Summary
溶瘤病毒是有希望的癌症治疗。的能力，以确定的活组织标本从患者治疗前infectability，是一个独特的优势，这种治疗方法。本协议描述了如何处理组织
Abstract
溶瘤病毒（OVS）选择性复制和杀灭肿瘤细胞的1的新型疗法。多种，包括单纯疱疹病毒，呼肠孤病毒，牛痘OVS作为癌症治疗的溶瘤平台的有效性进行评估的临床试验目前正在进行2-5。溶瘤病毒的主要特点之一是它们可以被转基因快报记者转基因，这使得它能够以可视化的显微镜或生物发光成像 6,7组织感染。这提供了一个独特的优势，因为它是可能的感染治疗之前， 患者体内组织，以确定的溶瘤病毒治疗成功 8的可能性。为此，关键是适当样本，以弥补组织的异质性和评估组织的生存能力，特别是前9感染的组织。同样重要的是按照病毒的复制，记者转基因溶瘤平台以及以下的同质化，以歧视胎死腹中和生产力之间的感染组织的直接滴定表示。本议定书的目的是要解决这些问题，本文介绍1。细胞培养2肿瘤组织取样和准备。该组织的可行性评估，使用的代谢染料alamar蓝色3。体外感染牛痘病毒的培养组织表达GFP或萤火虫荧光素酶4。转基因表达的检测，荧光显微镜或使用活体成像系统（IVIS） 5。斑块的检测病毒的定量。这种全面的方法提出了几个优点，包括便于组织处理，组织异质性的补偿，控制组织活力，和流产的感染和骨真正的病毒复制之间的歧视。
Protocol
1。组织处理
- 为了达到最佳效果，本议定书应使用新鲜分离的组织在DMEM媒体含10％FBS，1％Pennicilin /链霉素溶液，0.1％Amphothericin B溶液立即手术后加工前交存。如果这是不可能的，组织可以留过夜，4度加工之前，在这个媒介。
- 处理样品之前，至少5分钟，他们存放在一个70％的乙醇溶液消毒金属钳和一次性刀片。还准备用2毫升含10％FBS，1％Pennicilin /链霉素溶液，0.1％Amphothericin B.的DMEM媒体24孔板
- 在层流罩细胞培养，使用消毒镊子收集组织样本，并存入一个空15厘米的培养皿中的组织，保持侧面的盖子，无菌的一面。
- 在细胞培养罩，使用2毫米活检冲床，获得的各种组织内的区域，如图1不同的内核。存款与产钳的帮助下15厘米的培养皿的盖子的核心，在每个核心之间留下足够的空间，使他们可以很容易地沿水平轴切。
- 分割成4甚至用消毒的刀片，如图1季度每个核心。
- 使用吸管尖，在不同的井，从A1核心每个核心季度为A4，如图1中，已经包含了1.5毫升的DMEM含10％FBS，1％Pennicilin /链霉素溶液，0.1％Amphothericin B液。重复每个核心。这应使肿瘤的代表性抽样，同时尽量减少在一个给定的井/条件的偏见。为了更好的代表性，增加核心的数量。
2。组织可行性评估
- 以下组织处理，加25μlAlamar蓝以及＃A1＃A2的如图1所示，并与5％CO2培养箱在37度孵育1小时。
- 以下孵化alamar蓝色，删除3倍，从每个A1和A2 100μL，转移到一个96孔板不同井。使用荧光酶标仪（530励磁，590排放）读取信号，并记录您的数据。
- Alamar蓝信号已被阅读后，转移组织的所有作品，用吸管尖，从孔A1至C1包含的DMEM，10％FBS + PS + AmphoB。要小心，不要过量的媒体传输孔A1。
- 感染井A3和A4分别为10 6 PFU的绿色荧光蛋白表达和荧光素酶表达的牛痘病毒在25μL媒体稀释。 A2可以用，根本没有表示任何特定的基因，包括病毒感染。
- 72小时后，加入25μLAlamar蓝井C1和D1，并重复步骤2.2
3。 GFP转基因表达的荧光显微镜可视化
- 删除所有的细胞培养介质覆盖的组织块，以良好的荧光图片。
- 使用荧光功能的解剖镜下，先取相衬图像，在一个适当的决议
- 切换到荧光模式，并使用适当的过滤器，可视化在这种情况下，绿色荧光蛋白的转基因利益，拍照。
- 用另一种波长的利益（如RFP）的转基因尽量可能的一个图片的背景荧光的荧光过滤器
4。荧光素酶表达的可视化使用活体成像系统（ IVIS）
- 确保IVIS是初始化，然后再开始。
- 在井A4和B4，添加5μL荧光素底物10毫克/毫升，拌匀5分钟，在室温孵育。
- IVIS曝光时间设置为5秒，您的井的图片。如果图像是饱和的，重复使用较低的曝光时间。如果没有信号，增加曝光时间。
- 使用IVIS成像软件，您可能会去除背景，使用以及B4的信号，并选择地区的利益，以量化的发光信号。
5。评估斑块检测病毒滴度
- 量化病毒滴度在此之前，组织必须先匀浆释放病毒颗粒。这可以在数个月后，受感染的组织样本保存于-80
- 称取样品，需要使用分析规模匀浆。在这种情况下，我们将使用收集的样本以及A2。
- 将组织5毫升聚苯乙烯圆底的Falcon管，并添加1毫升的PBS。使用组织匀浆器匀浆的组织。如果有必要，储存于-80匀浆病毒滴度在稍后的时间评估。
- 滴度牛痘病毒，第一盘1万U2OS细胞在6孔板，在37度孵育过夜，5％的CO 2潮湿ified孵化器，他们已达到约95％汇合翌日。
- 使用无血清媒体做系列稀释的病毒，一定要更改之间的每个稀释步骤的提示。通常情况下，我们在10稀释1 100μL转移到900μL。如何作出许多稀释取决于病毒的预期收益率。
- 使稀释后，除去覆盖镀U20S细胞，然后加入500μL稀释病毒的股票（每个稀释度）感染U2OS细胞的媒体。在37摄氏度度在5％ 二氧化碳培养箱中孵育1小时分钟的细胞。
- 在此期间，热身2 ×集中的DMEM含20％胎牛血清，以及3％的CMC溶液在37度的热水浴。
- 1小时的潜伏期后，覆盖感染U2OS细胞取出介质。 1:1卷3％CMC：2X的DMEM，20％胎牛血清混合在一起，这种混合使用2毫升涵盖每个受感染的细胞U2OS以及。
- 细胞放置在一个37度的5％二氧化碳培养箱48小时。
- 48小时后，每口井的CMC覆盖上添加2毫升的甲醇 - 冰醋酸固定液，在室温下孵育10分钟在细胞培养罩。
- 丢弃固定覆盖和清洗使用自来水井的其余。
- 2毫升每一个考马斯亮蓝溶液染色固定U2OS细胞，孵育30分钟，在室温在低速板振动筛。
- 删除从井的考马斯染色，并用自来水冲洗板。允许干用了大约一个小时的盖子关闭。
- 由此产生的病毒斑块可以很容易地在图2c的可视化。板可以无限期地储存在这个阶段。
- 在10和100之间的斑块是可见的稀释步骤计数斑块。
- 乘以使用稀释计算斑块的数量乘以2得到的数字，给在PFU / ml的滴度。例如，如果计算在百万倍稀释25斑块，初始未经稀释的样品的效价乘以25乘以2或50万PFU / ml的1万元。进一步的体重除以这个数字最初测量样本报告PFU / G滴度
6。代表性的成果：
为了准确地确定手术获得的正常/肿瘤组织样本是否是或不是病毒infectable，首先必须确保组织样本，至少是可行的。图1A显示了使用一个新陈代谢的染料（Alamar蓝色），超过了至少72小时内能保持正常和肿瘤组织代谢活跃，可行性进行评估。这表明，组织培养离体可以支持病毒复制。溶瘤病毒的一个显着优点是，它们可以被设计来表达治疗或成像转基因。图2D - E显示绿色荧光蛋白或荧光素酶可以从感染体外组织检测，进一步支持这些组织是可行的，也infectable。虽然转基因表达的增加一般与病毒复制有关，并不一定等同于生产病毒的生命周期，导致自我放大和传播，这被认为是治疗活动的重要。出于这个原因，它是必要的，以确定是否比是用于最初感染的组织产生更多的病毒。图2b显示斑块检测病毒量化后，更多的病毒感染后72小时获得，然后感染后，立即组织收集。总体而言，这些数据表明，手术切除的肿瘤组织可以继续生存在细胞培养至少72小时内，在这段时间内病毒的复制，可以支持。
图1。概述组织取样/切片协议。组织样本中删除了2毫米，随后分成四个季度，这是随机分布成井A1 - A4的分为核心处理。颜色代码显示在每口井所用试剂。灰色阴影的广场内的水井，每季度从6个人的核心描绘。孔A1的组织与媒体转移到一个新的井（C1）后初步alamar蓝色阅读。二读的是在72小时与病毒潜伏期结束。韦尔斯A4和B4是辅以荧光素后的72小时孵化后感染
图2。生存能力和病人的组织样本infectability 。 一）组织活力alamar蓝色信号，在2小时和72小时后收集测量。 Y轴表示的空白校正alamar蓝色信号，B）牛痘病毒滴度每克2和72小时后感染C）牛痘病毒斑例如U2OS细胞，考马斯染色，D）发光信号从病人维维荧光素酶受感染的组织取得的组织样本收集的影像使用 IVIS E）荧光显微镜图片VV - GFP感染的病人组织样本。
Discussion
在这个协议中的关键步骤之一是获得新鲜的组织样本。如果样品到细胞培养在一个不合适的介质（如PBS）的手术室在漫长的等待之后，这可能会危及组织的生存能力和防止infectability。值得注意的是，正常组织本质上更容易出现这些影响比肿瘤组织。另一个关键的一点是有多少个核用于样品的组织和它们的大小的一致性。大小不一致会导致跨患者样本的可变性因素，如组织缺氧和infectectable表面会因为波动的核心和核心宿舍的大小而异。虽然这可以部分解决利用组织切片，这里介绍的方法的一个优势是，它是相对比较容易，不易污染，广泛适用于多种组织类型，包括软或粘性组织，这是不容易适合组织切片。值得注意的是，核心的数量可以增加，以获得更好的组织的代表。此外，内核可以被切成多块（如5-8），以适应其他潜在的检测，如DNA，RNA或蛋白质的提取并行完成。然而，在该内核可裁剪重现大小的块的数量将取决于实际大小的核心，它可以通过使用不同大小的corers，修改。可选的一种方式，以帮助获得再现大小的组织块甚至核心之前，用一把尺子进一步细分成小块的长度。该协议自然可以被修改，以适应其他病毒，我们发现，组织可以是可行的，并支持长达6天的复制。该协议可以进一步扩展到其他维拉利表达外源基因，包括cytrokines测量。感染后，也可以组织石蜡包埋进一步切片染色及免疫组织化学方法，允许进一步细化组织的组织学，它如何与病毒感染10-12有关。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢Hesham Abdelbary博士为图2中的数据提供人类手术标本。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Amphothericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | Use at 0.1% |
| Pennicilin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Use at 1% |
| Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
| D-Luciferin potassium salt | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter |
| MEM powder | GIBCO, by Life Technologies | #41500018 | Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use |
| Carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C9481 | Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| 2 mm Biopsy punch | Miltex Inc. | MX-33-31 | |
| Double Edge Prep Blades | Personna Medical Care | 74-0002 | |
| Fluorescence disection Microscope | Leica Microsystems | model M205 FA | |
| In vivo imaging system (IVIS) | Caliper Life Sciences | IVIS® 200 series | |
| Tissue Tearor | Biospec Products | model 985370-395 |
References
- Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer. Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).
- Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck. Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).
- Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. Reovirus: Rationale and clinical trial update. Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).
- Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 85-89 (2010).
- Boeuf, F. L. e Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing. Mol Ther. 18, 888-895 (2010).
- Silva, N. D. e, Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).
- Diallo, J. S. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
- Cooke, S. L. Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer. Br J Cancer. , Forthcoming (2010).
- Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses. J Surg Res. , 1-6 (2010).
- Hochberg, M. Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers. Br J Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Kuip, H. vander Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).
