GABA-courants activés monocanal et Tonic en tranches de cerveau de rat

Summary

Nous utilisons la technique de patch-clamp pour mesurer le GABA-activé un seul canal courants (GABAA canaux, récepteurs GABA) et les courants synaptiques et tonique qu'ils génèrent dans les neurones. L'activation des canaux diminue l'excitabilité neuronale dans la santé et la maladie

Abstract

Les canaux GABA _A sont présentes dans tous les neurones et sont situés à la fois au niveau des synapses et à l'extérieur des synapses, où ils génèrent des courants phasique et tonique, respectivement ^4,5,6,7 Le GABA _Un canal est un canal chlorure pentamérique GABA-dépendants. Les sous-unités de canaux sont regroupés en 8 familles (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π et ρ). Deux alphas, deux betas et une sous-unité 3 ^ème former le canal fonctionnel ^8. En combinant des études de sous-type spécifique de GABA-activé à canal unique de molécules avec des études, y compris toutes les populations de canaux GABA _A dans le neurone, il devient possible de comprendre le mécanisme de base de l'inhibition neuronale et comment elle est modulée par des agents pharmacologiques.

Nous utilisons la technique de patch-clamp ^9,10 pour étudier les propriétés fonctionnelles des canaux GABA _A dans les neurones vivants dans des tranches de cerveau de l'hippocampe et enregistrer le canal unique et la cellule entière courants. Nous avons en outre examiner comment les canaux sont affectés par différentes concentrations de GABA, d'autres drogues et les facteurs intra et extracellulaire. Pour une description théorique et pratique détaillée de la méthode patch-clamp s'il vous plaît voir Le monocanal Recordings édité par B et E Sakman Neher ^10.

Protocol

1. Préparation des tranches de cerveau:

Les expériences sont effectuées sur des tranches de cerveau hippocampique du postnatale 16 - 22 jours rats Wistar.

1. Les animaux sont sacrifiés par décapitation, conformément aux règles locales d'éthique et approuvé les protocoles de soins pour animaux.
2. Enlever rapidement le cerveau avec une spatule et coupez le long de la ligne médiane avec une lame chirurgicale (# 24). Placez chaque hémisphère sur un papier filtre Whatman avec la coupe face au papier.
3. Mettre une goutte de superglue sur le disque spécimen et le lieu de l'hémisphère au-dessus de lui avec la surface de coupe vers le bas. Placez le disque spécimen dans la chambre de coupe de l'vibratome qui est rempli avec une glaciale liquide céphalorachidien artificiel (ACSF, s'il vous plaît voir ci-dessous 3.1).
4. Réglez l'épaisseur de la tranche à 400 pM et commencer à couper le cerveau. Vous aurez besoin de couper environ 2 mm de tissu cérébral avant d'atteindre l'hippocampe.
5. Les coupes d'hippocampe sont mis dans une plaque de verre de Pétri remplie de l'ACSF. La plaque est placée sur un fond noir (par exemple, du papier noir) pour permettre la visualisation facile des hippocampes. Isoler l'hippocampe du tissu environnant en utilisant forte lames chirurgicales. Attention à ne pas pousser ou tirer le tissu.
6. Les tranches sont ensuite incubés dans la solution ACSF à 37,0 ° C pendant 1h, puis stockés à température ambiante jusqu'à des expériences sont faites. Au cours de l'incubation d'une heure le tissu récupère des dommages imposés par le processus de découpe.

2. Préparation de pipettes pour patcher:

1. Les pipettes sont fabriqués à partir de capillaires en verre de borosilicate.
2. Les patch-pipettes sont tirés sur une extracteurs pipette automatique ou manuel entraînant une résistance des pipettes de 2 - 4 MQ pour les enregistrements de cellules entières ou 8 - 20 MW pour le seul canal des enregistrements lorsqu'il est rempli avec la solution appropriée et une pipette la solution du bain étant l'ACSF (voir ci-dessous, 3.1).
3. Les pipettes que nous utilisons pour un seul canal enregistrements sont polis en utilisant un microforge où la chaleur à partir d'un verre fondu assis sur le fil de platine rend la surface plus lisse. Le verre de borosilicate est la même que dans le patch-pipettes est utilisé pour former la goutte de verre sur le fil. Polissage des pipettes de cette façon dans notre expérience crée des pipettes qui forment la résistance des joints plus stables et plus élevés par rapport aux pipettes polies par la chaleur à partir d'un fil nu ou par une étape de polissage dans l'extracteur automatisé. La taille finale des pipettes varie de 8 à 20 MW. Pipettes utilisé dans la cellule entière enregistrements ne sont pas polis.

3. Les solutions utilisées dans les expériences:

Des solutions spécifiques sont utilisés pour le canal unique et la cellule entière enregistrements.

1. ACSF contient en mM: NaCl 124, 26 NaHCO _3, 3 KCl, 1,3 MgSO _4, 2,5 Na ₂ HPO _4, 2,5 _CaCl2, 10 de glucose à pH 7,2 - 7,4 quand barbotage avec 95% d'O ₂ et 5% de CO _2. L'ACSF est parfois également complété avec d'autres nutriments tels que par exemple ¹¹ lactate.
2. Monocanal enregistrements: La solution est soit de bain ACSF ou en mm: 140 NaCl, KCl 5, 1 _MgCl2, 1,8 _CaCl2 et 10 TES (N-tris [hydroxyméthyl] méthyl-2-aminoéthanesulfonique acide) pH 7,25 et d'autres drogues qui peuvent être nécessaires pour les expériences spécifiques La solution de pipette pour patchs de cellules-joint et à l'envers en mM: 140. choline, Cl 5 NaCl, KCl 1, 1 _MgCl2, 1,8 _CaCl2, 10 TES pH 7,25, 200 uM saclofen (antagoniste GABAB) et 0 - 1 uM de GABA. Pour l'extérieur, des correctifs en mM: 140 NaCl ou choline Cl, 0,3 KCl, MgCl 2 _2, 0,5 CaCl _2, 5 EGTA, 10 pH TES 07/02 au 07/04.
3. Whole-cell voltage-clamp enregistrements: La solution du bain:. Tranches sont perfusés (2 - 3 ml / min) avec désormais ACSF contenant de l'acide a également kynurénique (3 mM) et d'autres médicaments qui peuvent être nécessaires pour les expériences spécifiques La solution contient une pipette en mM: 140 CsCl, 1 CaCl _2, 3 EGTA, 0,5 KCl, MgCl ₂ 1, 2 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 5 QX-314 bromure, 10 pH de 7,25 avec les TES CsOH.

4. Formant un Giga Ohm (GQ) joint pour des expériences de patch-clamp:

Les tranches de cerveau hippocampique (figure 1A) sont détenus dans le bas de la chambre d'enregistrement par des fils de nylon sur un fil de platine en forme de U. Afin de visualiser l'organisation des tissus par exemple, le CA1 et 3 et la région dans le gyrus denté coupes d'hippocampe ou les cellules spécifiques, vous avez besoin d'un microscope. La plupart des laboratoires utilisent un microscope droit avec des objectifs allant de 10X à 60X permettant ainsi d'identifier des régions ou des cellules spécifiques dans le tissu. Cependant, pour des tranches de patcher même un microscope à dissection peut être utilisé et ensuite vous identifier visuellement une région à patcher, mais pas une cellule spécifique. Ce type de brassage est appelé «patcher aveugle". J'ain les deux cas, celui de la fin est patcher une seule cellule dans une zone spécifique. Le taux de réussite est similaire pour les deux méthodes. Bien que les corps cellulaires des cellules principales dans l'hippocampe sont organisés en lamelles très structurées (par exemple CA3/CA1 stratum pyramidale et identifiés comme des bandes lumineuses dans la tranche de cerveau hippocampique) dispersés parmi toutes les sous-champs et les strates de l'hippocampe sont les corps cellulaires des inhibiteurs interneurones qui représentent environ 10% de la population totale des neurones ^12. L'interneurone occasionnels ou des cellules gliales qui peuvent être patchés dans les cellules granulaires ou pyramidale lamina neuronales peuvent être différenciées à partir des cellules principal par les différentes propriétés électriques de ces cellules (voir Le Livre Hippocampus ^13).

1. La formation de joint GQ. Durant cette procédure, la pipette en verre devient en quelque sorte étroitement attachée à la membrane cellulaire et dans les configurations de patch différents (voir ci-dessous s'il vous plaît, 4 et 5), nous pouvons mesurer l'activité du GABA-canaux qui sont activés dans la membrane cellulaire.
   Mettez la pipette dans le porte-pipette et serrer le bouchon qui se fixe la pipette. Réglages sur l'ampli 200B Axoclamp sont: V-clamp, gain 2, Filtre 2 kHz, le potentiel de maintien est de 0 mV et nous faisons l'expérience via l'ordinateur en utilisant le logiciel pClamp.
2. Soufflez dans l'embout buccal qui est fixé sur le tube qui relie le porte-pipette et fermer le robinet entre la pièce de la bouche et le tube. Cela crée une pression positive dans votre pipette. La pression positive dans la pipette a deux fonctions: d'abord, un flux va sortir de la pipette et une fois la pipette entre la solution du bain il aidera gardant la pointe de la pipette propre. Deuxièmement, en appliquant une légère aspiration à la membrane cellulaire à travers le patch-pipette est une partie essentielle de former une grande qualité, à haute résistance de phoque. Le sceau ne peuvent souvent être simplement formé par l'ouverture de la vanne qui contrôle la pression pipette. Pour cette raison, assurez-vous qu'il n'ya pas de fuites d'air. Vous pouvez facilement vérifier l'étanchéité en prenant le support avec la pipette, le tremper dans un bécher rempli d'eau et souffler dans l'embout buccal. Si vous constatez des bulles s'échappent alors cette partie n'est pas assez serré.
3. Réduisez votre pipette dans la solution du bain. Sur l'écran d'ordinateur où vous mesurer la résistance pipette, vous verrez une impulsion carrée généré par un train d'impulsions 5 mV et un numéro qui vous raconte la résistance de votre pipette. Plus petit nombre représente plus grandes ouvertures pointe de la pipette, plus pipettes. Régler la pipette offset à 0.
4. Etanchéité à la membrane cellulaire. Identifier la région ou la cellule que vous allez patch, qui est, sous forme d'un phoque sur. Au sein de la tranche de cerveau, on peut identifier le gyrus denté de granules ou de la CA1 et CA3 pyramidale régions du corps cellulaire de l'hippocampe comme des bandes lumineuses (voir Fig. 1A) en utilisant le grossissement 10X sur le microscope ou nous pouvons identifier les neurones pyramidaux surface individuelle en utilisant les grossissement de 60X.
   1. Apportez votre pipette en lumière afin que vous voyez à la fois votre région / cellule et la pipette lorsque vous regardez à travers le microscope oculaires.
   2. Placez la pipette au-dessus du milieu de la cellule région / manipulateurs en utilisant les paramètres du mouvement grossier et inférieur de la pipette jusqu'à ce qu'il soit juste au-dessus mais sans toucher les tissus.
   3. Très doucement abaisser votre pipette sur le milieu de votre région / cellule en utilisant les paramètres finement le mouvement sur votre manipulateur et en même temps regarder l'écran d'ordinateur et de garder trace de votre résistance pipette. Bougez votre pipette jusqu'à ce que vous voyez la résistance de la pipette devient plus grand (plus grand nombre).
   4. Maintenant, relâchez doucement la pression positive dans la pipette en ouvrant le robinet. Cela équivaut à une aspiration douce et souvent une forme giga-joint (étanchéité à haute résistance, GQ) automatically.If pas, puis appliquer le vide à l'embouchure, où vous avez déjà appliqué une pression positive et la Giga-Seal se forme.
   5. Vous avez maintenant obtenu la soi-disant cellule attachée de patch-clamp de configuration (voir Fig. 1B). Ajuster la compensation de capacité rapides et lents pour annuler les transitoires provenant de la pipette et le porte-pipette. Sur l'écran d'ordinateur que vous allez maintenant voir une trace plats actuels. Plus la valeur est joint GQ, meilleur est le signal-bruit, vous aurez dans le canal unique d'enregistrements.

Il peut parfois être avantageux de patch dans la tranche d'hippocampe. Dans certains cas, les cellules peuvent être sain quand il n'est pas à la surface car elles sont plus protégés. En outre, en cas que l'on étudie les effets de l'environnement extracellulaire sur les fonctions cellulaires, comme effet de concentrations extracellulaires de GABA sur la génération actuelle tonique dans les neurones, le rapiéçage au sein du tissu peut être un avantage. La procédure de correction est la même que celle décrite ci-dessus mis à part que l'on ne libère pas le POsible la pression dans la pipette jusqu'à la pointe de la pipette est dans la tranche.

5. Établir la configuration cellule entière et d'enregistrer la cellule entière courants:

1. Dans la configuration cellule attachée, le changement du potentiel de pipette à -60 mV ou proche du potentiel membranaire de repos de votre cellule.
2. Appliquer aspiration à la pipette par le tube qui est relié au porte-pipette et en même temps regarder l'écran d'ordinateur de noter le changement de la résistance et la capacité des transitoires qui apparaissent une fois que vous avez rompu dans la cellule. Lorsque cela arrive, vous êtes dans le mode que l'on appelle configuration cellule entière ou de la cellule entière (Fig. 1B).
   La résistance de la membrane cellulaire varie d'un type cellulaire à l'autre et dépend de la conductance des canaux dans la membrane et combien sont ouverts. La capacité membrane cellulaire varie avec la taille de la cellule. D'aspiration doit être initialement doucement mais s'il est difficile de percer dans la force de plus de cellules peuvent être appliqués. Impulsions d'aspiration peut également être utilisé.
3. Parfois, une compensation pour la résistance qui se développe entre la pipette et la cellule est nécessaire. C'est ce qu'on appelle la série ou la résistance d'accès (R ou Ra) de compensation et peut se faire soit via le logiciel ou manuellement en utilisant un bouton de commande sur l'amplificateur. Dans nos expériences, nous ne compensent pas pour Ra, mais les expériences sont rejetées si elle varie de plus de 25% de la résistance d'accès initiale.
4. Courants toniques GABA activé enregistrée en mode cellule entière.

Dans la configuration cellule entière dans l'hippocampe neurones pyramidaux CA1 nous avons mis le potentiel de maintien à - 60 mV et attendre 5 - 10 minutes en laissant la solution pipette pour s'équilibrer avec l'intérieur de la cellule. Pendant ce temps l'enregistrement devient stable. Pendant l'expérience nous gardons la trace de la valeur de la résistance série.

Les expériences sont effectuées en voltage-clamp et vous mesurer le courant à travers une population de canaux dans la membrane de cellules entières. On peut différencier les courants activés GABA-synaptique et extrasynaptiques par la nature phasique et tonique des courants. L'antagoniste inhibe SR95531 tous les courants GABA _A. La diminution du courant de maintien indique le niveau de la tonique de GABA-activé en cours dans le neurone.

Comme nous sommes intéressés à la tonique de GABA-activé en cours qui est dépendante de la matrice extracellulaire, ambiante GABA dans la tranche que nous faisons normalement pas de patch les cellules sur la surface, mais plutôt, les cellules au sein de la tranche. Agonistes et antagonistes que nous utilisons pour moduler les canaux GABA _A sont appliquées dans la solution du bain et ne atteindre les cellules au sein de la tranche. Le taux de l'écoulement de la solution dans la chambre expérimentale est de 2 - 3 ml / min.

6. Enregistrement mono-canal courants:

Les expériences sont réalisées dans la cellule-joint, le dedans-dehors ou à l'extérieur hors-patch-clamp de configuration (s'il vous plaît voir ci-dessous) et les courants nous enregistrons grâce à un seul canal molécules, le seul canal de courants. Paramètres sur Axoclamp 200B, V-clamp, le gain de 500, filtre à 2 ou 5 kHz. Avec le logiciel pClamp nous contrôlons le potentiel pipette, a fixé le taux d'échantillonnage des données à pas moins de 100 us et enregistrer les courants. Afin de minimiser le bruit dans un seul canal enregistrements du volume de la solution du bain est maintenue basse afin qu'il recouvre juste la tranche.

1. GABA-canaux activés dans la configuration cellule attachée. Lorsque vous avez obtenu un sceau GQ sur la membrane que vous êtes en mode cellule attachée et vous pouvez enregistrer des canaux qui sont dans le patch de membrane fermée par la pipette (voir Fig. 1B). Comme le GABA ne traverse pas la membrane cellulaire, le GABA est mis dans la solution de pipette pour activer les canaux dans le patch. Extrasynaptiques GABA-canaux activés activer avec une latence pouvant aller jusqu'à quelques minutes. Le potentiel patch est = - c'est à dire le potentiel de la pipette lorsque vous définissez pClamp le potentiel à - 40 mV, il est enregistré par la membrane dépolarisée 40 mV.
   L'avantage de l'enregistrement en mode cellule attachée, c'est que le canal est en son milieu d'origine et est en relation avec les protéines intracellulaires et les facteurs normaux. L'inconvénient est que vous ne savez pas exactement quel est le potentiel que vous enregistrez vous ne connaissez pas le potentiel de membrane au repos absolu et le potentiel à travers le patch est déterminée tant par le potentiel de pipette et le potentiel membranaire de repos de la cellule.
2. GABA-canaux activés dans la configuration inside-out. Lorsque dans le mode de cellule attachée soulevez doucement votre pipette et le déplacer vers le côté et loin de la tranche en utilisant les mouvements fins de l'micromanipulateurs. Vous avez maintenant un patch à l'envers et peut enregistrer en mode Inside-Out.
   Vous enregistrer à partir du patch de membrane qui est fermé par votre pipette (voir Fig. 1B). Comme dans le mode cellule attachée, vousont GABA dans la solution pipette pour activer les canaux. Mais, les médicaments qui traversent la bicouche lipidique comme les benzodiazépines, les barbituriques, le propofol etc peuvent être appliquées dans la solution du bain, car ils seront capables de traverser dans la pipette et modulent les canaux [14]. Le potentiel de patch = - potentiel de pipette et puisqu'il n'ya pas de potentiel de repos membranaire superposées comme dans le mode cellule attachée, le potentiel correctif est égal à la pipette-exemple potentiel si vous réglez le potentiel de maintien de -40 mV à pClamp alors le patch potentiel est exactement 40 mV.
   L'avantage de la configuration inside-out, c'est que l'on peut appliquer des médicaments ou des enzymes à la surface de la membrane interne et d'examiner si elle affecte les propriétés du canal. La force de faire le patch dedans-dehors ne s'applique pas à l'environnement membranaire du canal faisant la formation de cette configuration de patch-off déchiré potentiellement plus doux pour le complexe canal que lorsque le patch outside-out est formé (s'il vous plaît voir ci-dessous) .
3. GABA-canaux activés dans la configuration hors-Out. Lorsque dans le mode de la cellule entière soulevez doucement ou reculer la pipette en utilisant les mouvements fins de votre micromanipulateur. Dans le même temps regarder la fenêtre sur votre ordinateur qui affiche les propriétés de patch. Lorsque vous dessinez la pipette hors de la cellule, vous verrez les transitoires de capacité disparaîtra et vous aurez de nouveau un sceau GQ. Vous avez maintenant créé un patch en dehors de départ et peut enregistrer en mode hors-Out.
   D'une certaine manière la membrane cellulaire a scellé sur l'ouverture extrémité de la pipette, l'intérieur de la membrane face à l'intérieur de la pipette et en dehors d'origine de la membrane des visages de la chambre d'enregistrement (Fig. 1B). Médicaments GABA et d'autres à examiner sont désormais dissous dans la solution du bain. Le potentiel de patch = potentiel pipette exactement comme dans l'exemple le mode cellule entière si vous réglez le potentiel de maintien de pClamp à 40 mV, le potentiel patch est exactement 40 mV.
   Les avantages du mode hors-out, c'est que vous savez exactement ce que votre potentiel de membrane est et que l'extérieur de membrane originale face à la chambre expérimentale, les médicaments doivent être utilisés peut être dissous dans la solution du bain et facilement appliqué et lavé les canaux. Les désavantages sont que vous n'avez plus peut-être attaché à la chaîne intracellulaire des protéines transmembranaires et même et les facteurs qui peuvent être nécessaires pour la fonction de canal plein que la membrane a pour sceller-over et certaines molécules peuvent avoir été perdues ou l'environnement membranaire locale déformée dans le processus. Mais, ensemble, les configurations de patch différentes permettent la dissection des propriétés du canal au niveau moléculaire qui n'est pas possible avec toute autre méthode aujourd'hui.

7. Analyser les résultats:

Les courants mono-canal et de la cellule entière sont analysés avec le logiciel pClamp. Pour les analyses des événements synaptiques nous utilisons Synaptosoft (GA, USA) ou AXOGraph (Sydney, Australie).

8. Les résultats représentatifs:

Fig. 2A montre un seul canal de courants activés par une concentration de 20 nM de GABA dans un patch cellule attachée au neurone gyrus denté de granules. La latence de l'activation de la conductance maximale du canal était de 2 minutes et 38 secondes et la conductance maximale était de 44 PS ^15. Le patch a été dépolarisée de 40 mV. Fig. 2B montre des exemples de la cellule entière voltage-clamp dossiers actuels de rat neurones hippocampiques identifiying tonique et phasique courants. L'antagoniste GABAA SR95531 inhibe à la fois l'extrasynaptiques-(tonique) et la synaptiques-générés (phasique) GABA-courants activés. Nous avons appliqué l'antagoniste GABAA SR95531 (100 uM) à (Ba) et le gyrus denté de neurones (Bb) traités par insuline CA1 neurone pyramidal révélant la tonique actuelle par le décalage dans le courant de base induit par SR95531 bloquant les canaux extrasynaptiques (Ba, b) et la disparition des courants synaptiques lors SR95531 bloque les canaux synaptiques (Bb). Sous la condition basale neurones pyramidaux CA1 n'ont pas toniques GABA-courants activés ⁶ mais quand les neurones sont exposés à des concentrations physiologiques d'insuline ⁴ courants toniques GABA activé développer.

Figure 1A. Tranche de cerveau d'hippocampe de rat, les régions identifiées sont CA1 et CA3 couches de cellules pyramidales et le gyrus denté (DG) couche de cellules granulaires. B. Schéma de patch-clamp configurations.

Figure 2A. Monocanal courants activés par 20 nM de GABA dans un patch cellule attachée sur la cellule du gyrus denté de granules dans une tranche de cerveau d'hippocampe de rat. Potentiel de maintien était dépolarisée 40 mV (potentiel de pipette = -40 mV). L'étoile (*, 1 ^er trace actuelle) identifie d'où les courants figurant sur ​​le plus rapide temps-échelle (2ND trace actuelle) a été pris. B. cellules entières courants enregistrés en tranches de cerveau d'hippocampe de rat dans les cellules granulaires du gyrus a. et b. denté CA1 pyramidale neurone dans voltage-clamp mode à le potentiel de maintien de -60 mV. Pour la CA1 expériences, les tranches ont été incubés dans une insuline nM pendant 2 h à température ambiante avant de les courants ont été enregistrés.

Discussion

Le courant cellule entière représente l'ensemble des courants générés par les canaux actifs dans la cellule. La pharmacologie spécifique et la perméabilité du chlorure de canaux GABAA permet d'identifier les courants associés à ces canaux. La nature transitoire de l'activation des canaux synaptiques et l'activation tonique des canaux permet une différenciation facile extrasynaptiques entre ces deux populations de canaux GABAA exprimé dans un neurone. Cependant, seulement avec un seul canal enregistrements peut-on étudier les propriétés cinétiques des molécules canaux qui génèrent les courants tonique. Contrairement aux canaux synaptiques qui activent dans les 100 ms, les canaux sont activés GABAA toniques avec une latence de l'ordre de quelques minutes de l'heure GABA est appliquée ^{4,7,15,16,17,18.} Cette activation retardée des résultats des canaux dans les propriétés du canal que beaucoup ne peuvent pas être étudiés en utilisant la cellule entière enregistrements. Au niveau mono-canal les différentes sous-populations de canaux GABAA peuvent être identifiés sur la base variant propriétés fonctionnelles et pharmacologiques. Ainsi, en prenant un avantage de ce que les différentes configurations de patch-clamp ont à offrir, il est possible d'étudier en détail la fonction moléculaire et la pharmacologie des canaux GABA-activé qui génèrent des courants tonique et synaptique dans les neurones.

Materials

Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).