GABA-geactiveerde Single-kanaal en Tonic Stromingen in hersenen van de rat Slices

Summary

We maken gebruik van de patch-clamp techniek om GABA-geactiveerde single-channel stromingen (GABAA-kanalen, GABAA-receptoren) en de synaptische en tonische stromen ze genereren in neuronen te meten. Activering van de kanalen af ​​neuronale prikkelbaarheid bij gezondheid en ziekte

Abstract

De GABA _A-kanalen zijn aanwezig in alle neuronen en bevinden zich zowel op synapsen en buiten de synapsen, waar zij genereren fasische en tonische stromingen, respectievelijk ^4,5,6,7 De GABA _Een kanaal is een pentamere GABA-gated chloride kanaal. Het kanaal subeenheden zijn gegroepeerd in 8 families (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π en ρ). Twee alfa's, beta's en een twee 3 ^e subeenheid vormen de functionele kanaal ^8. Door het combineren van studies van sub-type-specifieke GABA-geactiveerde single-channel moleculen met studies, inclusief alle populaties van de GABA _A-kanalen in het neuron wordt het mogelijk om inzicht in de fundamentele mechanisme van neuronale inhibitie en hoe het wordt gemoduleerd door farmacologische middelen.

We gebruiken de patch-clamp techniek ^9,10 aan de functionele eigenschappen van de GABA _A-kanalen studie in levend neuronen in de hippocampus hersenen plakken en opnemen van de single-channel en whole-cell stromen. We verder onderzoeken hoe de kanalen worden beïnvloed door verschillende GABA concentraties, andere drugs en het intra-en extracellulaire factoren. Voor gedetailleerde theoretische en praktische beschrijving van de patch-clamp-methode vindt u in de Single-Channel Recordings bewerkt door B en E Sakman Neher ^10.

Protocol

1. De voorbereiding van de hersenen plakjes:

Experimenten worden gedaan op de hippocampus hersenen segmenten van postnatale 16 tot 22 dagen oud Wistar ratten.

1. Dieren worden opgeofferd door onthoofding in overeenstemming met de lokale ethische richtlijnen en goedgekeurd verzorging van dieren protocollen.
2. Snel te verwijderen van de hersenen met een spatel en snijd hem over de middellijn met een chirurgisch mes (# 24). Plaats elke halfrond op een Whatman filter papier met de cut naar het papier.
3. Doe een druppel secondelijm op het monster disk en plaats de halfrond op de top van het met het snijvlak naar beneden. Plaats het monster schijf in de maaikamer van de vibratome die gevuld is met een ijskoude artificiële hersenvocht (ACSF, dan kunt u hier beneden zie 3.1).
4. Stel de slice dikte tot 400 uM en start het snijden van de hersenen. U moet afsnijden van ongeveer 2 mm van het hersenweefsel voordat je bij de hippocampus.
5. De hippocampus plakjes worden in een glazen petri plaat gevuld met ACSF. De plaat wordt geplaatst op een zwarte achtergrond (bijv. zwart papier) gemakkelijk visualisatie van de hippocampus mogelijk te maken. Isoleer de hippocampus van het omringende weefsel met behulp van scherpe chirurgische mesjes. Wees niet te duwen of trekken het weefsel.
6. Slices worden vervolgens geïncubeerd in de ACSF oplossing bij 37,0 ° C voor 1 uur en vervolgens opgeslagen bij kamertemperatuur totdat experimenten worden uitgevoerd. Tijdens de een uur incubatie het weefsel herstelt van de schade die door het snijproces.

2. De voorbereiding van pipetten voor het patchen van:

1. Pipetten zijn gemaakt van borosilicaatglas haarvaten.
2. De patch-pipetten zijn getrokken op een geautomatiseerde of handmatige pipet trekkers resulteert in pipetten weerstand van 2 - 4 MΩ voor de hele cel-opnamen of 8 tot 20 MΩ voor single-channel-opnamen gevuld met de juiste pipet oplossing en het bad oplossing wordt de ACSF (zie hieronder, 3.1).
3. De pipetten die we gebruiken voor single-channel opnamen worden gepolijst met een microforge, waar de warmte van een gesmolten glas zitten op het platina draad maakt het oppervlak gladder. Dezelfde borosilicaatglas is als in de patch-pipetten wordt gebruikt om het glas druppel op de draad te vormen. Polijsten de pipetten op deze manier in onze ervaring zorgt voor pipetten die het meer stabiele en hogere weerstand afdichtingen vorm in vergelijking met pipetten gepolijst door de warmte van een ongecoat draad of door een polishing stap in de geautomatiseerde trekker. Uiteindelijke omvang van de pipetten varieert 8 tot 20 MΩ. Pipetten gebruikt in de whole-cell opnames zijn niet gepolijst.

3. Oplossingen die in de experimenten:

Specifieke oplossingen worden gebruikt voor de single-channel en whole-cell opnames.

1. ACSF bevat in mm: 124 NaCl, 26 NaHCO _{3, 3} KCl, 1,3 MgSO _4, 2,5 Na ₂ HPO _4, 2,5 _CaCl2, 10 glucose met pH 7,2 tot 7,4 bij borrelen met 95% O ₂ en 5% CO _2. De ACSF is soms ook aangevuld met andere voedingsstoffen zoals bijvoorbeeld lactaat ^11.
2. Single-channel opnamen: Het bad oplossing is ofwel ACSF of in mm: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl _2, 1,8 CaCl ₂ en 10 TES (N-tris [hydroxymethyl] methyl-2-aminoethanesulfonic zure) pH 7,25 en andere geneesmiddelen die nodig kunnen zijn voor de specifieke experimenten De pipet oplossing voor cel-vastgemaakt en inside-out patches in mM:. Choline 140 Cl, 5 NaCl, een KCl, een MgCl _2, 1,8 _CaCl2, 10 TES pH 7.25, 200 uM saclofen (GABAB antagonist) en 0 - 1 uM GABA. Voor buiten-out plekken in mm: 140 NaCl of Choline Cl, 0,3 KCl, 2 MgCl _2, 0,5 _CaCl2, 5 EGTA, 10 TES pH 7,2 tot 7,4.
3. Whole-cell voltage-clamp opnames: Het bad oplossing:. Schijfjes zijn doorbloed (2 - 3 ml / min) met ACSF nu bevat ook kynurenic zuur (3 mm) en andere middelen die nodig kunnen zijn voor de specifieke experimenten De pipet oplossing bevat in mm: 140 CsCl, een CaCl _2, 3 EGTA, 0,5 KCl, 1 MgCl _{2, 2} ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 5 QX-314 bromide, 10 TES pH-waarde van 7,25 met CsOH.

4. Het vormen van een Giga Ohm (GΩ) afdichting voor patch-clamp experimenten:

De hippocampus hersenen plakken (fig. 1A) worden gehouden op de bodem van de opname kamer door nylon draden op een U-vormige platina draad. Om het weefsel organisatie, bijvoorbeeld de CA1 en 3 en de dentate gyrus regio in de hippocampus plakken of de specifieke cellen te visualiseren, moet je een microscoop. De meeste laboratoria gebruiken een rechtopstaande microscoop met de doelstellingen, variërend van 10x naar 60x waardoor een naar regio's of specifieke cellen in het weefsel te identificeren. Echter, voor het patchen van plakken, zelfs een dissectie microscoop kan worden gebruikt en dan heb je visueel een regio te identificeren patch, maar niet een specifieke cel. Dit type van patching is aangeduid als "blind patching". Ikn beide gevallen een in het einde is het patchen van een enkele cel in een bepaald gebied. Het slagingspercentage is vergelijkbaar voor de twee methoden. Hoewel de cellichamen van de belangrijkste cellen in de hippocampus zijn georganiseerd in zeer gestructureerd lamina (bijv. CA3/CA1 stratum pyramidale en geïdentificeerd als helder bands in de hippocampus hersenen slice) verspreid onder alle deelgebieden en lagen van de hippocampus zijn de cellichamen van de remmende interneuronen die deel uitmaken van ongeveer 10% van de totale bevolking van neuronale ^12. Af en toe een interneuron of glia die kunnen worden gepatcht in de korrel cel of piramidale neuronale lamina kunnen worden onderscheiden van de opdrachtgever cellen door de verschillende elektrische eigenschappen van deze cellen (zie De Hippocampus Book ^13).

1. GΩ seal formatie. Tijdens deze procedure de glazen pipet wordt een of andere manier vast aan de celmembraan en in de verschillende patch configuraties (zie hieronder, 4 en 5) kunnen we de activiteit van GABA-geactiveerde kanalen die in het celmembraan te meten.
   Plaats de pipet in de pipet houder en draai de dop, dat de pipet vastgemaakt. Instellingen op het Axoclamp versterker 200B zijn: V-klem, Gain 2, Filter 2 kHz, de holding potentieel is 0 mV en we doen het experiment via de computer met behulp van de PClamp software.
2. Blaas in de mond stuk dat is bevestigd aan de buis die verbinding maakt met de pipet houder en sluit de klep tussen het mondstuk en de buis. Hierdoor ontstaat een positieve druk in je pipet. De positieve druk in de pipet heeft twee functies: ten eerste, zal een stroom komen van de pipet en een keer de pipet komt het bad oplossing het zal helpen het houden van de pipetpunt schoon te maken. Ten tweede, het aanbrengen van een zachte zuigkracht naar de celmembraan door middel van de patch-pipet is een essentieel onderdeel van de vorming van een hoge kwaliteit, hoge weerstand afdichting. De afdichting kan vaak eenvoudig worden gevormd door het openen van de klep die de pipet pressostaten. Vanwege dit, zorg ervoor dat er geen lucht lekken. U kunt eenvoudig op lekkage testen door het nemen van de houder met de pipet, dip het in een bekerglas gevuld met water en blaas in de mond stuk. Als u eventuele luchtbellen ontsnappen dan dat deel is niet strak genoeg.
3. Lager uw pipet in het bad oplossing. Op het computerscherm, waar meet je de pipet weerstand zie je een vierkant puls gegenereerd door een 5 mV puls trein en een nummer dat vertelt u de weerstand van je pipet. Kleiner aantal is groter pipetpunt openingen, grotere pipetten. Stel de pipet offset op 0.
4. Afdichting van de celmembraan. Identificeer de regio of de cel die u gaat patch, dat wil zeggen, vormen een zegel op. In de hersenen slice kan men identificeren van de dentate gyrus korrel of de CA1 en CA3 piramidale cellichaam regio's van de hippocampus als heldere banden (zie Fig. 1A) met behulp van de 10X vergroting van de microscoop of we kunnen bepalen de afzonderlijke oppervlak piramidale neuronen met behulp van de 60X vergroting.
   1. Breng uw pipet in focus, zodat je ziet zowel uw regio / cel en de pipet als je kijkt door de microscoop eye-stukken.
   2. Plaats de pipet boven het midden van de regio / cel met behulp van de grove-beweging manipulator instellingen en laat de pipet tot hij net boven, maar niet aanraken van het weefsel.
   3. Heel voorzichtig lager uw pipet op het midden van uw regio / cel met behulp van de fijne-beweging instellingen op uw manipulator en tegelijkertijd kijken naar de computer scherm en bijhouden van uw pipet weerstand. Houd het verplaatsen van uw pipet naar beneden tot je de weerstand van de pipet steeds groter (hoger getal).
   4. Nu, voorzichtig los van de positieve druk in de pipet door het openen van de klep. Dit komt neer op een zachte zuigkracht en vaak een giga-seal (hoge weerstand afdichting, GΩ) vormt automatically.If niet, dan afzuigen op het mondstuk waar u eerder toegepast positieve druk en het Giga-Seal zal vormen.
   5. U heeft nu de verkregen zogenaamde Cell-Attached patch-clamp configuratie (zie Fig. 1B). Pas de snelle en langzame capaciteit vergoeding aan de transiënten uit de pipet en de pipet houder te annuleren. Op het computerscherm ziet u nu een flat huidige trace. Hoe hoger de waarde GΩ zegel is de betere signaal-ruisverhouding, zal je in de single-channel opnamen.

Het kan soms voordelig zijn om patch binnen de hippocampus slice. In sommige gevallen kan de cellen kunnen worden gezonder wanneer ze niet op het oppervlak zoals ze zijn beter beschermd. Ook in het geval een is het bestuderen van de effecten van de extracellulaire omgeving op cellulaire functies, zoals het effect van extracellulaire GABA concentraties op tonic huidige generatie in neuronen, patching in het weefsel kan een voordeel zijn. Het patchen procedure is hetzelfde als hierboven beschreven behalve van die ene niet los van de pogevoelige druk in de pipet tot de pipetpunt is binnen de slice.

5. Tot vaststelling van het whole-cell configuratie en het opnemen van whole-cell stromen:

1. In de cel-configuratie aangesloten, wijzigt u de pipet potentieel tot -60 mV of dicht bij de rust membraanpotentiaal van de cel.
2. Afzuigen van de pipet via de buis die is verbonden met de pipet houder en tegelijkertijd kijken naar de computer scherm om de verandering in de weerstand en de capaciteit passanten die verschijnen als je eenmaal hebt gebroken in de cel noot. Wanneer dit gebeurt je in de zogenaamde whole-cell configuratie of whole-cell-modus (Fig. 1B).
   De celmembraan weerstand varieert van een cel-type naar het andere en is afhankelijk van de geleiding van de kanalen in het membraan en hoeveel zijn open. De celmembraan capaciteit varieert met de grootte van de cel. Zuig dient in eerste instantie voorzichtig zijn, maar als het moeilijk is in te breken in de cel meer kracht kan worden toegepast. Pulsen van zuigkracht kan ook worden gebruikt.
3. Soms is een vergoeding voor weerstand die ontstaat tussen de pipet en de cel is vereist. Dit is de zogenaamde serie of toegang weerstand (Rs of Ra) compensatie en kan worden gedaan via de software of handmatig met behulp van een draaiknop op de versterker. In onze experimenten hebben we niet compenseren Ra, maar experimenten worden geweigerd als het een afwijking van meer dan 25% van de oorspronkelijke toegang tot weerstand.
4. GABA-geactiveerde tonic stromen opgenomen in de whole-cell-modus.

In het whole-cell configuratie in de hippocampus CA1 piramidale neuronen we de holding mogelijkheden bij - 60 mV en wacht 5 - 10 minuten waardoor de pipet oplossing in evenwicht met de cel interieur. Gedurende deze tijd de opname wordt stabiel. Tijdens het experiment we houden van de waarde van de serieweerstand.

Experimenten worden uitgevoerd in het voltage-clamp en u de huidige maat door middel van een populatie van kanalen in het whole-cell membraan. Men kan onderscheid maken tussen GABA-geactiveerde synaptische en extrasynaptic stromen door de fasische en tonische de aard van de stroming. De antagonist SR95531 remt alle GABA _A stromingen. De daling in de holding huidige geeft het niveau van de GABA-geactiveerde tonic stroom in het neuron.

Omdat we geïnteresseerd zijn in de tonic GABA-geactiveerde stroom die afhankelijk is van de extracellulaire, ambient GABA is in de slice we normaal gesproken niet patch de cellen aan de oppervlakte, maar veeleer de cellen binnen de slice. Agonisten en antagonisten die we gebruiken voor het moduleren van de GABA _A-kanalen worden toegepast in het bad oplossing en doen de cellen te bereiken binnen het segment. De snelheid van de oplossing stroming in de experimentele kamer is 2 - 3 ml / min.

6. Opnemen van een kanaal stromen:

Experimenten worden uitgevoerd in de cel-ingeschreven, de inside-out of de outside-out patch-clamp-configuratie (hieronder zie hier) en we registreren stromen door middel van single-channel moleculen, de single-channel stromen. Instellingen op Axoclamp 200B, V-klem, krijgen 500, filter 2 of 5 kHz. Met de PClamp software die wij de controle van de pipet potentieel, stelt u de frequentie van bemonstering op niet minder dan 100 microseconden en noteer de stromingen. Om de ruis in single-channel-opnamen te minimaliseren van het volume van het bad oplossing is laag gehouden, zodat het net dekt de slice.

1. GABA-geactiveerde kanalen in de Cell-Attached configuratie. Wanneer u een GΩ zegel verkregen op het membraan die u in de cel-ingeschreven modus en u kunt opnemen van de kanalen die in het membraan patch omsloten door de pipet (zie Fig. 1B). Omdat GABA gaat niet door de celmembraan, wordt GABA gezet in de pipet oplossing voor de kanalen in de patch te activeren. Extrasynaptic GABA-geactiveerde kanalen activeren met een latency van maximaal enkele minuten. De patch potentieel is = - pipet potentieel dat wil zeggen wanneer in PClamp u de mogelijkheid ingesteld op - 40 mV, wordt het opgenomen door het membraan als gedepolariseerd 40 mV.
   Het voordeel van opname in de cel-verbonden modus is dat het kanaal is in zijn eigen omgeving en is in verband met de normale intracellulaire eiwitten en factoren. Het nadeel is dat je niet weet precies wat potentiële u opneemt als je niet weet van de absolute rust membraanpotentiaal en het potentieel in de patch wordt bepaald zowel door de pipet potentieel en de rust membraanpotentiaal van de cel.
2. GABA-geactiveerde kanalen in de Inside-Out configuratie. Toen in de cel-ingeschreven mode Til je pipet en verplaats het naar de kant en uit de buurt van de plak met behulp van de fijne bewegingen van de micromanipulators. U hebt nu een inside-out patch en kan opnemen in de Inside-Out-modus.
   U opneemt vanaf de patch van de membraan dat wordt omsloten door de pipet (zie Fig. 1B). Net als in de cel-aangesloten modushebben GABA in de pipet oplossing om de kanalen te activeren. Maar kan medicijnen die de lipide bilaag kruis, zoals benzodiazepinen, barbituraten, propofol, enz. worden toegepast in het bad oplossing als ze kunnen oversteken in de pipet en het moduleren van de kanalen [14]. De patch potentiële = - pipet potentieel en omdat er geen rust membraanpotentiaal overlay zoals in de cel-aangesloten mode, de patch potentieel is gelijk aan de-pipet potentieel bijvoorbeeld als u de holding potentieel in PClamp tot -40 mV dan de patch potentieel is precies 40 mV.
   Het voordeel van de inside-out configuratie is dat men drugs of enzymen van toepassing op de interne membraan oppervlak en te onderzoeken of het van invloed op kanaal eigenschappen. De kracht van het maken van de inside-out patch niet van toepassing op het membraan omgeving van het kanaal waardoor de vorming van deze geript-off patch configuratie potentieel zacht voor het kanaal complexer dan bij de outside-out patch is gevormd (zie hieronder) .
3. GABA-geactiveerde kanalen in de Outside-Out configuratie. Toen in de whole-cell mode voorzichtig optillen of zuig de pipet met behulp van de fijne bewegingen van je micromanipulator. Op hetzelfde moment te kijken in het venster op uw computer die de patch eigenschappen wordt weergegeven. Het tekenen van de pipet uit de buurt van de cel ziet u de capaciteit transiënten verdwijnen en je zult weer een GΩ afdichting. Je hebt nu vormden een outside-out patch en kan opnemen in de Outside-Out-modus.
   Een of andere manier het celmembraan heeft gesloten over de tip opening van de pipet, de binnenkant van het membraan wordt geconfronteerd met de pipet interieur en de originele buitenkant van het membraan wordt geconfronteerd met de opname kamer (Fig. 1B). GABA en andere drugs moeten worden onderzocht zijn nu opgelost in het bad oplossing. De patch potentiële = pipet potentieel net als in de whole-cell-modus bijvoorbeeld als u de holding potentieel in PClamp naar 40 mV dan de patch potentieel is precies 40 mV.
   De voordelen van de outside-out mode is dat je precies weet wat je membraanpotentiaal is en als het membraan origineel buiten kijkt uit op het experimentele kamer, drugs te gebruiken kan worden opgelost in het bad oplossing en makkelijk kan worden toegepast op en gewassen uit de kanalen. De nadelen zijn dat u niet langer kan zijn aan het kanaal intracellulaire en zelfs transmembraan eiwitten en factoren die nodig kunnen zijn voor de volledige kanaal functie als het membraan moesten seal-over en een aantal moleculen kunnen verloren zijn gegaan of de lokale omgeving membraan vervormd het proces. Maar, samen de andere patch configuraties kunt dissectie van het kanaal eigenschappen op moleculair niveau dat niet mogelijk is met een andere methode vandaag.

7. Het analyseren van de resultaten:

De single-channel en whole-cell stromen worden geanalyseerd met de PClamp software. Voor analyses van synaptische evenementen die we gebruiken Synaptosoft (GA, USA) of AXOGraph (Sydney, Australië).

8. Representatieve resultaten:

Fig. 2A toont een kanaal stromen geactiveerd door 20 nM GABA-concentratie in een cel-ingeschreven patch in dentate gyrus korrel neuron. De latency van de activering van de maximale geleiding van het kanaal was 2 minuten en 38 seconden en de maximale geleiding was 44 pS ^15. De patch werd gedepolariseerd door 40 mV. Fig. 2B toont voorbeelden van whole-cell voltage-clamp stroom records van rat hippocampale neuronen identifiying tonic en driefase stromingen. De GABAA antagonist SR95531 remt zowel de extrasynaptic-(tonic) en de synaptische gegenereerde (fasische) GABA-geactiveerde stromen. We pasten de GABAA antagonist SR95531 (100 uM) tot (Ba) dentate gyrus neuron en (Bb) insuline behandeld CA1 pyramidale neuron het openbaren van de tonica stroom door de verschuiving in de huidige baseline veroorzaakt door SR95531 het blokkeren van de extrasynaptic kanalen (Ba, b) en het verdwijnen van synaptische stromen wanneer SR95531 blokkeert de synaptische kanalen (Bb). Onder basale voorwaarde CA1 pyramidale neuronen hebben geen tonic GABA-geactiveerde stroom ^6, maar als de neuronen worden blootgesteld aan fysiologische concentraties van insuline ⁴ GABA-geactiveerde tonic stromen te ontwikkelen.

Figuur 1A. Rat hippocampus hersenen slice, bepaalde regio's zijn CA1 en CA3 piramidale cellagen en de dentate gyrus (DG) granulaat cellaag. B. Schematische patch-clamp configuraties.

Figuur 2A. Single-kanaal stromen geactiveerd door 20 nM GABA in een cel-ingeschreven vlek op dentate gyrus korrel cel in een rat hippocampus hersenen slice. Holding potentieel werd gedepolariseerd 40 mV (pipet potentiële = -40 mV). De ster (*, 1 ^st huidige trace) geeft van waar de stroming die op de een snellere time-schaal (2nd huidige trace) is genomen vanaf. B. whole-cell stromingen die in de rat hippocampus hersenen slice in a. dentate gyrus granule cel en b. CA1 piramide neuron in voltage-clamp mode op het bedrijf potentieel van -60 mV. Voor de CA1 experimenten werden plakjes geïncubeerd in een nM insuline gedurende 2 uur bij kamertemperatuur voordat stromingen werden geregistreerd.

Discussion

De whole-cell staat voor de huidige ensemble van de stromen gegenereerd door actieve kanalen in de cel. De specifieke farmacologie en chloride permeabiliteit van de GABAA kanalen maakt het mogelijk om stromen in verband met deze kanalen te identificeren. De voorbijgaande aard van de activering van synaptische kanalen en de tonic activering van de extrasynaptic kanalen maakt een eenvoudige differentiatie tussen deze twee populaties van de GABAA-kanalen, uitgedrukt in een neuron. Kan echter alleen met een single-channel-opnames een onderzoek naar de kinetische eigenschappen van het kanaal moleculen die de tonica stromen te genereren. In tegenstelling tot synaptische kanalen die geactiveerd binnen 100 microseconde, zijn de tonica GABAA kanalen geactiveerd met een vertraging in het bereik van minuut vanaf het moment dat GABA wordt toegepast ^{4,7,15,16,17,18.} Deze vertraagde activering van de kanalen resulteert in een kanaal dat veel eigenschappen kunnen niet worden bestudeerd met behulp van whole-cell opnames. Op de single-channel niveau van de verschillende sub-populaties van GABAA kanalen kunnen worden geïdentificeerd op basis van verschillende functionele en farmacologische eigenschappen. Dus, door het nemen van een voordeel van wat de verschillende patch-clamp configuraties te bieden hebben, is het mogelijk om in detail te bestuderen de moleculaire functie en farmacologie van de GABA-geactiveerde kanalen die de tonic en synaptische stromen in neuronen te genereren.

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).