में अंतःक्षिप्त है दर है जिस पर डीएनए समाधान subretinal स्थान (छवि 2C) के भीतर से फैलता है आगे बढ़ना नहीं करता नियंत्रण करने के लिए सावधान किया जाना चाहिए. डीएनए समाधान चिपचिपा है इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि सुई भी कसकर विरोध scleral दीवार के खिलाफ नहीं दबाया जाता है के रूप में इस डीएनए में परिणाम कर सकते हैं नहीं किया जा रहा इंजेक्शन या समान रूप से फैल नहीं है. एक सफल इंजेक्शन में एक भी परिणाम होगाsubretinal अंतरिक्ष के एक हिस्से में डीएनए समाधान के प्रसार. रेटिना के साथ और हरी ट्रेसर अंतर्निहित बिना क्षेत्र स्पष्ट हो सकता है जब इंजेक्शन जानवर घूर्णन चाहिए.
3. Electroporation
- Electroporation एक 10 मिमी व्यास चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड (; BTX उपकरण 522 # मॉडल) का उपयोग किया जाता है. पीबीएस में चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड लेना क्रम में जानवर के लिए इलेक्ट्रोड से विद्युत चालकता को अधिकतम और इंजेक्शन सकारात्मक पोल इलेक्ट्रोड के निकट आंख और गैर इंजेक्शन नकारात्मक पोल के निकट आँख के साथ इलेक्ट्रोड के बीच इंजेक्शन पिल्ला के सिर जगह इलेक्ट्रोड (छवि 3B).
- पाँच वर्ग एक पल्स जनरेटर का उपयोग दालों लागू करें: प्रत्येक नाड़ी में 950 दालों के बीच millisecond के अंतराल के साथ 80 और वोल्ट अवधि में 50 मिसे है.
- electroporated पिल्ले अब तक वे बर्फ संज्ञाहरण से उबरने गरम होना चाहिए. यह एक वार्मिंग दीपक के नीचे या एक गर्म स्लाइड के शीर्ष पर पिल्ले रखकर किया जा सकता है है. एक गर्म स्लाइड का उपयोग कर यदि यह सुनिश्चित करें कि एक उचित धातु की सतह और ठीक पिल्ला पैड के बीच रखा गया है. वसूली पर उनकी माँ electroporated पिल्ले वापस.
4. विश्लेषण के लिए आँखों की तैयारी
- electroporated retinas की कटाई और विश्लेषण के समय प्रयोग के उद्देश्यों के अधीन किया जाता है. GFP अभिव्यक्ति निहायत कल्पना electroporation के 3 दिन बाद किया जा सकता है. Cryoembedding और निम्नानुसार आगे बढ़ना सेक्शनिंग करने के लिए.
- वांछित timepoint पर electroporated पशुओं का बलिदान. Electroporated आँख Disect और 4 में 4% की paraformaldehyde में ठीक ° C 50 मिनट के लिए.
- ध्यान से आँख से दूर श्वेतपटल, कॉर्निया, लेंस, रंजित और रेटिनल pigmented उपकला सूक्ष्म विदारक द्वारा रेटिना हटा दें. dissected retinas प्रतिदीप्ति तहत विश्लेषण निहायत electroporation की दक्षता का निर्धारण किया जा सकता है. 4 में 30% sucrose रातोंरात समाधान के लिए retinas स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस
- अक्टूबर क्रायो - -80 पर मीडिया (Sakura Finetek संयुक्त राज्य अमरीका) और स्टोर एम्बेड डिग्री सेल्सियस में रुक retinas Retinas अब एक cryotome पर sectioned और गिलास स्लाइड पर कब्जा कर लिया जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
P0 नवजात pCAG EGFP प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के साथ electroporated retinas के उदाहरण electroporation (पी 3) और आंकड़ा 4 में electroporation (p14) के बाद 14 दिनों के बाद 3 दिन में प्रस्तुत कर रहे हैं. रेटिना electroporated ऊतक के प्रयोग से ऊतक इंजेक्शन और subretinal अंतरिक्ष में डीएनए समाधान के प्रसार के evenness के दौरान किए गए नुकसान की हद पर निर्भर करता है प्रयोग करने के लिए चर क्षेत्र है. आमतौर पर electroporated retinas के 90-100% कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक शामिल किया है और शुरू प्लाज्मिड व्यक्त सुविधा होगी. हालांकि, ऊतक morphology और electroporation दक्षता electroporated retinas के केवल 40-60% में फैक्टरिंग तुलनात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो जाएगा जब. रोसेट और सुई पैठ की साइट पर रेटिना टुकड़ी गठन लगभग हमेशा मनाया जाता है और इस क्षेत्र के विश्लेषण के लिए नहीं किया जाना चाहिए. सफल डीएनए कुशलता electroporated rosettes और अलगाव से मुक्त सुई पैठ की साइट के लिए पार्श्व ऊतक में microinjection परिणाम के दौरान फैल गया. Gliosis भी एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक चिंता का विषय है और लगभग हमेशा सुई पैठ की साइट पर होता है. हालांकि, के रूप में थाली गठन और रेटिना टुकड़ी के साथ, gliosis laterally electroporated ऊतक में आमतौर पर नहीं है महत्वपूर्ण है. Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) जैसे immunohistochemical मार्करों के लिए तय है कि विश्लेषण क्षेत्रों में प्रतिक्रियाशील gliosis के स्तर स्वीकार्य थ्रेसहोल्ड के भीतर गिर करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. Sectioned retinas प्रदर्शन है कि electroporated रेटिना की आकारिकी बरकरार है और EGFP अभिव्यक्ति लेबल व्यक्तिगत electroporated कोशिकाओं प्रस्तुत कर रहे हैं रहता है. उदाहरण एक P0 electroporation (छवि 4A-सी) और एक P0 electroporation (छवि 4D - एफ) के बाद 14 दिनों के बाद 3 दिन प्रस्तुत कर रहे हैं.
P3 retinas में electroporated कोशिकाओं के बहुमत रेटिना के neuroblastic परत (NBL) में स्थित हैं, और रेटिना (4B छवि, सी) विभेदित तंत्रिका या glial कोशिकाओं के किसी भी अलग morphological विशेषताओं का प्रदर्शन नहीं है. P14 electroporated कोशिकाओं बाहरी परमाणु परत (ONL) और रेटिना के भीतर परमाणु परत (लीग) में पाया जा सकता है. इसके अलावा विभिन्न लेबल कोशिकाओं को अब लीग, photoreceptors और मुलर glia interneurons (छवि 4E, एफ) सहित विशेषता रूपात्मक विभेदित न्यूरॉन्स की पहचान को प्रदर्शित .
चित्रा 1 एक नवजात शिशु (P0) पिल्ला माउस और डीएनए समाधान के subretinal इंजेक्शन के लिए आंख खोलने की संज्ञाहरण . ए) नवजात पिल्ला पर रखाanesthetization के लिए कुचल बर्फ की एक बिस्तर. इंजेक्शन जा आँखों के नीचे बर्फ के खिलाफ रखा गया है. बी) इनकार junctional उपकला के स्थान (बी, तीर) पलकों की आंख खोलने के लिए जा कटौती के लिए . सी) इनकार junctional उपकला (सी, तीर) के साथ पलकें काटना करने के लिए आँख को बेनकाब. डी) खोला आँख इनकार जंक्शन पर काटने निम्नलिखित. ई) आंख में एक चीरा कॉर्निया के नीचे श्वेतपटल में नीचे बना है कुंद समाप्त सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज की आसान प्रविष्टि की सुविधा है. स्केल सलाखों, बी, सी, डी, ई: 4mm.
कुंद चित्रा 2 निवेशन subretinal अंतरिक्ष में माइक्रो इंजेक्शन सिरिंज और डीएनए प्लाज्मिड समाधान के इंजेक्शन समाप्त हो गया. ए) कार्टून योजनाबद्ध आंख और subretinal अंतरिक्ष में सिरिंज टिप के निपटान में माइक्रो इंजेक्शन सिरिंज के सही प्रविष्टि का प्रदर्शन. कांच के चेंबर में डीएनए समाधान के इंजेक्शन, गर्तिका, लेंस में या इंजेक्शन में आंखों के माध्यम से सिरिंज के बीतने के असफल प्रयोगों में किसी भी electroporated कोशिकाओं अगर कुछ के साथ परिणाम होगा. बी) scleral और subretinal अंतरिक्ष में सिरिंज टिप की दीवार निपटान में बनाया चीरा में सिरिंज की पहुंच. सी) subretinal अंतरिक्ष में डीएनए समाधान के इंजेक्शन. स्केल सलाखों, बी, सी: 4mm. लघुरूप के रूप में: आर रेटिना, एल लेंस, वि शीशे, एसआरएस subretinal अंतरिक्ष, BES-कुंद सिरिंज समाप्त हो गया.
चित्रा 3 electroporation के लिए माउस पर चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड का उन्मुखीकरण. ए) कार्टून योजनाबद्ध electroporated आँख के सापेक्ष चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड के सकारात्मक और नकारात्मक paddles के उन्मुखीकरण का प्रदर्शन. ग्रीन subretinal अंतरिक्ष में इंजेक्शन डीएनए के स्थान का प्रतिनिधित्व करता है. डैश्ड तीर नकारात्मक आरोप लगाया सकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर इंजेक्शन डीएनए के electrophoretic आंदोलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. डीएनए वैद्युतकणसंचलन subretinal जो सकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर उन्मुख है रेटिना में नकारात्मक इलेक्ट्रोड के लिए आसन्न अंतरिक्ष से होता है. बी) चिमटी से नोचना के सकारात्मक चप्पू डीएनए के लिए निकट रखा जाता है आँख microinjected और नकारात्मक चप्पू गैर इंजेक्शन आँख करने के लिए आसन्न रखा गया है. सी) नवजात माउस पर चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट के उच्च बढ़ाई छवि. डैश्ड लाइनों इलेक्ट्रोड सकारात्मक दिशा में डीएनए के electrophoretic आंदोलन की दिशा का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल पट्टी, सी: 5mm.
चित्रा 4. नवजात माउस retinas (P0) pCAG EGFP साथ electroporated और प्रसव के बाद 3 दिन (पी 3) और प्रसव के बाद 14 दिन (p14) में विश्लेषण किया . एसी) एक sectioned P3 P0 pCAG EGFP साथ electroporated रेटिना के Confocal छवियाँ. electroporated कोशिकाओं के बहुमत रेटिना neuroblastic परत (NBL) में बैठो. एक sectioned p14 P0 पर pCAG-EGFP साथ electroporated रेटिना (लोमो) Confocal छवियों. Electroporated कोशिकाओं बाहरी परमाणु परत (ONL) और रेटिना के भीतर परमाणु परत (लीग) में पहचाना जा सकता है है. स्केल बार्स, वायुसेना: 50 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
Vivo में electroporation डीएनए अभिव्यक्ति plasmids के साथ रेटिना की कोशिकाओं के परिवर्तन के लिए एक तेजी से और कारगर तरीका का प्रतिनिधित्व करता है . इस विधि experimenter ectopically सर्वत्र व्यक्त प्रमोटर के नियंत्रण के तहत ब्याज की एक जीन शुरू करने या समारोह के अध्ययन के नुकसान के लिए ब्याज की जीन लक्ष्यीकरण shRNA constructs का उपयोग करके प्रदर्शन कर समारोह के अध्ययन के लाभ का प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, कई डीएनए plasmids एक साथ electroporated किया जा सकता है है, experimenter एकाधिक जीन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए या करने के लिए नीचे एक जीन दस्तक, जबकि ब्याज की एक दूसरे जीन शुरू करने की अनुमति. Cre recombinase की अभिव्यक्ति ड्राइविंग plasmids के electroporation भी एक मोज़ेक फैशन जहां ब्याज की एक floxed जीन युक्त पशुओं उपलब्ध हैं में जीन की अभिव्यक्ति को खत्म करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इस पद्धति का विशेष रूप से आंतरिक बनाम बाह्य जीन समारोह का निर्धारण करने के लिए मूल्यवान है. इसके विपरीत पारंपरिक पीटा चूहों की retinas में वापस एक जीन की electroporation experimenter बचाव knockouts में पहचान phenotypes रिवर्स करने के प्रयास में अध्ययन का प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है. किसी भी पृष्ठभूमि तनाव के चूहे electroporation प्रदर्शन अध्ययन किया जा रहा है की आवश्यकताओं के लिए विषय के लिए उपयोग किया जा सकता है. हालांकि, यह सबसे अच्छा है, जहां संभव हो, जो मजबूत मातृ व्यवहार प्रदर्शित उपभेदों का उपयोग, यानी स्विस वेबस्टर या CD1, क्रम में electroporated पिल्ले की अस्वीकृति की संभावना को कम करने के लिए. सूरजमुखी मनुष्य प्रयोगशाला उपभेदों microinjection के दौरान डीएनए समाधान के प्रसार के बाद से आसानी से देखे जा सकते हैं के साथ काम करने में आसान हैं. C57BL/6J के रूप में अंधेरे में pigmented आँखों से खींच अधिक चुनौतीपूर्ण हैं के बाद से फास्ट ग्रीन ट्रेसर रेटिनल pigmented उपकला के वर्णक के खिलाफ भेदभाव नहीं कर सकते हैं.
electroporated कोशिकाओं की संख्या में व्यापक लेकिन पूर्वज सक्षम आबादी electroporate करने की क्षमता उत्पन्न करने के लिए जल्द से जल्द में जन्मे सेल प्रकार सीमित है. Photoreceptors, द्विध्रुवी कोशिकाओं, मुलर glia, और amacrine कोशिकाओं सहित देर जन्मे कोशिकाओं को आसानी से इस पद्धति का उपयोग करके electroporated हैं. इसके विपरीत, रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं, क्षैतिज कोशिकाओं, और amacrine कोशिकाओं के सबसेट सहित प्रारंभिक जन्म कोशिकाओं आम तौर पर electroporated नहीं कर रहे हैं इस पद्धति का उपयोग करके. इस प्रोटोकॉल के लिए एक संशोधन जिसमें पूरे भ्रूण retinas विच्छेदित कर रहे हैं, इन विट्रो में electroporated और फिर explants के रूप में सभ्य जीन जल्दी जन्म सेल 7 वर्गों के विनियमन विनिर्देश की पहचान के लिए उपयोग किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम R01EY020560-01 NIH द्वारा और चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार में WM उबकना युवा विद्वान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों यूसुफ Bedont रेटिना की तैयारियाँ और इंजेक्शन के इमेजिंग के दौरान उसकी सहायता के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | JT Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare, Covidien | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Technologies | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Technologies | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | N/A |
References
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