Summary
हम पैच दबाना तकनीक GABA सक्रिय एकल चैनल (GABAA चैनलों, GABAA रिसेप्टर्स) धाराओं और synaptic और टॉनिक धाराओं वे न्यूरॉन्स में उत्पन्न उपाय का उपयोग करें. चैनलों के सक्रियकरण स्वास्थ्य और रोग में neuronal excitability घट जाती है
Abstract
GABA एक चैनल सभी न्यूरॉन्स में मौजूद हैं और दोनों synapses और synapses के बाहर स्थित हैं जहां वे phasic और टॉनिक धाराओं उत्पन्न, क्रमशः 4,5,6,7 GABA एक चैनल pentameric GABA-gated क्लोराइड चैनल है. चैनल सब यूनिटों 8 परिवारों (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π और ρ) में बांटा जाता है. दो alphas, दो betas और एक 3 Rd सबयूनिट कार्यात्मक 8 चैनल के रूप में. उप प्रकार विशिष्ट GABA सक्रिय GABA की सभी आबादी के न्यूरॉन में एक चैनल सहित अध्ययन के साथ एकल चैनल अणुओं के अध्ययन के संयोजन से यह संभव हो neuronal निषेध के बुनियादी तंत्र और कैसे यह औषधीय एजेंटों के द्वारा modulated है समझ.
हम पैच - दबाना तकनीक 9,10 करने के लिए hippocampal मस्तिष्क स्लाइसें में जिंदा न्यूरॉन्स में GABA एक चैनल के कार्यात्मक गुणों का अध्ययन और एकल चैनल और पूरे सेल धाराओं रिकॉर्ड का उपयोग करें. हम आगे की जांच कैसे चैनल अलग GABA सांद्रता, अन्य दवाओं और अंतर और बाह्य कारकों से प्रभावित होते हैं. पैच दबाना विधि का विस्तृत वर्णन के लिए सैद्धांतिक और व्यावहारिक एकल चैनल - बी Sakman और ई Neher 10 के द्वारा संपादित रिकॉर्डिंग देखने के लिए कृपया.
Protocol
1. मस्तिष्क स्लाइसें की तैयारी:
22 दिन पुरानी Wistar चूहों - प्रयोगों 16 प्रसवोत्तर से hippocampal मस्तिष्क स्लाइसें पर किया जाता है.
- पशु स्थानीय नैतिक दिशा निर्देशों और अनुमोदित जानवरों की देखभाल प्रोटोकॉल के साथ अनुसार शिरच्छेद द्वारा बलिदान कर रहे हैं.
- जल्दी रंग के साथ मस्तिष्क को हटाने और यह एक सर्जिकल ब्लेड (# 24) के साथ midline के साथ काटा. प्रत्येक गोलार्द्ध कटौती का सामना करना पड़ कागज के साथ एक वाटमान फिल्टर पेपर पर रखें.
- नमूना डिस्क पर superglue की एक बूंद रखो और यह की चोटी पर कटी हुई सतह के नीचे का सामना करना पड़ के साथ गोलार्द्ध जगह. Vibratome है कि एक ठंडा कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ भरा है के काटने के चैम्बर में नमूना डिस्क प्लेस ACSF (कृपया यहाँ नीचे 3.1 देख).
- 400 सुक्ष्ममापी टुकड़ा मोटाई सेट और मस्तिष्क काटने शुरू करते हैं. आप के लिए रवाना मस्तिष्क के ऊतकों के लगभग 2 मिमी में कटौती इससे पहले कि आप हिप्पोकैम्पस तक पहुँचने की आवश्यकता होगी.
- hippocampal स्लाइस एक गिलास पेट्री ACSF के साथ भरी थाली में डाल रहे हैं. प्लेट (जैसे काले कागज) एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर रखा है hippocampi के आसान दृश्य की अनुमति. ऊतक तेज सर्जिकल ब्लेड का उपयोग कर के आसपास से हिप्पोकैम्पस पृथक. धक्का नहीं है या ऊतक खींच सावधान रहें.
- स्लाइसें तो 37.0 पर ACSF समाधान प्रयोगों जब तक ° सी 1 के लिए और फिर कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जाता है में incubated हैं. एक घंटे के ऊष्मायन के दौरान ऊतक काटने प्रक्रिया द्वारा लगाए गए नुकसान से ठीक हो जाए.
2. पट्टी के लिए pipettes की तैयारी:
- Pipettes borosilicate ग्लास capillaries से बना रहे हैं.
- पैच pipettes एक स्वचालित या मैनुअल विंदुक pipettes में जिसके परिणामस्वरूप खींचने पर खींच रहे हैं 2 के प्रतिरोध - MΩ पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए 4 या 8 - एकल चैनल रिकॉर्डिंग के लिए MΩ 20 जब उपयुक्त विंदुक समाधान और स्नान समाधान किया जा रहा ACSF के साथ भरा (नीचे देखें, 3.1).
- pipettes हम एकल चैनल रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग एक microforge है जहां एक पिघला कांच प्लैटिनम तार पर बैठे से गर्मी सतह चिकनी बनाता का उपयोग पॉलिश कर रहे हैं. एक ही borosilicate ग्लास के रूप में पैच - pipettes में तार पर कांच छोटी बूंद के रूप में प्रयोग किया जाता है. हमारे अनुभव में यह तरीका चमकाने pipettes pipettes है कि अधिक स्थिर है और उच्च प्रतिरोध जवानों फार्म के रूप में एक uncoated तार से गर्मी से या स्वचालित खींचने में चमकाने कदम से पॉलिश pipettes की तुलना में बनाता है. Pipettes के अंतिम आकार 8 से 20 MΩ तक पर्वतमाला. पूरे सेल रिकॉर्डिंग में इस्तेमाल किया pipettes पॉलिश नहीं कर रहे हैं.
3. प्रयोगों में इस्तेमाल समाधान:
विशिष्ट समाधान एकल चैनल और पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है.
- ACSF मिमी में शामिल हैं: NaCl 124, 26 NaHCO 3, 3 KCl, 1.3 MgSO 4, 2.5 ना दो HPO 4, 2.5 CaCl 2, 7.2 पीएच के साथ 10 ग्लूकोज - 7.4 जब 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ bubbled. ACSF कभी कभी भी है, जैसे जैसे लैक्टेट 11 अन्य पोषक तत्वों के साथ पूरक है.
- एकल चैनल रिकॉर्डिंग: स्नान समाधान या तो ACSF या मिमी में: NaCl 140, 5 KCl 1 2 MgCl, 1.8 2 CaCl और 10 TES (एन tris [hydroxymethyl] एसिड मिथाइल-2-aminoethanesulfonic) 7.25 pH और अन्य दवाओं मिमी में सेल संलग्न और अंदर बाहर पैच के लिए कि विशिष्ट प्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है विंदुक समाधान: 140 Choline सीएल, 5 NaCl, KCl 1, 1 2 MgCl, 1.8 CaCl 2, 10 TES 7.25 पीएच, 200 सुक्ष्ममापी saclofen (GABAB प्रतिपक्षी) और 0 - 1 सुक्ष्ममापी GABA. बाहर बाहर मिमी में पैच: 140 NaCl या Choline सीएल, 0.3 KCl, 2 2 MgCl, 0.5 CaCl 2, 5 EGTA, 10 TES पीएच 7,2 - 7,4.
- स्नान समाधान: पूरे सेल वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग (2 - 3 मिलीग्राम / मिनट) स्लाइस perfused ACSF अब भी kynurenic (3 मिमी) एसिड और अन्य दवाओं है कि विशिष्ट प्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है युक्त के साथ विंदुक समाधान होता है. मिमी: 140 CSCL, 1 2 CaCl, 3 EGTA, KCl 0.5, 1 MgCl 2, 2 एटीपी मिलीग्राम, 0.3 GTP - ना, 5 QX-314 ब्रोमाइड, CsOH के साथ 7.25 की 10 TES पीएच.
4. पैच दबाना प्रयोगों के लिए एक Giga ओम मुहर (GΩ) बनाने:
U-आकार की एक प्लैटिनम तार पर नायलॉन के धागे से hippocampal मस्तिष्क स्लाइसें (छवि 1A) रिकार्डिंग कक्ष के नीचे आयोजित की जाती हैं. आदेश में CA1 और 3 के उदाहरण के ऊतक संगठन और hippocampal स्लाइस या विशिष्ट कक्षों में दांतेदार गाइरस क्षेत्र कल्पना करने के लिए, आप एक खुर्दबीन की जरूरत है. अधिकांश प्रयोगशालाओं 10X से 60x इस प्रकार एक या क्षेत्रों के ऊतकों में विशिष्ट कक्षों की पहचान करने के लिए अनुमति को लेकर उद्देश्यों के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. हालांकि, पट्टी स्लाइस के लिए भी एक विच्छेदन खुर्दबीन और इस्तेमाल किया जा सकता है तो आप नेत्रहीन पैच के लिए एक क्षेत्र विशेष सेल की पहचान नहीं है, लेकिन. पट्टी के इस प्रकार "अंधा पट्टी" करार दिया है. मैंn दोनों ही मामलों के अंत में एक पट्टी के एक विशिष्ट क्षेत्र में एक एकल कोशिका है. दो तरीकों के लिए सफलता की दर समान है. हालांकि हिप्पोकैम्पस में प्रमुख कोशिकाओं के सेल शरीर उच्च संरचित (जैसे CA3/CA1 परत pyramidale और hippocampal मस्तिष्क टुकड़ा में उज्ज्वल बैंड के रूप में पहचान) लामिना हिप्पोकैम्पस के सभी उपक्षेत्रों और तबके के बीच बिखरे हुए में आयोजित कर रहे हैं सेल निकायों की निरोधात्मक interneurons है कि कुल neuronal 12 जनसंख्या का लगभग 10% . सामयिक interneuron या glia कि ग्रेन्युल कक्ष या पिरामिड neuronal लामिना में समझौता हो सकता है इन कोशिकाओं के विभिन्न बिजली के गुणों (देख हिप्पोकैंपस बुक 13) द्वारा प्रमुख कोशिकाओं से विभेदित किया जा सकता है.
- GΩ सील गठन. इस प्रक्रिया के दौरान कांच विंदुक किसी भी तरह कसकर सेलुलर झिल्ली से जुड़ी है और अलग पैच विन्यास में (नीचे देखें, कृपया 4 और 5) हम GABA सक्रिय चैनलों कि कोशिका झिल्ली में हैं की गतिविधि उपाय कर सकते हो जाता है.
विंदुक धारक में पिपेट रखो और टोपी है कि विंदुक fastens को कस लें. Axoclamp प्रवर्धक 200B पर सेटिंग्स हैं: V-दबाना, 2 लाभ, फ़िल्टर 2 kHz, पकड़े संभावित 0 एम वी है और हम PClamp कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के माध्यम से प्रयोग कर रहे हैं. - मुँह टुकड़ा है कि ट्यूब कि विंदुक धारक को जोड़ता है और मुंह टुकड़ा और ट्यूब के बीच वाल्व बंद करने के लिए जुड़ा हुआ है में उड़ा. यह अपने पिपेट में सकारात्मक दबाव बनाता है. विंदुक में सकारात्मक दबाव के दो कार्य है, पहले, एक धारा विंदुक के बाहर आते हैं और एक बार विंदुक स्नान समाधान विंदुक टिप को साफ रखने में मदद मिलेगी में प्रवेश करती है. दूसरा, कोशिका झिल्ली पैच विंदुक के माध्यम से एक कोमल चूषण लागू करने के एक उच्च गुणवत्ता, उच्च प्रतिरोध मुहर बनाने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है. सील अक्सर बस कि विंदुक दबाव नियंत्रण वाल्व खोलने के द्वारा गठित किया जा सकता है है. इस वजह से, यकीन है कि वहाँ कोई हवा लीक कर रहे हैं. आप आसानी से लीक के लिए विंदुक के साथ धारक लेने के द्वारा परीक्षण कर सकते हैं, यह एक मुँह टुकड़ा में पानी और झटका से भरा बीकर में डुबकी. यदि आप देखते हैं किसी भी बुलबुले बच तो उस भाग तंग पर्याप्त नहीं है.
- नहाने के समाधान में अपने विंदुक लोअर. कंप्यूटर स्क्रीन पर जहाँ आप विंदुक प्रतिरोध उपाय आप एक वर्ग एक 5 mV पल्स ट्रेन और एक संख्या है कि आप अपने विंदुक के प्रतिरोध बताता द्वारा उत्पन्न पल्स देखेंगे. छोटे संख्या बड़ा विंदुक टिप उद्घाटन, बड़ा pipettes का प्रतिनिधित्व करता है. 0 करने के लिए ऑफसेट विंदुक समायोजित करें.
- कोशिका झिल्ली के लिए सील. क्षेत्र या कोशिका आप पैच के लिए जा रहे हैं, कि, पर एक मुहर फार्म को पहचानें. मस्तिष्क टुकड़ा के भीतर एक दांतेदार गाइरस ग्रेन्युल या CA1 और CA3 उज्ज्वल बैंड के रूप में हिप्पोकैम्पस के पिरामिड सेल शरीर क्षेत्रों (चित्र 1A देखें) खुर्दबीन पर 10X आवर्धन का उपयोग करने की पहचान कर सकते हैं या हम व्यक्तिगत सतह पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान का उपयोग कर सकते हैं 60x बढ़ाई.
- ध्यान में अपने विंदुक लाओ इतनी है कि आप दोनों अपने क्षेत्र / सेल और विंदुक देखते हैं जब आप खुर्दबीन - आंख टुकड़ों के माध्यम से देखो.
- / क्षेत्र मोटे आंदोलन जोड़तोड़ सेटिंग्स और कम पिपेट का उपयोग कर कक्ष के बीच ऊपर विंदुक रखें जब तक यह बस ऊपर है, लेकिन छू ऊतक नहीं है.
- बहुत धीरे अपने क्षेत्र / सेल के बीच पर अपने विंदुक कम अपने जोड़तोड़ पर ठीक आंदोलन सेटिंग्स का उपयोग और एक ही समय में कंप्यूटर स्क्रीन देखने और अपने विंदुक प्रतिरोध का ट्रैक रखने. अपने विंदुक चलती नीचे जब तक आप विंदुक के प्रतिरोध बड़ा बनने के (उच्च संख्या) रखें.
- अब, धीरे वाल्व खोलने से पिपेट में सकारात्मक दबाव जारी है. यह मात्रा एक कोमल चूषण और अक्सर एक giga मुहर (उच्च प्रतिरोध सील, GΩ) automatically.If नहीं रूपों, तो मुँह टुकड़ा है जहाँ आप पहले से सकारात्मक दबाव और Giga सील फार्म जाएगा लागू करने के लिए चूषण लागू.
- अब आप तथाकथित सेल संलग्न विन्यास पैच दबाना (चित्र देख 1B.) प्राप्त किया है. पिपेट और विंदुक धारक से आ रही यात्रियों को रद्द करने के लिए तेजी से और धीमी गति समाई मुआवजा समायोजित. कंप्यूटर स्क्रीन पर अब तुम एक फ्लैट वर्तमान ट्रेस देखेंगे. उच्च GΩ मुहर मूल्य, बेहतर संकेत से शोर अनुपात है आप एकल चैनल रिकॉर्डिंग में होगा.
यह कभी कभी hippocampal टुकड़ा के भीतर पैच के लिए फायदेमंद हो सकता है. कुछ उदाहरणों में कोशिकाओं को स्वस्थ किया जा सकता है जब के रूप में सतह पर नहीं वे और अधिक संरक्षित कर रहे हैं. इसके अलावा, एक मामले में सेलुलर कार्यों पर बाह्य वातावरण के प्रभाव का अध्ययन कर रहा है कोशिकी GABA सांद्रता के ऊतक के भीतर, न्यूरॉन्स पट्टी में टॉनिक वर्तमान पीढ़ी पर प्रभाव के रूप में, एक लाभ हो सकता है है. पट्टी प्रक्रिया उसी के रूप में ऊपर है कि एक अलग से वर्णित है पुलिस रिलीज नहीं करता हैविंदुक में sitive दबाव विंदुक टिप जब तक टुकड़ा के भीतर है.
5. पूरे सेल विन्यास और रिकॉर्डिंग पूरे सेल धाराओं की स्थापना:
- सेल संलग्न विन्यास में, -60 एम वी विंदुक क्षमता को बदलने के लिए या अपने सेल के आराम झिल्ली संभावित करीब है.
- विंदुक के लिए ट्यूब कि विंदुक धारक के लिए जुड़ा हुआ है और एक ही समय में कंप्यूटर स्क्रीन देखने के लिए प्रतिरोध और समाई यात्रियों दिखाई देते हैं कि एक बार आप सेल में टूट गया है में परिवर्तन नोट के माध्यम से चूषण लागू करें. जब यह होता है कि आप तथाकथित पूरे सेल विन्यास या पूरे सेल (छवि 1B) मोड में हैं.
कोशिका झिल्ली प्रतिरोध एक सेल प्रकार से दूसरे करने के लिए बदलता है और झिल्ली में चैनलों और कितने खुले हैं के प्रवाहकत्त्व पर निर्भर करता है. कोशिका झिल्ली समाई सेल के आकार के साथ बदलता रहता है. सक्शन शुरू धीरे होना चाहिए, लेकिन अगर यह सेल अधिक बल में तोड़ने के लिए मुश्किल है लागू किया जा सकता है. चूषण की दलहन भी इस्तेमाल किया जा सकता है. - कभी कभी प्रतिरोध के लिए मुआवजा है कि विंदुक और सेल के बीच विकसित की आवश्यकता है. इस श्रृंखला या एक्सेस (रुपये या रा) प्रतिरोध मुआवजा कहा जाता है और या तो सॉफ्टवेयर या मैन्युअल प्रवर्धक पर नियंत्रण घुंडी का उपयोग कर के माध्यम से किया जा सकता है. हमारे प्रयोगों में हम रा के लिए क्षतिपूर्ति नहीं लेकिन प्रयोगों खारिज कर रहे हैं अगर यह प्रारंभिक उपयोग प्रतिरोध से अधिक से अधिक 25% से भिन्न होता है.
- GABA सक्रिय टॉनिक पूरे सेल मोड में दर्ज धाराओं.
Hippocampal CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में पूरे सेल विन्यास में हम पकड़ में संभावित सेट - 60 एम वी और 5 के लिए प्रतीक्षा - 10 मिनट विंदुक समाधान सेल के इंटीरियर के साथ संतुलित करने की अनुमति. इस समय के दौरान रिकॉर्डिंग स्थिर हो जाता है. प्रयोग के दौरान हम श्रृंखला प्रतिरोध के मूल्य का ट्रैक रखने के.
प्रयोगों वोल्टेज दबाना में किया जाता है और आप चैनलों की आबादी के माध्यम से पूरे सेल झिल्ली में मौजूदा उपाय. एक GABA धाराओं के phasic और टॉनिक प्रकृति द्वारा सक्रिय synaptic और extrasynaptic धाराओं के बीच अंतर कर सकते हैं. SR95531 प्रतिपक्षी सभी GABA एक धाराओं को रोकता है. पकड़े वर्तमान में कमी न्यूरॉन में GABA सक्रिय वर्तमान टॉनिक के स्तर को इंगित करता है.
जैसा कि हम टॉनिक वर्तमान GABA सक्रिय है कि टुकड़ा में कोशिकी, परिवेश GABA पर निर्भर है में रुचि रखते हैं, हम आम तौर पर कोशिकाओं की सतह पर नहीं पैच करते बल्कि, टुकड़ा कोशिकाओं के भीतर. Agonists और गरम है कि हम का उपयोग करें GABA एक चैनल नहाने के समाधान में लागू कर रहे हैं मिलाना और टुकड़ा के भीतर कोशिकाओं तक पहुँचने . 3 मिलीग्राम / मिनट - प्रायोगिक कक्ष में समाधान के प्रवाह की दर 2.
6. रिकॉर्डिंग चैनल एकल धाराओं:
प्रयोगों सेल संलग्न, अंदर - बाहर या बाहर से बाहर पैच दबाना विन्यास में किया जाता है (कृपया यहाँ नीचे देखें) और हम एकल चैनल अणुओं के माध्यम से रिकॉर्ड धाराओं, एकल चैनल धाराओं. Axoclamp 200B, वि दबाना, 500 लाभ, फिल्टर 2 या 5 kHz पर सेटिंग्स. PClamp सॉफ्टवेयर के साथ हम विंदुक संभावित नियंत्रण, कम नहीं 100 से अधिक μs पर डेटा सेट नमूना दर और धाराओं रिकॉर्ड. आदेश में एकल चैनल रिकॉर्डिंग में शोर को कम करने के लिए स्नान समाधान की मात्रा कम रखा इतना है कि यह सिर्फ एक टुकड़ा शामिल किया गया.
- GABA सेल संलग्न विन्यास में सक्रिय चैनल. जब आप झिल्ली आप सेल संलग्न मोड में हैं पर एक GΩ मुहर प्राप्त है और आप चैनलों कि झिल्ली विंदुक द्वारा संलग्न पैच में हैं से रिकॉर्ड कर सकते हैं (चित्र देखें 1B.) जैसा कि GABA कोशिका झिल्ली को पार नहीं करता है, GABA विंदुक समाधान में डाल दिया है पैच में चैनलों को सक्रिय. Extrasynaptic GABA सक्रिय चैनल के कुछ ही मिनटों के लिए विलंबता के साथ सक्रिय हैं. विंदुक क्षमता यानी जब PClamp में आप पर संभावित सेट - पैच संभावित = 40 mV, यह depolarized 40 एम वी के रूप में झिल्ली से दर्ज की गई है.
सेल संलग्न मोड में रिकॉर्डिंग का लाभ यह है कि चैनल इसके मूल वातावरण में है और सामान्य intracellular प्रोटीन और कारकों के साथ संबंध में है. नुकसान यह है कि आप वास्तव में क्या आप संभावित रिकॉर्डिंग कर रहे हैं नहीं पता है के रूप में आप पूर्ण आराम झिल्ली और पैच भर में संभावित क्षमता नहीं पता है दोनों विंदुक क्षमता और सेल के आराम झिल्ली संभावित द्वारा निर्धारित किया जाता है. - GABA अंदर - बाहर विन्यास में सक्रिय चैनल. जब सेल संलग्न मोड में धीरे अपने विंदुक उठा और और टुकड़ा से दूर पक्ष यह micromanipulators के ठीक आंदोलनों का उपयोग करके कदम. अब आप एक पैच अंदर - बाहर और अंदर - बाहर मोड में रिकॉर्ड कर सकते हैं.
आप झिल्ली पैच है कि आपके विंदुक द्वारा संलग्न है (चित्र देखें 1B.) से रिकॉर्ड. आपके सेल संलग्न मोड में के रूप मेंविंदुक समाधान में GABA चैनल सक्रिय. लेकिन, दवाओं है कि बेंज़ोडायज़ेपींस, barbiturates, propofol आदि जैसे लिपिड bilayer पार नहाने के समाधान में लागू किया जा सकता है के रूप में वे विंदुक में पार करने में सक्षम हो जाएगा और चैनलों मिलाना. [14] पैच संभावित = पिपेट संभावित और के बाद से वहाँ कोई आराम झिल्ली सेल संलग्न मोड में के रूप में मढ़ा संभावित है, पैच - विंदुक संभावित जैसे बराबर क्षमता है अगर आप -40 एम वी PClamp में धारण क्षमता तो पैच सेट संभावित वास्तव में 40 mV है.
अंदर बाहर विन्यास का लाभ यह है कि एक आंतरिक झिल्ली सतह के लिए दवाओं या एंजाइमों लागू करते हैं और जांच कर सकते हैं अगर यह चैनल गुण को प्रभावित करता है. अंदर - बाहर पैच बनाने के बल इस पैच फट बंद विन्यास के गठन के संभावित जब बाहर - बाहर पैच का गठन किया है की तुलना में अधिक चैनल परिसर के लिए कोमल बनाने के चैनल की झिल्ली पर्यावरण पर लागू नहीं होता (कृपया नीचे देखें) . - GABA बाहर आउट विन्यास में सक्रिय चैनल. जब पूरे सेल मोड में धीरे से ऊपर उठा या वापस खींचना अपने micromanipulator के ठीक आंदोलनों का उपयोग विंदुक. एक ही समय में आपके कंप्यूटर पर खिड़की है कि पैच गुण प्रदर्शित करता है देखो. जैसा कि आप सेल से दूर विंदुक आकर्षित तुम समाई यात्रियों गायब देख सकते हैं और आप फिर से एक GΩ सील करेंगे. अब आप एक पैच बाहर - बाहर का गठन किया है और बाहर - बाहर मोड में रिकॉर्ड कर सकते हैं.
किसी तरह कोशिका झिल्ली विंदुक की नोक खोलने पर बंद है, झिल्ली के अंदर विंदुक आंतरिक और झिल्ली रिकॉर्डिंग कक्ष चेहरे (छवि 1B) के मूल बाहर चेहरे. GABA और अन्य दवाओं के लिए जांच की जा अब नहाने के समाधान में भंग कर रहे हैं. पैच संभावित = विंदुक क्षमता सिर्फ पूरे सेल मोड जैसे में तरह अगर आप 40 mV PClamp में धारण क्षमता सेट तो पैच संभावित बिल्कुल 40 mV है.
बाहर - बाहर मोड के लाभ है कि आप ठीक जानते हैं कि अपने झिल्ली क्षमता क्या है और के रूप में झिल्ली मूल बाहर चेहरे प्रायोगिक कक्ष, के लिए इस्तेमाल किया जा दवाओं नहाने के समाधान में भंग किया जा सकता है और आसानी से लागू किया और बंद चैनलों को धोया. नुकसान कर रहे हैं कि तुम अब चैनल intracellular और भी transmembrane प्रोटीन और कारक है कि पूर्ण चैनल के समारोह के लिए जरूरत हो सकती है है संलग्न हो सकता है के रूप में झिल्ली को सील अधिक था और कुछ अणुओं खो गया है या स्थानीय झिल्ली वातावरण में विकृत प्रक्रिया. लेकिन, एक साथ अलग पैच विन्यास आणविक स्तर है कि किसी अन्य विधि के साथ आज संभव नहीं है पर चैनल गुण के विच्छेदन की अनुमति.
7. परिणामों का विश्लेषण:
एकल चैनल और पूरे सेल धाराओं PClamp सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण कर रहे हैं. Synaptic घटनाओं हम (GA, संयुक्त राज्य अमरीका) Synaptosoft या AXOGraph (सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) का उपयोग करें के विश्लेषण के लिए.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्र 2A एकल चैनल दांतेदार गाइरस ग्रेन्युल न्यूरॉन में एक सेल संलग्न पैच में 20 एनएम GABA एकाग्रता से सक्रिय धाराओं से पता चलता है. चैनल अधिक से अधिक प्रवाहकत्त्व के सक्रियण के विलंबता 2 मिनट और 38 सेकंड और अधिक से अधिक प्रवाहकत्त्व 44 PS 15. पैच 40 एम वी द्वारा depolarized था. चित्र 2B पूरे सेल चूहे hippocampal न्यूरॉन्स identifiying टॉनिक और phasic धाराओं से वोल्टेज दबाना वर्तमान रिकॉर्ड के उदाहरण से पता चलता है. GABAA SR95531 प्रतिपक्षी रोकता दोनों extrasynaptic (टॉनिक) और synaptic उत्पन्न (phasic) GABA सक्रिय धाराओं. हम (बा) दांतेदार गाइरस न्यूरॉन और (बी बी) इंसुलिन CA1 पिरामिड आधारभूत वर्तमान में बदलाव extrasynaptic चैनलों (बा, ख) और अवरुद्ध SR95531 द्वारा प्रेरित द्वारा वर्तमान टॉनिक खुलासा न्यूरॉन का इलाज करने के लिए GABAA SR95531 प्रतिपक्षी (100 सुक्ष्ममापी) लागू synaptic धाराओं के लापता होने जब SR95531 ब्लॉक synaptic चैनल (बी बी). बेसल शर्त के तहत CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स टॉनिक GABA सक्रिय धाराओं 6 नहीं है, लेकिन जब न्यूरॉन्स इंसुलिन सांद्रता के शारीरिक 4 GABA सक्रिय टॉनिक धाराओं का विकास करने के लिए उजागर कर रहे हैं.
चित्रा 1A. चूहा hippocampal मस्तिष्क टुकड़ा, पहचान क्षेत्रों CA1 और CA3 पिरामिड सेल परतों और दांतेदार गाइरस ग्रेन्युल सेल परत (डीजी) बी योजनाबद्ध पैच दबाना विन्यास.
चित्रा 2A. एकल चैनल 20 एनएम एक चूहे hippocampal मस्तिष्क टुकड़ा में एक सेल दांतेदार गाइरस ग्रेन्युल सेल पर पैच संलग्न में GABA से सक्रिय धाराओं. होल्डिंग क्षमता depolarized 40 mV (विंदुक संभावित = -40 mV) था. सितारा (* 1 सेंट, वर्तमान ट्रेस) जहां धाराओं तेजी पैमाने समय (2 पर दिखाया से दिखाता हैवर्तमान एन डी) का पता लगाने बी. साबुत सेल ए दांतेदार गाइरस ग्रेन्युल और -60 एम वी का आयोजन क्षमता पर वोल्टेज दबाना मोड में ज. CA1 पिरामिड न्यूरॉन सेल में चूहे hippocampal मस्तिष्क टुकड़ा में दर्ज धाराओं से लिया गया था. CA1 प्रयोगों के लिए, स्लाइस 1 एनएम इंसुलिन में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए incubated पहले धाराओं दर्ज किए गए थे.
Discussion
पूरे सेल वर्तमान कक्ष में सक्रिय चैनलों द्वारा उत्पन्न धाराओं के कलाकारों की टुकड़ी का प्रतिनिधित्व करता है. विशिष्ट औषध और GABAA चैनलों की क्लोराइड पारगम्यता यह करने के लिए इन चैनलों के साथ जुड़े धाराओं की पहचान करने के लिए संभव बनाता है. synaptic चैनलों और extrasynaptic चैनलों की टॉनिक सक्रियण के सक्रियण के क्षणिक स्वभाव GABAA एक न्यूरॉन में व्यक्त चैनलों के इन दो आबादी के बीच आसानी से भेदभाव की अनुमति देता है. हालाँकि, केवल रिकॉर्डिंग के साथ एकल चैनल एक चैनल अणुओं की गतिज गुण है कि टॉनिक धाराओं उत्पन्न अध्ययन कर सकते हैं. Synaptic चैनलों कि 100 μs के भीतर सक्रिय के विपरीत, टॉनिक GABAA चैनल GABA 4,7,15,16,17,18 लागू किया जाता है समय से मिनट की सीमा में एक विलंबता के साथ सक्रिय हैं. कि कई चैनल गुण में चैनल परिणाम की इस देरी सक्रियण पूरे सेल रिकॉर्डिंग का उपयोग अध्ययन नहीं किया जा सकता है. एकल चैनल स्तर GABAA चैनलों के विभिन्न उप आबादी कार्यात्मक और औषधीय गुणों से अलग के आधार पर पहचाना जा सकता है है. इस प्रकार, अलग पैच दबाना विन्यास क्या प्रस्ताव है एक लाभ लेने के द्वारा, यह संभव है विस्तार में आणविक और GABA सक्रिय चैनलों कि न्यूरॉन्स में टॉनिक और synaptic धाराओं उत्पन्न समारोह औषध विज्ञान का अध्ययन.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम स्वीडिश अनुसंधान परिषद, अपसला विश्वविद्यालय और फ्रेड्रिक और इंग्रिड Thurings फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था. ZJ EXODIAB और Svenska Sällskapet के लिए Medicinsk Forskning से एक postdoctoral फैलोशिप आयोजित की. हम तकनीक की सहायता के लिए धन्यवाद फ्रैंक ली.
Materials
Several patch-clamp hardware and software systems are available and they all operate using the same basic principles. In our laboratory we use the Axoclamp amplifiers and the PClamp software (Molecular Devices, USA) to record and analyze our experiments. Another popular brand is HEKA amplifiers and software (HEKA Elektronik , Germany) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: e.g. Leica VT1200S (Germany) or Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; Water bath; Micromanipulators: custom made and Narishige micromanipulators (Japan); Puller: DMZ-universal (Germany) or Narishige PC-10 (Japan). Electrode glass: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK). |
References
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