Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

Summary

וירוסים oncolytic הם מבטיחים סרטן ותרופות. היכולת לוודא את infectability של דגימות רקמה חיה המתקבל חולים לפני הטיפול הוא יתרון ייחודי של גישה זו הטיפולי. פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך רקמות עבור

Abstract

וירוסים oncolytic (OVs) הם הרפוי הרומן סלקטיבי לשכפל ולהרוג תאים סרטניים ^1. מספר ניסויים קליניים להערכת היעילות של מגוון רחב של פלטפורמות כולל oncolytic HSV, Reovirus ו OVs Vaccinia כטיפול לסרטן כרגע ^2-5 לדרך. אחד המאפיינים העיקריים של וירוסים oncolytic היא כי הם יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לבטא transgenes כתב המאפשר לחזות את הזיהום על ידי מיקרוסקופית של הרקמות או ביו הארה הדמיה ^6,7. זו מציעה יתרון ייחודי שכן אפשר להדביק רקמות מן vivo לשעבר חולים לפני הטיפול על מנת לוודא את הסבירות virotherapy oncolytic מוצלחת ^8. לשם כך, חיוני כראוי דגימת רקמות כדי לפצות על ההטרוגניות רקמות להעריך את הכדאיות רקמות, לפני במיוחד לזיהום ^9. חשוב גם לעקוב באמצעות שכפול נגיפי transgenes הכתב אם הביע ידי פלטפורמת oncolytic כמו גם על ידי טיטרציה ישירה של רקמות לאחר homogenization על מנת להבחין בין זיהום הנפל ופורה. מטרת פרוטוקול זה כדי לטפל בבעיות אלה ו לעיל מתאר 1. הדגימה והכנת רקמת הגידול של תרבית תאים 2. הערכת כדאיות רקמות באמצעות צבע מטבולית alamar כחול 3. זיהום Ex vivo של רקמות בתרבית בווירוס vaccinia להביע או GFP או גחלילית בלוציפראז 4. איתור הביטוי transgene על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או באמצעות in vivo Imaging System (IVIS) 5. כימות של הנגיף על ידי assay פלאק. שיטה זו כוללת מציג מספר יתרונות, כולל הקלות של עיבוד רקמות, פיצוי על ההטרוגניות רקמות, שליטה על הכדאיות רקמות, אפליה בין זיהום הנפל ועצם בתום שכפול נגיפי.

Protocol

1. עיבוד רקמות

1. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, פרוטוקול זה צריך להתבצע באמצעות טרי רקמה מבודדת שהופקדו DMEM מדיה המכילה 10% FBS, 1% Pennicilin / סטרפטומיצין פתרון, ו 0.1% Amphothericin פתרון B מיד לאחר הניתוח לפני עיבוד. אם הדבר אינו אפשרי, רקמות ניתן להשאיר לילה ב 4 מעלות במדיום זה לפני עיבוד.
2. לפני עיבוד המדגם, לעקר מלקחיים מתכת להבים חד פעמיות על ידי הפקדת אותם בפתרון אתנול 70% לפחות במשך 5 דקות. כמו כן להכין צלחת 24 היטב עם 2 מ"ל של DMEM מדיה המכילה 10% FBS, 1% Pennicilin / סטרפטומיצין פתרון, ו 0.1% ב Amphothericin
3. איסוף דגימת רקמה ברדס זרימה למינרית תרבית תאים באמצעות מלקחיים מעוקרות ואת ההפקדה רקמות צלחת ריקה 15 ס"מ פטרי, לשמור את המכסה על הצד, הצד סטרילי למעלה.
4. ב למכסה המנוע תרבית תאים, השתמש 2 מ"מ ביופסיה להשיג ליבות שונים ממגוון רחב של אזורים בתוך הרקמה כמו באיור 1. הפקדה ליבות במכסה של פטרי 15 ס"מ בעזרת מלקחיים, משאירים מספיק מקום בין כל ליבה כך ניתן לחתוך בקלות לאורך הציר האופקי.
5. פיצול כל הליבה לתוך 4 / 4 אפילו באמצעות סכין גילוח מעוקרים כמו באיור 1.
6. בעזרת קצה pipet, לשים כל רבע הליבה של הליבה נתונה גם שונה A1 ל-A4 כמו בתרשים 1, כבר המכיל 1.5 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS, 1% Pennicilin / סטרפטומיצין פתרון, ו 0.1% פתרון Amphothericin B . חזור על הפעולה עבור כל ליבה. זה אמור לאפשר מדגם מייצג של הגידול, תוך מזעור הטיה גם נתון / מצב. עבור ייצוג טוב יותר, להגדיל את מספר הליבות.

2. הערכת כדאיות רקמה

1. עיבוד רקמות לאחר, להוסיף 25μl Alamar כחול טוב A1 ו-A2 # # כפי שמוצג באיור 1 ו דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות חממה humidified עם 5% CO _2.
2. לאחר דגירה עם alamar כחול, להסיר 3 פעמים 100 μl מכל A1 ו-A2 טוב להעביר 6 בארות שונים של צלחת 96-היטב. קרא את האות באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (530 עירור, פליטה 590) ולשמור את הנתונים עבור הרשומות שלך.
3. אחרי אות Alamar כחול כבר לקרוא, להעביר את כל פיסות רקמות באמצעות טיפ pipet, מן A1 היטב C1 המכיל DMEM, 10% FBS + + PS AmphoB. היזהר שלא להעביר כמות מוגזמת של מדיה A1 היטב.
4. להדביק בארות A3 ו-A4 בהתאמה עם PFU ⁶ 10-GFP-לבטא ו-בלוציפראז להביע וירוס vaccinia מדולל μl 25 של התקשורת. ובכן A2 יכול להיות נגוע בווירוס הזה שמבטא כל transgene נתון כולל בכלל.
5. 72 שעות לאחר מכן, להוסיף 25 μl Alamar כחול בארות C1 ו-D1 וחזור על שלב 2.2

3. ויזואליזציה של ביטוי transgene GFP על ידי מיקרוסקופ בתפרחת

1. הסר את כל תרבית תאים התקשורת המכסים את פיסות הרקמה על מנת לצלם הקרינה טוב.
2. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכולת לנתיחה, תחילה לקחת תמונה בניגוד שלב ברזולוציה המתאימה
3. מעבר למצב פלואורסצנטי לצלם תמונה באמצעות מסנן מתאים לדמיין את transgene של עניין, במקרה זה ה-GFP.
4. שימוש במסנן הקרינה באורך גל אחר עבור ככל האפשר של transgene של עניין (כגון RFP) כדי לצלם תמונה של הקרינה רקע

4. ויזואליזציה של הביטוי בלוציפראז באמצעות in vivo מערכת הדמיה (IVIS)

1. ודא IVIS מאותחל לפני שתתחיל.
2. ב A4 בארות B4, להוסיף 5 μl של המצע luciferin 10 מ"ג / מ"ל, מערבבים היטב דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. קבע את זמן החשיפה IVIS ל 5 שניות לצלם בארות שלך. אם התמונה רווי, חוזר עם זמן חשיפה נמוכה יותר. אם יש אות לא, להגדיל את זמן החשיפה.
4. שימוש בתוכנת ההדמיה IVIS, ייתכן להסיר רקע באמצעות האות מ B4 היטב לבחור את האזור של עניין לכמת את האות הארה.

5. הערכת titers ויראלי ידי assay פלאק

1. לפני לכימות titers ויראלי, רקמות חייב להיות הראשון הומוגני לשחרר חלקיקים נגיפיים. ניתן לעשות זאת כמה חודשים לאחר מכן ב דגימות רקמה נגועים מאוחסנים -80
2. לשקול את הדגימה זה צריך להיות הומוגני באמצעות סולם אנליטית. במקרה זה, נשתמש מדגם שנאספו A2 היטב.
3. מקום הרקמה הוא 5 מ"ל בז פוליסטירן צינור עגול התחתונה ולהוסיף 1 מ"ל של PBS. Homogenize את הרקמה באמצעות homogenizer רקמות. במידת הצורך, החנות homogenate ב -80 להערכת titers ויראלי במועד מאוחר יותר.
4. כדי וירוס vaccinia titer, הצלחת הראשונה 1,000,000 תאים U2OS בצלחת 6-באר ו דגירה לילה 37 מעלות, 5% CO ₂ לחified כך שהם הגיעו כ 95% יום confluency הבאה חממה.
5. שימוש בתקשורת חופשית בסרום לעשות דילולים סדרתי של הנגיף, והקפד לשנות עצות בין כל שלב הדילול. בדרך כלל אנחנו עושים את 1 ב 10 דילולים ולהשתמש 100 μl להעביר לתוך μl 900. איך דילולים רבים עשויים תלוי התשואה הצפויה וירוס.
6. בעקבות ביצוע דילולים, להסיר את התקשורת מכסה את התאים U20S מצופה מכן להוסיף 500 μl של המניות בדילול וירוס (עבור כל דילול) כדי להדביק את התאים U2OS. דגירה התאים עבור 1 שעה דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ באינקובטור humidified.
7. במהלך תקופה זו, לחמם את 2 X DMEM מרוכז המכיל 20% FBS, והפתרון CMC 3% באמבט המים 37 מעלות.
8. לאחר דגירה 1 שעה, להסיר את כיסוי התקשורת תאים הנגועים U2OS. מערבבים 01:01 כרכים של CMC 3%: 2X DMEM, 20% FBS יחד ולהשתמש 2 מ"ל של תערובת זו כדי לכסות את כל טוב של תאים נגועים U2OS.
9. שים התאים בחזרה 37 5% מעלות CO ₂ באינקובטור humidified לעוד 48 שעות.
10. לאחר 48 שעות, להוסיף 2 מ"ל של מקבע-חומצה אצטית מתנול על גבי שכבת CMC בכל טוב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות במנדף תרבית תאים.
11. מחק את השכבה קבוע לשטוף את השארית של בארות שימוש במי ברז.
12. הכתם התאים U2OS קבוע עם 2ml של פתרון coomassie כחול לכל היטב דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במהירות נמוכה על צלחת שייקר.
13. הסר את הכתם coomassie מבארות ולשטוף את הצלחות שימוש במי ברז. ייבוש עם את המכסה למשך כשעה.
14. פלאק נגיפי כתוצאה ניתן דמיינו בקלות דמות 2C. פלטות ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל בשלב זה.
15. הרוזן הפלאק בשלב דילול שם בין 10 ל 100 הפלאק גלויים.
16. הכפל את מספר הפלאק נספר על ידי דילול בשימוש להכפיל את התוצאה על ידי מספר 2 לתת titer ב PFU / ml. לדוגמה, אם 25 הפלאק נספרים גם שם דילול מיליון פי שימש, כייל של המדגם חי הראשונית היא 25 כפול 1000000 כפול 2 או 50,000,000 PFU / ml. בהמשך לחלק את המספר הזה על ידי משקל בתחילה למדוד למדגם לדווח titers ב PFU / g

6. נציג תוצאות:

על מנת לקבוע במדויק אם מדגם שהושגו בניתוח הרקמות / הגידול הוא או היא לא infectable בווירוס, יש תחילה לוודא כי דגימת רקמות היא לפחות בת קיימא. איור 1A מראה כי הכדאיות ניתן להעריך באמצעות צבע מטבולית (Alamar כחול) כי הן רקמות נורמליות הגידול יכול להישאר פעיל מבחינה מטבולית על פני תקופה של לפחות 72h. הדבר מצביע על כך רקמות vivo לשעבר תרבותי יכול לתמוך שכפול נגיפי. יתרון משמעותי של וירוסים oncolytic היא שהם יכולים להיות מהונדסים להביע transgenes טיפולית או הדמיה. איור 2D-E מראה כי ה-GFP או בלוציפראז ניתן להבחין בין רקמות נגועים לשעבר vivo, תמיכה נוספת כי רקמות אלו קיימא infectable גם. למרות הביטוי transgene מוגברת קשורה בדרך כלל עם השכפול הנגיפי, זה לא בהכרח שווה ל מחזור חיים פרודוקטיביים ויראלי שמוביל הגברה עצמית להפיץ, אשר נחשב חשוב לפעילות טיפולית. מסיבה זו, יש צורך לקבוע אם וירוס יותר מופק ממה שימש בתחילה להדביק את הרקמה. איור 2B מראה כי על כימות ויראלי ידי assay פלאק, וירוס יותר מתקבל לאחר ההדבקה 72 שעות לאחר מכן רקמה נאספו מיד לאחר ההדבקה. בסך הכל, הנתונים הללו מראים כי רקמת הגידול נכרת בניתוח יכול להישאר קיימא בתרבות התא לתקופה של לפחות 72 שעות, שבמהלכן שכפול נגיפי זמן יכול להיות נתמך.

באיור 1. סקירה כללית של רקמת הדגימה / חתך פרוטוקול. מדגם רקמות מעובד על ידי הסרת מספר 2 ליבות מ"מ אשר מחולקים ובהמשך לארבעה אשר מופצים באופן אקראי לתוך בארות A1-A4. קודי צבע מצביעים על חומרים כימיים המשמשים גם כל אחד. אפור מוצל ריבועים בתוך בארות מייצגים כל רבע מן 6 ליבות בודדים מתואר. הרקמה היטב A1 מועבר היטב חדשה (C1) עם התקשורת לאחר הקריאה הראשונית כחול alamar. קריאה שנייה נעשה בסוף הדגירה השעה 72 עם וירוסים. וולס A4 ו-B4 הם השלימו עם Luciferin לאחר דגירה 72 שעות לאחר הפגיעה

איור 2. הכדאיות ו infectability של דגימות רקמה חולה. א) רקמות חיוניות, כפי שהיא נמדדת על ידי האות כחול alamar ב 2 שעות ו 72 שעות איסוף הדואר. ציר Y מייצג ריק המתוקן אות alamar כחול. B) titer של vaccinia וירוסאסף לגרם של דגימות רקמה 2 ו - 72 שעות לאחר ההדבקה. C) דוגמה של הפלאק vaccinia וירוס על תאים U2OS הבאים מכתים coomassie. D) הארה האות המתקבל רקמות VV-בלוציפראז נגועים המטופל באמצעות הדמיה IVIS. E) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מדגם רקמות החולה נגוע VV-GFP.

Discussion

אחד הצעדים קריטי פרוטוקול זה הוא השגת דגימה טרייה. אם המדגם הוא להכניס תרבית תאים לאחר המתנה ארוכה בחדר הפועלים התקשורת הולם (למשל PBS), זה עלול לפגוע ברקמות הכדאיות ולמנוע infectability. ראוי לציין, הרקמות הוא מטבעו נוטה יותר את ההשפעות הללו מאשר רקמות הגידול. עוד נקודה קריטית היא איך ליבות רבים משמשים מדגם רקמות העקביות של גודלם. חוסר עקביות בגודל תוביל השתנות פני דגימות החולה מאז גורמים כגון היפוקסיה רקמות משטח infectectable תשתנה בהתאם לגודל של ליבות רבעים הליבה. אמנם זה ניתן לפתור חלקית על ידי שימוש slicers רקמות, אחד היתרונות של השיטה המוצגת כאן היא כי הוא קל יחסית, נוטה פחות זיהום, החלים נרחב למגוון של סוגי רקמות, כולל רקמות רכות או צמיגה אשר אינן ניתנות בקלות לרקמות חיתוך. יש לציין, במספר ליבות יכול להיות מוגברת על מנת לקבל ייצוג רקמה טובה יותר. כמו כן, ליבות ניתן לחתוך לחתיכות יותר (למשל 5-8) כדי להתאים את מבחני פוטנציאליים אחרים צריך להיעשות במקביל כגון DNA, RNA, או מיצוי חלבון. עם זאת, מספר חתיכות שבו ליבות ניתן לחתוך בגדלים לשחזור יהיה תלוי בגודל בפועל של ליבות, אשר יכול להיות שונה באמצעות מקלפות בגדלים שונים. לחלופין, דרך אחת לעזור להשיג חתיכות רקמה בגודל reproducibly היא אפילו את אורך ליבות באמצעות שליט לפני יותר מישנה אותם לחתיכות קטנות יותר. הפרוטוקול יכול כמובן להיות שונה כדי להכיל וירוסים אחרים, מצאנו כי רקמות ניתן קיימא ותמיכה שכפול של עד 6 ימים. הפרוטוקול יכול עוד להתארך עד מדידות של virally-הביעו transgenes אחרים, כולל cytrokines. בעקבות הזיהום, רקמות יכולים גם להיות מוטבע פרפין להמשך חתך והכתים בשיטות immunohistochemical, אשר מאפשר עידון נוסף של היסטולוגיה הרקמה ואיך זה קשור זיהום ויראלי ^10-12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High glucose DMEM	Hyclone	SH30243.01
Fetal Bovine Serum	NorthBio Inc.	NBSF-701
Amphothericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942	Use at 0.1%
Pennicilin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Use at 1%
Alamar Blue	Invitrogen	DAL1025
D-Luciferin potassium salt	Molecular Imaging Products	D-Luciferin potassium salt 1g	Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter
MEM powder	GIBCO, by Life Technologies	#41500018	Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use
Carboxymethyl cellulose (CMC)	Sigma-Aldrich	C9481	Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B7920
2 mm Biopsy punch	Miltex Inc.	MX-33-31
Double Edge Prep Blades	Personna Medical Care	74-0002
Fluorescence disection Microscope	Leica Microsystems	model M205 FA
In vivo imaging system (IVIS)	Caliper Life Sciences	IVIS® 200 series
Tissue Tearor	Biospec Products	model 985370-395