Summary
यह लेख निमेटोड में embryogenesis के प्रारंभिक घटनाओं के दृश्य के लिए एक तकनीक का वर्णन
Abstract
Caenorhabditis एलिगेंस अक्सर जल्दी विकास की प्रक्रिया के अध्ययन में एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है है. भ्रूण, आनुवंशिक संसाधनों, और परिवर्तन के रिश्तेदार आसानी के पारदर्शिता के गुण है कि बनाने सी. जल्दी embryogenesis के लिए एक शानदार मॉडल एलिगेंस . लेजर आधारित confocal माइक्रोस्कोपी और fluorescently लेबल टैग शोधकर्ताओं विकासशील भ्रूण में विशिष्ट सेलुलर संरचनाओं और प्रोटीन का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं. उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट organelles, lysosomes या mitochondria के रूप में पालन करें, रंजक fluorescently लेबल का उपयोग कर सकते हैं. इन रंगों microinjection के माध्यम से जल्दी भ्रूण के लिए वयस्क जननपिंड में कर दिया जा सकता है. इसके अलावा, विशिष्ट प्रोटीन का स्थानीयकरण फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है. उदाहरण यहाँ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक फ्लोरोसेंट lysosomal डाई का उपयोग fluorescently टैग histone और ubiquitin प्रोटीन का प्रदर्शन प्रस्तुत कर रहे हैं. लेबल histone डीएनए कल्पना और इस प्रकार कोशिका चक्र की अवस्था की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है. GFP टैग जल्दी भ्रूण में ubiquitin ubiquitinated vesicles की गतिशीलता का पता चलता है. लेबल lysosomes और GFP की टिप्पणियों: ubiquitin अगर वहाँ ubiquitinated vesicles और lysosomes बीच colocalization है निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Lysosomal डाई के microinjection के लिए एक तकनीक प्रस्तुत किया है. Transgenenic उपभेदों पैदा करने के लिए तकनीक कहीं प्रस्तुत कर रहे हैं (1, 2). इमेजिंग के लिए, भ्रूण वयस्क उभयलिंगी नेमाटोड के बाहर काट रहे हैं और 2% agarose पैड पर घुड़सवार एक मानक लेजर confocal खुर्दबीन या एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन स्कैनिंग पर समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया. इस पद्धति जल्दी embryogenesis के उच्च संकल्प दृश्य के लिए प्रदान करता है.
Protocol
1. निमेटोड संस्कृतियों
- उपयुक्त सी. प्राप्त एलिगेंस Caenorhabditis जेनेटिक्स स्टॉक केंद्र (CGC) से या एक सहयोगी से तनाव.
- एन जी एम अगर एक OP50 बैक्टीरियल लॉन (3) के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों पर नेमाटोड हो जाओ. 25 में GFP उपभेदों के विकास के विश्लेषण के लिए ° सी की सिफारिश की है.
- अपने माइक्रोस्कोपी प्रयोग से पहले दिन, वरीयता प्राप्त प्लेटों पर कम से कम 40 L4 लार्वा पर 25 प्लेटें लेने और डिग्री सेल्सियस रातोंरात जगह. ये कीड़े प्रयोग युवा वयस्कों के लिए किया जाएगा.
2. इंजेक्शन
यदि यह lysosomes या mitochondria के रूप में ऐसी संरचनाओं को देखने के लिए वांछनीय है, वयस्कों फ्लोरोसेंट रंजक के साथ अंतःक्षिप्त किया जा सकता है दृश्य करने के लिए पहले.
- सूखे agarose इंजेक्शन पैड तैयार. (यह कई दिनों के लिए एक जा सकता है पहले से किया)
- पानी में पिघला हुआ 2% agarose तैयार करें. पाश्चर विंदुक के साथ एक 22X54 मिमी coverglass पर 2 बूँदें डाल दिया. दूसरे coverglass ड्रॉप के शीर्ष पर पार वार प्लेस. आदेश में उचित मोटाई को प्राप्त करने के लिए, शीर्ष coverglass पर दबाएँ जब तक पैड का व्यास 1.5 सेमी के आसपास है. 5-10 मिनट के लिए बैठते हैं.
- शीर्ष coverglass निकालें. यह 1 घंटे के लिए एक 80 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखकर agarose पैड निर्जलीकरण या benchtop पर रातोंरात बैठने की अनुमति.
- Mitotracker या Lysotracker समाधान तैयार है.
- अंडे बफर में फ्लोरोसेंट एजेंट पतला. हम आम तौर पर Mitotracker या Lysotracker के 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग करें.
- इंजेक्शन सुई एक 1.2 आयुध डिपो गिलास केशिका से बना है. इंजेक्शन सुई का उपयोग कर एक सुई खींचने खींचो.
- खींचा Pastuer pipet का उपयोग करने के लिए वापस पतला रंग के साथ सुई भर.
- प्रकाश मुक्त, उपयोग के जब तक humidified कक्ष में रखें सुई.
- पूर्व इंजेक्शन: खुर्दबीन और सुई की स्थापना.
- माउंट पर इंजेक्शन की सुई इंजेक्शन तंत्र. हमारे तंत्र Narishige प्रत्यक्ष ड्राइव एक Nikon TE200 उल्टे डीआईसी इमेजिंग क्षमता के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के मंच पर घुड़सवार micromanipulator है.
- एक 1.2 मिमी आईडी ट्यूब है कि दबाव नियामक से जुड़ा है सुई कनेक्ट. या तो संपीड़ित हवा या नाइट्रोजन एक बाहरी दबाव के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. नियामक 20-25 साई सेट.
- 2 इंजेक्शन पैड पर भारी खनिज तेल (Parafin तेल) प्लेस के बूँदें.
- खुर्दबीन पर इंजेक्शन पैड प्लेस और कम तेल में सुई. यकीन है कि द्रव प्रवाह स्वतंत्र रूप से सुई से जब दबाव लागू होता है की जाँच करें. इंजेक्शन दबाव लागू करें और निरीक्षण चाहे तरल पदार्थ सुई से बाहर बहती है. यदि नहीं, तो आप को धीरे से सुई के अंत को तोड़ने की आवश्यकता होगी. सुई धीरे टूटी इंजेक्शन पैड पर रखा coverglass के एक छोटे बिट में टिप ड्राइविंग द्वारा तोड़ा जा सकता है है. बाद सुई बह रहा है, अगले चरण पर चलते हैं.
- इंजेक्शन.
- लगभग 1 घंटे देखने के भ्रूण से पहले, इंजेक्शन पैड पर तेल की बूंद में युवा वयस्क कीड़े हस्तांतरण. इस विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हस्तांतरण निष्पादित. स्थानांतरित कीड़े के लिए एक उठाई टिप के साथ एक प्लैटिनम तार कीड़ा लेने का उपयोग करें.
- 10 कीड़े इतना है कि वे सीधे पैड पर झूठ बोल रहे हैं - 3 व्यवस्थित. इंजेक्शन के लिए, यह आसान है अगर कीड़े को लाइन में खड़ा कर रहे हैं समानांतर एक दूसरे से और एक कीड़ा लंबाई थोड़ी कम से कम अलग. एक बार कीड़े इंजेक्शन पैड पर हैं यह महत्वपूर्ण है जल्दी से काम और इंजेक्शन प्रक्रिया को पूरा करने से पहले कीड़े desiccation से नाश.
- इंजेक्शन सूक्ष्मदर्शी की खुर्दबीन मंच पर कीड़े के साथ coverglass रखें. बाहर का जननपिंड ट्यूब के मध्य भाग (rachis) में ध्यान दें. फिर micromanipulator का उपयोग करने के लिए एक ही फोकल हवाई जहाज़ में सुई की नोक कदम. चरण क्षैतिज इतना है कि कीड़ा सुई द्वारा पंचर है हटो. एक बार सुई की नोक rachis अंदर है, दबाव लागू और जननपिंड डाई मिश्रण के साथ भरने के लिए अनुमति देते हैं. इंजेक्शन पैड पर सभी कीड़े के दोनों जननपिंड हथियार इंजेक्षन.
- इंजेक्शन के बाद, एक खींचा पाश्चर pipet उपयोग के कीड़े के लिए अंडे बफर के बारे में 0.5 मिलीलीटर देने. यह उन्हें निर्जलीकरण के मरने से रखने के लिए और उन्हें इंजेक्शन प्रक्रिया से उबरने के लिए अनुमति देगा.
- कीड़े कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए एक प्रकाश मुक्त humidified कक्ष में ठीक करने के लिए अनुमति दें.
3. Agarose भ्रूण को देखने के लिए पैड
- अंडे बफर में पिघला हुआ 2% agarose तैयार करें.
- पाश्चर pipet के साथ, एक साफ खुर्दबीन स्लाइड पर पिघला हुआ agarose के 3 बूँदें डाल दिया.
- दो अन्य स्लाइड्स कि उन्हें कवर टेप लेबलिंग की एक परत के बीच प्लेस स्लाइड. इन spacers कि यह सुनिश्चित करेंगे कि आपके agarose पैड सही मोटाई है के रूप में सेवा करते हैं.
- एक दूसरे स्वच्छ खुर्दबीन स्लाइड लंबरूप agarose बूँदें पर नीचे रखें. नीचे प्रेस जब तक ऊपर स्लाइड गाइड स्लाइड्स से टेप पर टिकी हुई है.
- बस से पहले आप के अवलोकन के लिए भ्रूण माउंट तैयार हैं, शीर्ष स्लाइड को हटा दें.
- यदि कीड़े इंजेक्शन नहीं किया गया है, अगले दो चरणों का पालन करें. वरना उन्हें छोड़.
- थाली है कि एक दिन पहले तैयार किया गया था से एक युवा वयस्क कीड़े चुनें. आप युवा वयस्कों के अंदर भ्रूण को देखने के लिए सक्षम होना चाहिए.
- एक गैरवरीय एन जी एम थाली पर 5-20 कीड़े उठाओ. कीड़े के आसपास गैरवरीय थाली पर क्रॉल करने के लिए कुछ मिनट के लिए इतना है कि बैक्टीरिया है कि उन्हें अटक गया है के कीड़े सबसे खो देंगे की अनुमति दें.
- वयस्क कीड़े से युवा भ्रूण को प्राप्त
- एक 18 मिमी 2 गिलास coverglass (1.5 का एक coverglass मोटाई बेहतर है) के बीच में 5-20 अंडे बफर के μl ड्रॉप प्लेस.
- गैरवरीय थाली या इंजेक्शन पैड से कीड़े अंडे बफर के ड्रॉप में ले जाएँ.
- एक 26 गेज चमड़े के नीचे सुई के साथ खुला कीड़े काटो. योनी के पास कीड़ा खोलने के कट. तुम देखना चाहिए भ्रूण कृमि के बाहर फैल.
- खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट
- खुर्दबीन स्लाइड कि agarose पैड के साथ तैयार किया गया था और यह भ्रूण के साथ coverglass पर कम उलटें.
- यदि विस्तारित समय चूक की आवश्यकता है, पेट्रोलियम जेली का उपयोग coverglass के किनारों को सील करने dessication को रोकने.
5. माइक्रोस्कोपी
- उपयुक्त भ्रूण ढूँढना.
- खुर्दबीन मंच पर प्लेस स्लाइड. 10X लेंस के साथ स्कैन करने के लिए भ्रूण को खोजने के लिए.
- प्रारंभिक चरण भ्रूण, भ्रूण कि मातृ अर्धसूत्रीविभाजन को पूरा करने की प्रक्रिया में हैं के लिए खोज. Meiotic भ्रूण बाद भ्रूण से प्रतिष्ठित किया जा सकता है क्योंकि वे छोटा नहीं आया है. (के बाद भ्रूण अर्धसूत्रीविभाजन पूरा कर लिया है, तो आप सेल और पूर्वकाल अंत में अंडा खोल झिल्ली के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर देख सकते हैं.)
- एक बार जब आप की पहचान की है एक उचित भ्रूण का मंचन किया, embryogenesis की रिकॉर्डिंग के लिए एक उच्च बृहत्तरकरण लेंस करने के लिए कदम.
- इमेजिंग
- इस उदाहरण में, हम भ्रूण कि mCherry व्यक्त की कल्पना कर रहे हैं: H2B और GFP: यूबी टैग प्रोटीन. हम Zeiss LSM700 पारंपरिक लेजर खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर रहे हैं.
- छवियाँ 63X 1.4NA लेंस का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं. 488 और 555 लेज़रों न्यूनतम लेसर शक्ति और अधिकतम लाभ के साथ किया जाता है. AZ ढेर हर 10-15 सेकंड एकत्र की है. Photobleaching की सीमा पर निर्भर करता है, 30-60 समय अंक एकत्र कर रहे हैं. Z ढेर छवियों अंतिम समय चूक वीडियो के लिए एक अधिकतम प्रक्षेपण छवि में गिर रहे हैं.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 सी में प्रथम सूत्रीविभाजन के लिए निषेचन. एलिगेंस.
चित्रा 2 Microinjection प्रक्रिया.
पूरक 1 वीडियो GFP का समय व्यतीत हो वीडियो. एक meiotic भ्रूण में ubiquitin प्लस Lysotracker ब्लू लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के.
Discussion
शुक्राणु के साथ विलय के बाद, युग्मनज गतिशील घटनाओं की एक श्रृंखला आए. इन घटनाओं के तेजी से विकसित हो रहा भ्रूण में एक अपेक्षाकृत स्थिर सेल से oocyte बदलना. कई जीवों में, cytoplasmic rearrangements भ्रूण polarity स्थापित करने के लिए और अंडे के सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण हैं. सी. एलिगेंस भ्रूण अंडे सक्रियण और embryogenesis के इन प्रारंभिक घटनाओं के अवलोकन के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है. भ्रूण पारदर्शी है और जल्दी विकासात्मक घटनाओं होते निषेचन के बाद अपेक्षाकृत तेजी से सी.. एलिगेंस शोधकर्ताओं ने कई उपयोगी ट्रांसजेनिक उपभेदों कि fluorescently लेबल जल्दी विकास में शामिल प्रोटीन व्यक्त उत्पन्न किया है. आरएनएआई या म्यूटेंट के साथ साथ इन उपभेदों का उपयोग आणविक मार्ग है कि एक बहुकोशिकीय जीव के विकास (5, 6, 7, 8) आबाद विदारक के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करता है. इस वीडियो में लेख के लिए इन उपकरणों और तकनीकों का उपयोग करने के लिए सी. में जल्दी embryogenesis दौरान घटनाओं रिकॉर्ड एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रस्तुत एलिगेंस.
परिपक्व सी. एलिगेंस oocyte अर्धसूत्रीविभाजन मैं prophase में गिरफ्तार कर लिया है और वयस्क द्विलिंग के spermatheca में निषेचित है. निषेचन के बाद, अर्धसूत्रीविभाजन मैं और द्वितीय के शेष के माध्यम से oocyte आय. इन चरणों fluorescently लेबल histone H2B (5) का उपयोग कर देखा जा सकता है है. मातृ अर्धसूत्रीविभाजन के पूरा होने के दौरान, शुक्राणु डीएनए गाढ़ा रहता है (चित्रा 1 देखें). अर्धसूत्रीविभाजन के पूरा होने के बाद, मातृ और पैतृक डीएनए decondensed और दो pronuclei फार्म का हो जाता है. मातृ pronucleus पैतृक pronucleus की दिशा में उत्प्रवासित और वे भ्रूण के केन्द्र के निकट एक साथ शामिल हो. सूत्रीविभाजन जल्दी से pronuclear बैठक के बाद ensues है. इन सभी घटनाओं की एक घंटे से भी कम समय में होते हैं. इस प्रकार, घटनाओं के इस दृश्य के समय चूक माइक्रोस्कोपी आसानी से पूरा किया जा सकता है. इस तकनीक का प्रदर्शन निमेटोड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक confocal खुर्दबीन के लिए उपयोग करने के लिए इसके अलावा में संवर्धन बुनियादी माइक्रोस्कोपी कौशल में कुछ सुविधा की आवश्यकता है.
उदाहरण यहाँ प्रस्तुत एक ट्रांसजेनिक सी. इस्तेमाल एलिगेंस तनाव है कि दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP व्यक्त: ubiquitin और mCherry: H2B . एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के लिए इन दो प्रोटीनों के गतिशील स्थानीयकरण का पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, हम बताते है कि fluorescently लेबल Lysotracker के इंजेक्शन निषेचन के बाद भ्रूण में lysosomes के भाग्य का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक लेबल पर नजर रखने के इंजेक्शन भी mitochondria या स्थानीय कैल्शियम की सांद्रता (9) के दृश्य के लिए किया जा सकता है. सिद्धांत रूप में, इंजेक्शन प्रोटोकॉल भ्रूण में fluorescently लेबल अणु के किसी भी प्रकार को देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस लेबल छोटे अणुओं, प्रोटीन, lipids, आदि कुछ मामलों में शामिल हो सकता है, यह आवश्यक नहीं हो सकता है वास्तव में कीड़े आसानी से तेज mitotracker (10) जैसे कुछ रंगों के रूप में लेबल trackers इंजेक्षन सकता है. हालांकि, हम दोनों भिगोने और lysotracker के इंजेक्शन की कोशिश की है और भ्रूण में दृश्य के लिए इंजेक्शन के साथ बेहतर परिणाम मिला है.
तकनीकी बातें:
इस प्रक्रिया के साथ प्रस्तुत तकनीकी चुनौतियों microinjection के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इमेजिंग में कठिनाई बहुत जल्दी भ्रूण तकनीक शामिल हैं. Microinjections के बारे में, agarose इंजेक्शन पैड की मोटाई सफल इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है. यदि पैड भी मोटी है, कीड़े dessicate और जल्दी से मर जाएगा. यदि पैड बहुत पतली है, कीड़े इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान पैड छड़ी नहीं होगा.
जल्दी भ्रूण तापमान और बफर की स्थिति के रूप में पर्यावरण की स्थिति के प्रति संवेदनशील हो सकता है. जंगली प्रकार भ्रूण शुक्राणु डीएनए और अर्धसूत्रीविभाजन II (4) को पूरा करने के या तो एक मिनट के भीतर pronuclear प्रवास के decondensation आरंभ करना चाहिए. 20 मिनट के भीतर, पहली cytokinesis शुरू करना चाहिए. भ्रूण यदि बहुत उच्च लेजर तीव्रता को उजागर कर रहे हैं या गरम कर रहे हैं या बढ़ते दौरान कुचल दिया, इस प्रक्रिया को बाधित किया जा सकता है. इस तरह के भ्रूण के विकास गिरफ्तारी होगी. यदि ऐसा होता है, प्रयोग कम लेसर शक्ति या एक मोटा agarose पैड के साथ दोहराया जाना चाहिए.
सी एलिगेंस भ्रूण निषेचन के बाद शीघ्र ही जब तक उनके अंडे खोल नहीं छिपाना. निषेचन और अंडा खोल के स्राव के बीच कम समय के दौरान, भ्रूण माँ (11) के बाहर व्यवहार्य नहीं कर रहे हैं. कुछ प्रयोगशालाओं utero में इमेजिंग भ्रूण (5, 12) से इस चुनौती से बचा है utero में इमेजिंग घटनाओं है कि के दौरान या बाद निषेचन होने पर कब्जा करने की क्षमता के रूप में कुछ लाभ प्रदान करता है है.. हालांकि, इस तकनीक माइक्रोस्कोपी प्रणाली है कि गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है के उपयोग की आवश्यकता है. दो photon या बहु फोटान जैसे सिस्टम विशेष रूप से इस (13, 14) के लिए अनुकूल हैं. जब एक पारंपरिक लेजर स्कैनिंग या कताई डिस्क confocal खुर्दबीन, सबसे अच्छा चित्र भ्रूण से प्राप्त कर रहे हैं कि हा का उपयोगve वयस्क कृमि के बाहर कट गया है के रूप में यहाँ वर्णित है.
इमेजिंग प्रणाली बातें:
confocal इमेजिंग प्रणाली का इस्तेमाल किया प्रकार के उपयोगकर्ताओं की आवश्यकताओं पर निर्भर करता है है. सामान्य में, लेजर स्कैनिंग सिस्टम अगर एक इच्छाओं को उच्चतम संभव संकल्प के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. दूसरी ओर, कताई डिस्क सिस्टम बेहतर इमेजिंग अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के लिए अनुकूल हैं के रूप में छवि अधिग्रहण अपेक्षाकृत तेजी से है और photobleaching / phototoxicity कम है.
विशिष्ट इमेजिंग मापदंडों प्रयोगात्मक डिजाइन और confocal इमेजिंग कार्यरत प्रणाली पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. बहुआयामी इमेजिंग में, एक चैनल, फोकल विमानों, समय और अंक जा रहा है एकत्र की संख्या पर विचार करने की जरूरत है. Photobleaching और phototoxicity के सीमित प्रभाव के कारण, किसी भी प्रयोग में छवियों के एक परिमित संख्या में प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार, यदि आप का अधिग्रहण किए जाने वाले चैनलों की संख्या में वृद्धि करने के लिए चुनते हैं, तो आप संभावना फोकल विमानों और / या समय अंक और इसके विपरीत की संख्या को कम करने की आवश्यकता होगी. छवियाँ है कि प्राप्त किया जा सकता है की कुल संख्या के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है confocal खुर्दबीन के संवेदनशीलता के रूप में अच्छी तरह से imaged किया जा रहा की fluorophore तीव्रता से प्रभावित हो जाएगा. अधिक तीव्र fluorophores और अधिक संवेदनशील उपकरणों कम जोखिम बार की आवश्यकता होती है और इस प्रकार कम photobleaching और phototoxicity उत्पादन होगा.
एक बड़ी संख्या या इमेजिंग सिस्टम उपलब्ध हैं. हम प्रणाली है कि अपनी प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है पर विवरण दे देंगे. कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग कीड़ा भ्रूण के लिए, हम एक Nikon TE2000U उल्टे ए पी ओ उद्देश्य योजना NA 60X/1.4 के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. खुर्दबीन Yokogawa CSU10 कताई डिस्क इकाई, EM C9100-13 सीसीडी कैमरा हमामात्सू, और एक वर्णक्रमीय एप्लाइड रिसर्च LMM5 लेजर मर्ज मॉड्यूल उत्पादन के साथ 405 पर चार ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण से युक्त, 491, 561 और 655 एनएम के लिए जुड़ा हुआ है. इस प्रणाली का उपयोग हम एक या दो चैनल, छह से बारह फोकल विमानों, और 25 से 50 timepoints (30 से 60 सेकंड के अंतराल पर) पर कब्जा कर सकते हैं. एक ठेठ जोखिम समय 100 से 200 मिसे है.
Confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर के साथ इमेजिंग भ्रूण के लिए, हम एक LSM700 Zeiss 2 चैनलों और चार ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण (405, 488, 555, और 635 एनएम) के साथ सुसज्जित का उपयोग करें. इस प्रणाली से जुड़ी एक योजना ए पी ओ 63X/1.4NA भ्रूण इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया उद्देश्य के साथ एक Zeiss Axio ऑब्जर्वर उलटा माइक्रोस्कोप है. सिस्टम छवि अधिग्रहण के लिए Zeiss ज़ेन सॉफ्टवेयर है जो भी सीमित इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण प्रदान करता है का उपयोग करता है. जब दो fluorochromes साथ इमेजिंग, हम आम तौर पर 1-5 फोकल विमानों (~ 0.5 अलावा सुक्ष्ममापी) इकट्ठा और एक Z ढेर हर 15 सेकंड इकट्ठा. संग्रह महत्वपूर्ण photobleaching तक हुआ है जारी कर रहे हैं. अंतिम समय चूक वीडियो उत्पन्न करने के लिए, जेड ढेर छवियों ज़ेन सॉफ्टवेयर में अधिकतम प्रक्षेपण उपकरण का उपयोग करने के लिए समेकित कर रहे हैं. वीडियो AVI फ़ाइलें के रूप में सॉफ्टवेयर से निर्यात कर रहे हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R15 लेग GM065444-03) (NIH) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मधुमेह और पाचन और गुर्दा रोग (को) के राष्ट्रीय संस्थानों के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम से धन स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. एक NSF पुरस्कार DBI (0,923,402) LSM700 confocal खुर्दबीन के अधिग्रहण वित्त पोषित. हम भी सामान्य सहायता और डॉ. एंडी गोल्डन से पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी को स्वीकार करना होगा. क्रडिट साझा संसाधनों, प्रोटोकॉल, और विचारों के लिए पूरे सी. एलिगेंस समुदाय को जाता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg Buffer | 5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM Mg Acetate, 5mM CaCl2 | ||
| Mitotracker | Invitrogen | M-7512 | |
| Lysotracker | Invitrogen | L-7525 | |
| Injection Capillary Pipet | Harvard Apparatus | GC120F-10 | |
| Needle Puller | Kopf Instruments | Model 700C | |
| Microinjector Apparatus | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 microinjection regulator |
References
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