זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Summary

מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך נמטודות

Abstract

Caenorhabditis elegans יש לעתים קרובות שימשו כמודל למערכת במחקרים של תהליכים התפתחותיים מוקדם. השקיפות של העוברים, את המשאבים הגנטי, ואת הקלות היחסית של טרנספורמציה הן תכונות שהופכות ג elegans מודל מצוין embryogenesis מוקדם. לייזר המבוסס על מיקרוסקופיה confocal תגי שכותרתו fluorescently לאפשר לחוקרים לעקוב אחר מבנים הסלולר ספציפי חלבונים העובר המתפתח. לדוגמה, אחד יכול לעקוב אברונים ספציפיים, כגון lysosomes או המיטוכונדריה, באמצעות צבעים שכותרתו fluorescently. צבעים אלה ניתן יהיה להעביר את העובר מוקדם באמצעות microinjection לתוך בלוטת המין המבוגרים. כמו כן, לוקליזציה של חלבונים ספציפיים ניתן בעקבות באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי. דוגמאות מוצגים כאן מפגין את השימוש של צבע lysosomal ניאון, כמו גם חלבונים היסטון ו היוביקוויטין מתויג fluorescently. היסטון שכותרתה משמש כדי להמחיש את ה-DNA ובכך לזהות את שלב של מחזור התא. GFP-tagged היוביקוויטין מגלה את הדינמיקה של שלפוחית ​​ubiquitinated בעובר בשלב מוקדם. תצפיות של lysosomes שכותרתו GFP: היוביקוויטין ניתן להשתמש כדי לקבוע אם יש colocalization בין שלפוחית ​​ואת lysosomes ubiquitinated. טכניקה עבור microinjection של הצבע lysosomal מוצג. טכניקות ליצירת זנים transgenenic מוצגים במקומות אחרים (1, 2). עבור הדמיה, עוברים נחתכים מתוך מבוגר נמטודות אנדרוגינוס ועלה על 2% רפידות agarose ואחריו מיקרוסקופיה זמן לשגות על לייזר רגיל סריקת מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. מתודולוגיה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של העובר מוקדם.

Protocol

1. נמטודות תרבויות

1. השג את ג המתאימה elegans זן של גנטיקה Caenorhabditis במלאי מרכז (CGC) או מעמית.
2. לגדול נמטודות על צלחות אגר NGM seeded עם דשא בקטריאלי OP50 (3). לניתוח של צמיחה זני ה-GFP של 25 ° C מומלץ.
3. יום לפני הניסוי מיקרוסקופיה שלך, לקחת לפחות 40 L4 הזחלים על גבי צלחות seeded והמקום צלחות של 25 ° C במשך הלילה. תולעים אלה יהיו צעירים לצורך הניסוי.

2. זריקות

אם רצוי להציג מבנים כגון lysosomes או המיטוכונדריה, מבוגרים ניתן להזריק עם צבע פלואורסצנטי לפני להדמיה.

1. הכן יבשים רפידות agarose ההזרקה. (זה יכול להיעשות אחת ימים רבים מראש)
   1. הכן agarose 2% מותכת במים. בעזרת פיפטה פסטר לשים 2 טיפות על coverglass 22X54 מ"מ. מקום אחר coverglass צולבות חכם על גבי הירידה. על מנת להשיג את העובי הנכון, לחץ על coverglass העליון עד קוטר של כרית הוא סביב 1.5 ס"מ. בואו לשבת במשך 5-10 דקות.
   2. הסר coverglass העליון. מייבשים את הפנקס agarose ידי הצבת אותו בתנור 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 או לאפשר לשבת על benchtop לילה.
2. הכן Mitotracker או פתרון Lysotracker.
   1. מדולל סוכן ניאון הצפת ביצה. אנו משתמשים בדרך כלל דילול של 1:10 Mitotracker או Lysotracker.
   2. המחט להזרקת עשוי זכוכית 1.2 OD נימי. משוך את המחט להזרקת חולץ באמצעות מחט.
   3. השתמש pipet Pastuer משך לגבות למלא את המחט עם צבע מדולל.
   4. המקום מחט בתא, אור ללא humidified עד לשימוש.
3. טרום הזרקה: הגדרת מיקרוסקופ מחט.
   1. הר מחט הזריקה על מנגנון ההזרקה. המנגנון שלנו היא micromanipulator כונן ישיר Narishige רכוב על הבמה של מיקרוסקופ Nikon TE200 הפוך מצויד יכולת ההדמיה DIC.
   2. חבר את המחט צינור 1.2 מ"מ מזהה שמחובר וסת הלחץ. או אוויר דחוס או חנקן יכול לשמש מקור לחץ חיצוני. הגדר את הרגולטור כדי 20-25 psi.
   3. מקום 2 טיפות של שמן מינרלי כבד (שמן Parafin) על גבי משטח הזריקה.
   4. הנח את כרית הזרקה אל המיקרוסקופ ולהפחית את המחט לתוך השמן. בדוק כדי לוודא זורם נוזל בחופשיות מן המחט כאשר הלחץ מוחל. החל הלחץ הזרקת ולבחון אם הנוזל זורם החוצה של המחט. אם לא, תצטרך לשבור בעדינות את קצה המחט. המחט ניתן לשבור על ידי נהיגה בעדינות את קצה לתוך קצת קטנה של coverglass שבור מונח על כרית ההזרקה. אחרי המחט זורם, לעבור לשלב הבא.
4. הזרקה.
   1. כ 1 שעה לפני עוברים צפייה, העברת תולעים בוגרות צעירות לתוך טיפת שמן על משטח הזריקה. לבצע את ההעברה באמצעות מיקרוסקופ לנתח. השתמש חוט פלטינה תולעת לבחור עם קצה מחודד עבור העברת תולעים.
   2. סדר 3-10 תולעים, כך שהם משקרים ישירות על הנייר. עבור זריקה, זה הכי קל אם התולעים מסודרים במקביל אחד לשני קצת פחות אורך תולעת מזה. לאחר תולעים הן על משטח הזרקת חשוב לעבוד במהירות להשלמת תהליך ההזרקה לפני התולעים להיכחד מן התייבשות.
   3. מניחים את coverglass עם תולעים לבמה מיקרוסקופ של המיקרוסקופ ההזרקה. פוקוס על החלק המרכזי (rachis) של הצינור אשך דיסטלי. לאחר מכן השתמש micromanipulator להזיז את קצה המחט לתוך המטוס מוקד זהה. הזז את הבמה בצורה אופקית, כך התולעת הוא ניקב ידי המחט. לאחר קצה המחט נמצא בתוך rachis, להפעיל לחץ ולאפשר אשך כדי למלא בתערובת לצבוע. הזרק שתי הזרועות בלוטת המין של תולעים כל על כרית ההזרקה.
   4. לאחר ההזרקה, השתמש pipet משך פסטר לספק כ 0.5 מ"ל של הצפת ביצה של תולעים. זה יהיה למנוע מהם מת מהתייבשות ולאפשר להם להתאושש הליך ההזרקה.
   5. אפשר התולעים להתאושש במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר בתא, אור ללא humidified.

3. Agarose לרפד עבור צפייה בעוברים

1. הכן agarose 2% מותך הצפת ביצה.
2. עם pipet פסטר, לשים 3 טיפות agarose מותכת לשקופית מיקרוסקופ נקי.
3. מקום להחליק בין שתי שקופיות אחרות, כי יש שכבה אחת של תיוג קלטת מכסה אותם. אלה משמשים מפרידי שיבטיחו כרית agarose שלך ​​הוא עובי הנכון.
4. מניחים השקופית השניה מיקרוסקופ נקי בניצב מטה אל טיפות agarose. לחץ כלפי מטה עד השקופית העליונה מוטלת על קלטת משקופיות מדריך.
5. רגע לפני שאתם מוכנים לעלות עוברים להסתכלות, להסיר את החלק העליון.

ילדה = "jove_title"> 4. עוברים הרכבה לצפייה

1. אם תולעים לא היה מוזרק, בצע את שני השלבים הבאים. אחרת לדלג עליהם.
   1. בחר תולעים בוגרות צעירות מהצלחת כי הוכן יום קודם לכן. אתה אמור להיות מסוגל לראות את העוברים בתוך ומבוגרים צעירים.
   2. פיק 5-20 תולעים לצלחת NGM unseeded. אפשר התולעים לזחול על הצלחת unseeded במשך כמה דקות, כך התולעים תאבד את רוב החיידקים הוא תקוע איתם.
2. השג עוברים צעירים תולעים בוגרות
   1. המקום טיפה 5-20 μl של הצפת ביצה באמצע coverglass 18 ² כוס מ"מ (עובי של 1.5 coverglass עדיפה).
   2. העבר תולעים מהצלחת unseeded או כרית זריקה לתוך ירידה של הצפת ביצה.
   3. גזור תולעים לפתוח עם מחט המזרק 26 מד. גזור לפתוח את תולעת ליד הפות. אתה צריך לראות את העוברים נשפכים מתוך התולעת.
3. הר לשקופית מיקרוסקופ
   1. הפוך את השקופית מיקרוסקופ שהוכנה עם כרית agarose ומוריד אותה אל coverglass עם עוברי.
   2. אם זמן לשגות המורחבת נדרש, להשתמש בווזלין כדי לאטום את הקצוות של coverglass כדי למנוע dessication.

5. מיקרוסקופיה

1. מציאת העובר המתאים.
   1. מקום להחליק על הבמה מיקרוסקופ. סרוק עם עדשה 10X למצוא עוברי.
   2. כדי למצוא עוברים בשלב מוקדם, לחפש, כי הם עוברים תהליך של השלמת המיוזה אימהית. עוברים meiotic ניתן להבחין מעוברים מאוחר יותר כי הם לא עברו קיצור. (אחרי העוברים סיימו המיוזה, ניתן לראות פער משמעותי בין קרום התא לבין קליפת ביצה בקצה הקדמי).
   3. ברגע שיש לך זיהה כראוי מבוים העובר, לעבור עדשה ההגדלה גבוה יותר עבור הקלטה של ​​העובר.
2. הדמיה
   1. בדוגמה זו, אנו עוברים לדמיין המבטאים את mCherry: H2B ו-GFP: החלבונים המתויגים UB. אנו משתמשים LSM700 Zeiss מיקרוסקופ סורק לייזר קונבנציונלי.
   2. תמונות נאספים באמצעות עדשה 1.4NA 63X. 488 ו 555 לייזרים משמשים עם כוח לייזר מינימלי ולהשיג מקסימלית. מחסנית AZ נאסף כל 10-15 שניות. בהתאם להיקף photobleaching, 30-60 נקודות הזמן נאספים. תמונות Z מחסנית הם התמוטטו לתוך תמונה הקרנה המקסימלי וידאו זמן לשגות הסופי.

6. נציג תוצאות:

באיור 1. הפריה כדי מיטוזה ראשונה ב C. elegans.

איור 2. Microinjection ההליך.

וידאו משלים 1 זמן לשגות הווידאו של ה-GFP:.. כחול היוביקוויטין פלוס Lysotracker בעובר meiotic לחץ כאן כדי להציג את הווידאו.

Discussion

לאחר המיזוג עם הזרע, הביצית המופרית עוברת סדרה של אירועים דינמיים. אירועים אלה הופכים את הביצית מתא סטטי יחסית לתוך העובר המתפתח במהירות. באורגניזמים רבים, rearrangements cytoplasmic הן קריטיות לקביעת הקוטביות עובריים לצורך הפעלה ביצה. ג העובר elegans מספק הזדמנות מצוינת להתבוננות האירועים הראשונים של הפעלת ביצה embryogenesis. העובר הוא שקוף ואירועים התפתחותי מוקדם להתרחש מהר יחסית לאחר ההפריה. ג החוקרים elegans יצרו זנים רבים מהונדס שימושי להביע fluorescently חלבונים שכותרתו מעורב בפיתוח מוקדם. שימוש אלו זנים יחד עם RNAi או מוטציות מספק מערכת רבת עוצמה לנתח את המסלולים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות של האורגניזם הרב (5, 6, 7, 8). מאמר זה מציג וידאו גישה מעשית באמצעות כלים אלה וטכניקות לתעד אירועים במהלך embryogenesis בראשית ג elegans.

בוגרים ג הביצית elegans הוא נעצר prophase של המיוזה I ו מופרית spermatheca של אנדרוגינוס מבוגר. לאחר ההפריה, הביצית התמורה באמצעות שאר המיוזה I ו-II. בשלבים אלה ניתן לצפות באמצעות H2B היסטון שכותרתו fluorescently (5). במהלך השלמת המיוזה אימהית, ה-DNA הזרע נשאר מרוכז (ראה איור 1). לאחר השלמת המיוזה, ה-DNA אימהי ואבהי הופך decondensed ואת ליצור שתי pronuclei. Pronucleus אימהית נודד לכיוון pronucleus אבהי והם להצטרף יחד ליד מרכז של העובר. מיטוזה מתפתח במהירות אחרי הפגישה pronuclear. כל האירועים הללו מתרחשים פחות משעה. לפיכך, זמן לשגות מיקרוסקופיה של רצף זה של אירועים יכול להתבצע בקלות. ביצוע הטכניקה הזו מחייבת מתקן מסוים culturing נמטודות, כמו גם מיומנויות בסיסיות מיקרוסקופיה בנוסף גישה מיקרוסקופ confocal.

הדוגמה המוצג כאן מנצל ג מהונדס זן שמבטא elegans שני חלבונים פלורסנט, GFP: היוביקוויטין ו mCherry: H2B. מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר משמש כדי לצפות לוקליזציה דינמי של שני חלבונים. בנוסף, אנו מראים כי הזרקת Lysotracker שכותרתו fluorescently ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר גורלם של lysosomes העובר לאחר ההפריה. הזרקה של גשש שכותרתה יכול גם להתבצע עבור להדמיה של ריכוזי הסידן במיטוכונדריה או מקומי (9). בתיאוריה, פרוטוקול הזרקת יכול לשמש כדי להציג כל סוג של מולקולה שכותרתו fluorescently בעובר. זה יכול לכלול מולקולות קטנות שכותרתו, חלבונים, שומנים, וכו 'במקרים מסוימים, ייתכן שלא יהיה צורך להזריק למעשה עוקבים אחר שכותרתו התולעים ברצון ספיגת כמה צבעים כגון mitotracker (10). עם זאת, ניסינו גם השריית הזרקת lysotracker ומצאו תוצאות טובות הרבה יותר עם הזרקה להדמיה בעוברים.

שיקולים טכניים:

האתגרים הטכניים בפני הליך זה לכלול את הטכניקה microinjection כמו גם הקושי הדמיה עוברי מוקדם מאוד. לגבי microinjections, עובי משטח הזרקת agarose הוא קריטי עבור זריקות מוצלחות. אם כרית עבה מדי, התולעים dessicate ומתים במהירות. אם כרית היא רזה מדי, התולעים לא ידבק כרית במהלך תהליך ההזרקה.

עוברי מוקדם יכולים להיות רגישים לתנאי הסביבה, כגון טמפרטורה ותנאי חיץ. עוברים סוג Wild ליזום decondensation-DNA של הזרע והגירה pronuclear בתוך דקה או שתיים של השלמת המיוזה השנייה (4). בתוך 20 דקות, cytokinesis הראשון צריך להתחיל. אם עוברים נחשפים עוצמת הלייזר גבוהה מאוד או יתר על המידה או כתוש במהלך ההרכבה, תהליך זה עשוי להיות מופרת. עוברים כאלה יעצרו פיתוח. במקרה זה, הניסוי יש לחזור עם כוח לייזר ירידה או משטח עבה agarose.

C. elegans עוברי לא מפרישים פגז ביצה שלהם עד זמן קצר לאחר ההפריה. בזמן הקצר שבין ההפריה ואת הפרשת קליפת ביצה, העוברים אינם קיימא מחוץ לאם (11). במעבדות יש להימנע אתגר זה על ידי עוברי הדמיה ברחם (5, 12). ברחם הדמיה מציעה יתרונות מסוימים, כגון היכולת ללכוד האירועים המתרחשים במהלך או מיד לאחר ההפריה. עם זאת, טכניקה זו דורשת שימוש של מערכת מיקרוסקופית המאפשרת הדמיה רקמות עמוק. מערכות כגון שני פוטונים או רב פוטון מתאימים במיוחד בשביל זה (13, 14). בעת שימוש רגיל לייזר סריקה או ספינינג מיקרוסקופ דיסק confocal, את התמונות הטובות ביותר מתקבלים מעוברים כי חהיש נחתך מתוך התולעת הבוגרת כפי שמתואר כאן.

הדמיה שיקולי המערכת:

סוג של מערכת הדמיה confocal בשימוש תלוי הצרכים של המשתמשים. באופן כללי, סריקת מערכות לייזר מומלץ אם אדם רוצה לרכוש תמונות ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית. מצד שני, מערכות דיסק ספינינג מתאימים יותר עבור תהליכי הדמיה דינמית מאוד כמו רכישת התמונה היא מהירה יחסית photobleaching / phototoxicity מצטמצם.

הפרמטרים הדמיה ספציפיות ישתנה בהתאם לעיצוב ניסיוני מערכת הדמיה confocal מועסק. בשנת הדמיה רב ממדית, צריך לשקול את מספר הערוצים, מטוסים מוקד, זמן נקודות נאספים. בשל ההשפעות של הגבלת photobleaching ו phototoxicity, מספר סופי של תמונות ניתן לרכוש בניסוי נתון. לכן, אם תבחר להגדיל את מספר ערוצי להיות נרכשת, סביר להניח שאתה צריך להקטין את מספר מטוסי מוקד ו / או בנקודות זמן ולהיפך. המספר הכולל של תמונות ניתן לרכוש תושפע מעוצמת fluorophore עתה הדמיה כמו גם הרגישות של מיקרוסקופ confocal בשימוש. Fluorophores אינטנסיבי יותר מכשירים רגישים יותר ידרוש זמן חשיפה קצר יותר ובכך לייצר photobleaching פחות phototoxicity.

מספר גדול או מערכות הדמיה זמינים. אנו נותנים פרטים על מערכות שהיו בשימוש במעבדות שלנו. עבור עוברי תולעת הדמיה במיקרוסקופ על ידי ספינינג דיסק confocal, אנו משתמשים במיקרוסקופ TE2000U Nikon הפוך מצויד 60X/1.4 NA תוכנית המטרה Apo. המיקרוסקופ מחובר יחידת Yokogawa דיסק CSU10 ספינינג, Hamamatsu C9100 EM-13 מצלמת CCD, וכן Spectral Applied Research LMM5 מודול לייזר למזג ובה ארבע לייזרים של מצב מוצק עם תפוקה ב 405, 491, 561 ו - 655 ננומטר. באמצעות מערכת זו אנו יכולים ללכוד אחד או שני ערוצים, 6-12 מטוסי מוקד, ו - 25-50 timepoints (ב 30-60 במרווחים שנייה). זמן חשיפה טיפוסית 100-200 אלפיות השנייה.

עבור עוברי הדמיה עם לייזר מיקרוסקופיית confocal, אנו משתמשים Zeiss LSM700 מצויד 2 ערוצים וארבעה לייזרים של מצב מוצק (405, 488, 555, ו 635 ננומטר). מערכת זו מחוברת מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Axio הפוכה עם מטרה, תוכנית Apo 63X/1.4NA המשמש הדמיה העובר. המערכת משתמשת בתוכנה ZEN Zeiss לרכישת תמונה אשר מספקת גם עיבוד תמונה ניתוח מוגבל. כאשר הדמיה עם שני fluorochromes, אנחנו בדרך כלל מתכנסים 1-5 מטוסים מוקד (~ 0.5 מיקרומטר בנפרד) ואוספת ערמה Z כל 15 שניות. אוספים הם נמשכו עד photobleaching משמעותי התרחש. כדי ליצור את הווידאו הסופי זמן לשגות, תמונות Z מחסנית מאוחדים באמצעות הכלי הקרנת המרבי בתוכנה ZEN. וידאו מיוצאים מהתוכנה כמו קבצי AVI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg Buffer			5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM Mg Acetate, 5mM CaCl2
Mitotracker	Invitrogen	M-7512
Lysotracker	Invitrogen	L-7525
Injection Capillary Pipet	Harvard Apparatus	GC120F-10
Needle Puller	Kopf Instruments	Model 700C
Microinjector Apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1 microinjection regulator